羊耳菊水提物對(duì)肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠的抗炎效果及機(jī)制

李鳳玲

(平頂山市中醫(yī)醫(yī)院，平頂山，467000)

羊耳菊水提物對(duì)肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠的抗炎效果及機(jī)制

李鳳玲

(平頂山市中醫(yī)醫(yī)院，平頂山，467000)

目的：探討羊耳菊水提物對(duì)肺炎克雷伯菌所致重癥肺炎大鼠的抗炎效果及機(jī)制。方法：采用肺炎克雷伯菌誘導(dǎo)大鼠重癥肺炎模型，羊耳菊水提物(6,12和24 g/kg體重)灌胃治療，地塞米松(1.04 mg/kg體重)為陽(yáng)性對(duì)照，6 d后測(cè)定支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞以及肺組織TNF-α,IL-1β，IL-6水平及MPO的活性，Western-blot法檢測(cè)肺組織NF-κBp65、p-p38MAPK蛋白水平。結(jié)果：不同劑量羊耳水提物能改善動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)，減少白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的水平，降低肺組織TNF-α、IL-1β、IL-6、MPO水平及NF-κBp65、p-p38MAPK蛋白水平。結(jié)論：羊耳菊水提物能通過(guò)阻斷p38MAPK和NF-κBp65信號(hào)通路改善肺炎克雷伯菌所致大鼠重癥肺炎的炎性反應(yīng)，可成為一種天然有效的抗炎藥物。

肺炎；肺炎克雷伯菌；羊耳菊；核因子-κBp65；p-p38MAPK

羊耳菊Inulacappa(Buch.-Ham.)DC.為菊科旋覆花屬植物[1-2]，主要分布在我國(guó)四川、云南、貴州、廣西、廣東、江西、湖南等省份，全草用藥，含有豐富的黃酮類(lèi)和萜類(lèi)化合物，以及大量的咖啡?；鼘幩嵛镔|(zhì)[3-4]，具有較好的抗菌、消炎和鎮(zhèn)痛作用[5]，但具體機(jī)制還不太明確。本研究采用羊耳菊水提物治療肺炎克雷伯菌所致大鼠重癥肺炎，探討其抗炎效果及機(jī)制，為羊耳菊的開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠，體重(200±25)g，由河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002，分籠飼養(yǎng)，飼料充足飲水不限，室溫20～25 ℃，適應(yīng)環(huán)境5 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 羊耳菊全草采自懷化市康龍自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)漯河醫(yī)專(zhuān)第二附屬醫(yī)院主任藥師鑒定為菊科旋覆花屬植物，植物材料進(jìn)行挑選、洗凈在60 ℃溫度下烘干，粉碎過(guò)60目篩備用。肺炎克雷伯菌臨床株由漯河醫(yī)專(zhuān)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，分離于慢性支氣管炎急性發(fā)作患者的痰液。接種前生理鹽水稀釋至適當(dāng)濃度(相當(dāng)于1.2×10 CFU/mL)。

1.1.3 試劑與儀器 TNF-α,IL-1β，IL-6試劑盒(R&D，美國(guó))，MPO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物有限公司)，抗體NF-κBp65、p-p38MAPK、β-actin(美國(guó)Sigma公司)。血?dú)夥治鰞x(美國(guó)NOVA STPM3血?dú)夥治鰞x);T-1800血球分析儀(日本東亞公司)；EXL800型酶標(biāo)儀(BioTek，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 羊耳菊水提物的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥粉羊耳菊3 kg，按照固液1∶10的比例加入水浸泡24 h后，加熱回流提取2 h，提取2次，多層紗布趁熱過(guò)濾，上清液合并，并濃縮至含生藥3 g/mL,4 ℃冷藏保存，使用前稀釋成不同濃度。

1.2.2 給藥劑量 采用最大耐受劑量法，預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)，經(jīng)測(cè)得最大耐受量96 g/kg，用其1/4、1/8、1/16給藥。地塞米松：60 kg體重成人日用量l0 mg，每千克體重用量為10/60=0.166 7 mg/kg。大鼠用量為0.166 7×6.25=1.04 mg/kg。

1.2.3 分組與模型制備 60只SD大鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，即：正常組、模型組、地塞米松組(1.04 mg/kg)、羊耳菊水提物組(6、12、24 g/kg)，所有大鼠經(jīng)麻醉后，頸部消毒、備皮無(wú)菌操作，暴露大鼠上段氣管，正常組大鼠采用1 mL注射器經(jīng)氣管滴入生理鹽水0.3 mL，其余滴入菌液0.3 mL，接種后立即豎立大鼠固定臺(tái).使大鼠保持直立位約20 s，以保證接種菌液因重力作用而入肺。當(dāng)大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、呆滯、呼吸急促，并伴有嚴(yán)重的低氧血癥，SaO2<90%或動(dòng)脈氧分壓≤8 kPa確診為重癥肺炎[8]。對(duì)照組和模型組每天給予生理鹽水20 mL/kg灌胃1次，地塞米松組和羊耳菊水提物組按照20 mL/kg體重灌胃1次，連續(xù)6 d。

1.2.4 肺炎大鼠血?dú)夥治?全自動(dòng)血?dú)夥治鰞x檢測(cè)血液中的動(dòng)脈血二氧化碳分壓(PaCO2)、二氧化碳含量(CO2)、動(dòng)脈氧分壓(PaO2)、動(dòng)脈血氧飽和度(SaO2)。

1.2.5 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肺組織病理學(xué)變化 取大鼠左肺上葉，4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙拭干，10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織切片的病理變化。

1.2.6 支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞及中性粒細(xì)胞檢測(cè) 第6天給藥24 h后，戊巴比妥鈉50 mg/kg，ip麻醉。扎緊左主支氣管，輸液管套管插入主支氣管3～4 cm并固定，注入生理鹽水10 mL于肺腔，連續(xù)翻動(dòng)右肺組織，抽回再灌注3次，抽出灌洗液。共灌洗3次，收集總灌洗液，計(jì)數(shù)白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。

1.2.7 肺組織部分生化指標(biāo)的測(cè)定 取左肺下葉200 mg冰浴勻漿制成10%溶液，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液。酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定TNF-α,IL-1β，IL-6水平。按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定方法測(cè)定MPO活性。

1.2.8 Western-blot檢測(cè)肺組織NF-κBp65、p-p38MAPK蛋白水平 常規(guī)方法提取肺組織總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白的量。加樣行10%SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h，5%山羊血清(PBS稀釋)封閉，加入1∶500稀釋(1% BSA-PBS稀釋)的NF-κBp65、p-p38MAPK一抗，1∶500稀釋的β-actin，4 ℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶3 000)和β-actin二抗(1∶5 000)及DAB顯色試劑盒。行ECL反應(yīng)，顯色。Tannon凝膠成像系統(tǒng)拍照，GIS凝膠成像分析軟件分析，以同一泳道NF-κBp65、p-p38MAPK和β-actin條帶灰度值比反映蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 羊耳菊水提物對(duì)肺炎大鼠血?dú)庵笜?biāo)的影響 與正常組比較，模型組大鼠的PaCO2值明顯高于正常組(P<0.01)，而PaCO2濃度，PaO2值和SaO2的水平明顯低于正常組(P<0.01)。與模型組大鼠比較，羊耳菊水提物中高劑量組PaCO2水平明顯降低(P<0.05)，CO2、PaO2和SaO2水平明顯增加(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 肺組織病理學(xué)變化 正常組大鼠肺組織無(wú)異常發(fā)生，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)炎性反應(yīng)和浸潤(rùn)的發(fā)生。模型組肺泡壁加厚，并伴有大量的中性粒細(xì)胞，肺泡間質(zhì)出現(xiàn)水腫和肺泡壁間質(zhì)浸潤(rùn)。地塞米松組和羊耳菊水提物組浸潤(rùn)明顯減輕，部分出現(xiàn)少量的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及脫落壞死的上皮細(xì)胞。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠肺組織病理學(xué)變化(×200)

2.3 羊耳菊水提物對(duì)肺炎大鼠支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞及肺組織MPO活性的影響

表1 羊耳菊水提物對(duì)肺炎大鼠血?dú)夥治龅淖兓?/p>

注：與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

表2 羊耳菊水提物對(duì)肺炎大鼠各組外周血的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞變化

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01

表3 羊耳菊水提物對(duì)肺炎大鼠TNF-α,IL-1β和IL-6的影響蛋白,n=10)

注：與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01

與正常組比較，模型組大鼠支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞水平和肺組織中的MPO活性明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與模型組比較，地塞米松組和羊耳菊水提物不同劑量組的大鼠的支氣管肺泡灌洗液中的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞及肺組織中的MPO明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 羊耳菊水提物對(duì)肺炎大鼠肺組織TNF-α,IL-1β，IL-6的影響 與正常組比較，模型組大鼠中肺組織的TNF-α,IL-1β，IL-6水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，地塞米松和羊耳菊水提物中高劑量組大鼠肺組織的TNF-α,IL-1β，IL-6水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.5 羊耳菊水提物對(duì)肺炎大鼠肺組織NF-κBp65、p-p38MAPK蛋白水平的影響 與正常組比較，模型組織NF-κBp65、p-p38MAPK蛋白水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，地塞米松組和羊耳菊水提物不同劑量組均能明顯降低NF-κBp65、p-p38MAPK蛋白水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2、表4。

圖2 羊耳菊水提物對(duì)肺炎大鼠肺組織NF-κBp65、p-p38MAPK蛋白水平的影響

組別NF-κBp65p-p38MAPK正常組0.58±0.120.55±0.07模型組1.13±0.14**0.97±0.12**地塞米松組(1.04mg/kg)0.63±0.06△△0.61±0.09△△羊耳菊水提物(6g/kg)0.91±0.03△0.85±0.05△羊耳菊水提物(12g/kg)0.82±0.05△△0.74±0.05△羊耳菊水提物(24g/kg)0.71±0.08△△0.65±0.07△△

注：與正常組比較，**P<0.01;與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01

3 討論

重癥肺炎是呼吸科臨床常見(jiàn)的疾病，已經(jīng)嚴(yán)重威脅人類(lèi)的健康，每年大發(fā)病率達(dá)到1.2%，正確的制備肺炎模型對(duì)該病的發(fā)病機(jī)制和臨床研究有重要意義。本研究采用從肺炎患者的唾液中分離得到的肺炎克雷伯菌臨床株經(jīng)培養(yǎng)后建立大鼠急性重癥肺炎模型，大鼠的臨床表現(xiàn)與重癥肺炎患者在呼吸系統(tǒng)的臨床表現(xiàn)相符[6]。血?dú)夥治鲋心承┮蜃铀酵ǔＷ鳛榉窝壮潭鹊脑u(píng)價(jià)體系最重要的因素，SaO2<90%或動(dòng)脈氧分壓<8 kPa基本可以確定為重癥肺炎[7]，本實(shí)驗(yàn)制備大鼠肺炎不經(jīng)過(guò)任何治療6 d后發(fā)現(xiàn)大鼠的SaO2僅有(58.48±7.87)%，而PaO2僅有(4.75±0.75)kPa，說(shuō)明肺炎克雷伯菌誘導(dǎo)大鼠肺炎完全有可能惡化為重癥肺炎，而且術(shù)后處死的模型組大鼠白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及肺組織中的MPO活性明顯增加較為明顯，通過(guò)病理組織學(xué)觀察顯示，模型組肺泡壁加厚，并伴有大量的中性粒細(xì)胞，肺泡間質(zhì)出現(xiàn)水腫和肺泡壁間質(zhì)浸潤(rùn)。我們認(rèn)為達(dá)到預(yù)定診斷標(biāo)準(zhǔn)的大鼠發(fā)病癥狀與臨床上重癥肺炎患者的發(fā)病情況比較類(lèi)似，可以認(rèn)為該方法成功建立了重癥肺炎大鼠模型。

TNF-α作為一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，在各種疾病的發(fā)展中有著重要的特殊地位[8]，主要由激活的單核-巨噬細(xì)胞分泌，參與炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答，一定量的TNF-α對(duì)機(jī)體具有抗感染和增強(qiáng)免疫力等作用，但大量的TNF-α持續(xù)釋放會(huì)誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞局部侵潤(rùn)，引起局部炎性反應(yīng)，使機(jī)體器官甚至多系統(tǒng)受損，TNF-α作為早期啟動(dòng)炎性反應(yīng)遞質(zhì)連鎖反應(yīng)的因子，可激活其他體內(nèi)炎性反應(yīng)因子IL-1β，IL-6等的釋放。TNF-α，IL-1β和IL-6等大量炎性反應(yīng)因子的大量釋放還誘導(dǎo)T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞核單核細(xì)胞等使其功能活性增強(qiáng)，加強(qiáng)感染癥狀，使得外周血液中的白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的大量產(chǎn)生。通過(guò)羊耳菊水提物治療發(fā)現(xiàn)，不同劑量羊耳菊水提物能有效抑制TNF-α，IL-1β和IL-6的釋放和組織白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的大量產(chǎn)生，并且促使炎性反應(yīng)減退從而達(dá)到治療肺炎的效果，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性[9-12]。而且本研究中利用羊耳菊水提物不同劑量治療6 d后，發(fā)現(xiàn)羊耳菊水提物能明顯改善血流動(dòng)力學(xué)和血?dú)夥治鲋械囊蜃铀?，這也進(jìn)一步說(shuō)明羊耳菊水提物治療急性肺損傷效果明顯。

研究顯示，炎性反應(yīng)遞質(zhì)的表達(dá)和MAPKs與NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑密切相關(guān)。NF-κB為一種能與基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子特異性結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的一組轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，多數(shù)為p50和p65組成的同源或異源二聚體，調(diào)控細(xì)胞的炎性反應(yīng)因子基因的表達(dá)，其活性受到IKB的抑制。而MAPKs信號(hào)通路的ERK、JNK和p38MAPK等家族成員均可調(diào)控炎性反應(yīng)水平，通過(guò)作用于各自不同的底物，調(diào)控TNF-α，IL-1β和IL-6等細(xì)胞因子的表達(dá)。研究顯示，MAPKs與NF-κB信號(hào)通路中家族成員異常表達(dá)與基因表達(dá)層面發(fā)生變異存在一定的聯(lián)系，而炎性反應(yīng)因子的旁分泌同樣是其誘發(fā)的因素之一[13]。研究表明，通過(guò)誘導(dǎo)炎性反應(yīng)因子自分泌可激活MAPKs與NF-κB信號(hào)通路中家族成員的表達(dá)，而MAPKs與NF-κB信號(hào)通路中家族成員的激活反過(guò)來(lái)更刺激了炎性反應(yīng)因子的產(chǎn)生及分泌，形成了一條MAPKs與NF-κB信號(hào)正反饋持續(xù)激活的環(huán)路[14]。因此，MAPKs與NF-κB信號(hào)通路的阻斷能有效的緩解急性肺損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，羊耳菊水提物能有效的降低NF-κBp65、p-p38MAPK蛋白水平，并呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。MAPKs信號(hào)通路中，p38MAPK水平與NF-κB的激活關(guān)系非常密切，其中p38MAPK的表達(dá)水平下降，NF-κB的活性也會(huì)受到一定程度的影響。因此，MAPKs與NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)途徑都是急性肺損傷中抗炎的重要環(huán)節(jié)，為阻斷炎性反應(yīng)的重要靶點(diǎn)。

總之，羊耳菊水提物對(duì)肺炎克雷伯菌所致大鼠重癥肺炎抗炎效果明顯，能有效的改善肺功能。其中p38MAPK和NF-κBp65信號(hào)通路是羊耳菊水提物抗炎作用的主要靶點(diǎn)，可以為羊耳菊的開(kāi)發(fā)提供新的研究路徑。

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Anti-inflammatoryEffectofInulaCappaAqueousExtractonKlebsiellaPneumoniae-inducedSeverePneumoniainRats

Li Fengling

(ChineseMedicineHospital，Pingdingshan467000，China)

Objective:To observe anti-inflammatory effect of Inula cappa aqueous extract on Klebsiella pneumoniae-induced severe pneumonia in rats.MethodsKlebsiella pneumoniae was used to induce ultrasonic severe pneumonia model in rats.Different doses of Inula Cappa aqueous extract (6,12 and 24 g/kg BW) were orally given,and take dexamethasone (1.04 mg/kg weight) as the comparison drug to conduct blood gas analysis,including peripheral white blood cells,neutrophils,TNF-alpha,IL-1 beta,IL-6,LDH and MPO activity in lung tissue.ResultsDifferent doses of Inula Cappa aqueous extract can improve the arterial blood gas index,reduce the content of white blood cells and neutrophils,decrease the content of TNF-α,IL-1β,IL-6,MPO and level of NF-KBp65 and p-p38MAPK.ConclusionInula Cappa aqueous extract can improve inflammation of severe pneumonia induced by Klebsiella pneumoniae by blocking p38 MAPK and NF-KBp65 signaling pathways.It can be taken as a natural and effective anti-inflammatory drug.

Inula Cappa; Klebsiella; Pneumonia; Extract; NF-KBp65; p-p38MAPK

李鳳玲(1969.08—)，女，本科，副主任中藥師，研究方向：中藥藥理，E-mail：314692241@qq.com

R284;R256.4

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.10.041

(2016-11-23收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄)