重組aFGF大腸桿菌發(fā)酵條件的初步優(yōu)化

吳 偉,張思遠(yuǎn),徐一芩,張錦濤

(湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003)

重組aFGF大腸桿菌發(fā)酵條件的初步優(yōu)化

吳 偉,張思遠(yuǎn),徐一芩,張錦濤

(湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，湖北 黃石 435003)

為優(yōu)化能穩(wěn)定表達(dá)人酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)的重組大腸桿菌的發(fā)酵條件，采用分批發(fā)酵方式，在菌體對數(shù)生長期通過添加IPTG誘導(dǎo)目的蛋白高效表達(dá)，確定aFGF工程菌較優(yōu)發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度為37 ℃、培養(yǎng)基pH值為7.4、搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。

酸性成纖維細(xì)胞生長因子；發(fā)酵；誘導(dǎo)；表達(dá)量

0 引言

aFGF是成纖維細(xì)胞生長因子家族(FGFs)的基本成員之一，最早由Thomas于1984年從牛腦中分離純化得到，與FGFs的其他22個因子的蛋白序列有30%～70%的同源性[1-2]。全長度的aFGF由154個氨基酸殘基組成，是一種介導(dǎo)細(xì)胞間信號傳遞的多肽類物質(zhì)。aFGF是一種廣譜促分裂原，對源自中胚層及神經(jīng)外胚層的細(xì)胞具有明顯的促分裂和增殖作用[3-4]。aFGF主要分布于腦、視網(wǎng)膜、垂體、神經(jīng)組織、心臟、腎上腺和骨等組織器官中，血清和體液中含量則極少。此外，aFGF的穩(wěn)定性差，對溫度、pH及金屬離子敏感，極易失活。研究表明，aFGF的生物學(xué)效應(yīng)可分為促有絲分裂效應(yīng)和非促有絲分裂效應(yīng)，可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、骨骼修復(fù)、潰瘍愈合、眼晶狀體再生、神經(jīng)組織修復(fù)、神經(jīng)突起生長以及胚胎發(fā)育與分化等，有著非常廣闊的應(yīng)用前景[5-8]。

由于aFGF是人體內(nèi)源性的微量活性物質(zhì)，難于在體液或組織液中提取，因此，采用重組DNA技術(shù)構(gòu)建重組aFGF基因工程菌，實(shí)現(xiàn)aFGF的體外表達(dá)并獲得相應(yīng)的產(chǎn)品是研究aFGF的生物學(xué)功能和應(yīng)用的重要途徑。但在其實(shí)際生產(chǎn)過程中常會出現(xiàn)表達(dá)水平低且不穩(wěn)定的現(xiàn)象。除質(zhì)粒不穩(wěn)定外，不同的培養(yǎng)、誘導(dǎo)條件下，工程菌的表達(dá)效率也有一定差異。因此，實(shí)現(xiàn)aFGF產(chǎn)量化、工業(yè)化是其能夠得到廣泛應(yīng)用的前提和保障。本研究在實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建好的基因工程菌的基礎(chǔ)上，進(jìn)行初步的發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化，期望得到能穩(wěn)定表達(dá)的工程菌株和最優(yōu)的發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

人酸性成纖維細(xì)胞生長因子(aFGF)的重組大腸桿菌由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；LB培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)、氨芐青霉素均購自北京華美公司；超凈工作臺，蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；恒溫?fù)u床，金壇市瑞華儀器有限公司；紫外可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公司。

1.2菌種活化

將100 μL甘油保存的菌種轉(zhuǎn)種至30 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h。取少量菌液，于氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)(100 μg/mL)平板劃線培養(yǎng)12 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3抗生素抗性實(shí)驗(yàn)

用接種環(huán)蘸取活化的菌液少量，分別在含有終濃度為0 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL Amp的平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)10～12 h，根據(jù)平板所生菌落檢測重組子，同時初步確定工程菌對Amp的敏感濃度。

1.4 SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白

1)取保種菌液活化，按2%的接種量，接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)。

2)待菌液OD600至0.4～0.6，加入IPTG(終濃度為0.5 mmol/L)，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h。

3)取菌液1 mL，8 000 r/min離心5 min，收集菌體;再用磷酸鹽緩沖液(pH7.4)重懸菌體，8 000 r/min離心5 min收集菌體。

4)加裂解液破碎細(xì)胞，再將裂解液100 ℃煮沸5 min，立即冰浴3～5 min，4 ℃，12 000 r/min離心2 min，收集上清至EP管。待電泳檢測用。

1.5發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

取保種菌液活化，按2%接種量，接種到6管5 mL LB液體培養(yǎng)基(Amp，100 μg/mL)中，各取2管分別在30 ℃、37 ℃、42 ℃下培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。培養(yǎng)2～3 h至A600為0.4～0.6，加入IPTG(終濃度為0.5 mmol/L)誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h，測菌體干重和目的蛋白的表達(dá)。

1.5.2培養(yǎng)基初始pH的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)步驟參照1.5.1，其中pH梯度設(shè)置為6.0,7.4,8.0。

1.5.3搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)步驟參照1.5.1，其中搖床轉(zhuǎn)速梯度設(shè)置為180 r/min、200 r/min、220 r/min、240 r/min。

2 結(jié)果

2.1青霉素抗性實(shí)驗(yàn)

將活化后的菌株分別在終濃度為0 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL Amp的平板上劃線，平板編號依次為1,2,3,4,5,6,37 ℃培養(yǎng)10～12 h。工程菌抗生素抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，在6種不同的抗生素濃度下，aFGF工程菌都能生長，說明工程菌對青霉素耐受力良好，即重組質(zhì)粒載入宿主細(xì)胞后表達(dá)正常。

圖1 工程菌抗生素抗性實(shí)驗(yàn)

2.2重組蛋白檢測

收獲完成誘導(dǎo)表達(dá)的基因工程菌，細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白結(jié)果如圖2所示。對比空白樣，參照Marker，由圖2可觀察到泳道1和4 有大小為18.5 kb目的蛋白條帶，而2,3涌道內(nèi)對應(yīng)條帶不明顯。結(jié)果顯示aFGF工程菌成功表達(dá)了目的蛋白，工程菌可用于后續(xù)的研究。

M：Marker;泳道1和4：誘導(dǎo)后菌體總蛋白;泳道2和3：空白樣。

2.3工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1培養(yǎng)溫度的影響

不同培養(yǎng)溫度下目的蛋白表達(dá)量及菌體干重見表1。基因工程菌在30 ℃發(fā)酵培養(yǎng)時，目的蛋白的表達(dá)量最高，但菌體干重最??；而在42 ℃培養(yǎng)時，目的蛋白的表達(dá)量較低，但收獲的細(xì)胞較多。綜合表達(dá)量和菌體干重的變化情況，選擇37 ℃作為最佳培養(yǎng)溫度。

表1 不同培養(yǎng)溫度下目的蛋白表達(dá)量及菌體干重

2.3.2培養(yǎng)基初始pH值的影響

不同培養(yǎng)基初始pH值下目的蛋白表達(dá)量及菌體干重見表2。隨著培養(yǎng)基初始pH值的變化，菌體干重和目的蛋白表達(dá)量的變化均不大，說明pH值在接近中性的區(qū)間內(nèi)，菌體生長和目的蛋白的表達(dá)量受其影響不大。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取pH7.4作為最優(yōu)的發(fā)酵pH值。

表2 不同培養(yǎng)基初始pH值下目的蛋白表達(dá)量及菌體干重

2.3.3搖床轉(zhuǎn)速的影響

不同搖床轉(zhuǎn)速下目的蛋白表達(dá)量及菌體干重見表3。就目的蛋白表達(dá)量而言，搖床轉(zhuǎn)速對其影響不是很明顯，表達(dá)水平維持在一個較為接近的水平；而當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速高于200 r/min時，菌體干重相差不大，但明顯高于180 r/min時的菌體質(zhì)量。綜合考慮實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇200 r/min為最適搖床轉(zhuǎn)速。

表3 不同搖床轉(zhuǎn)速下目的蛋白表達(dá)量及菌體干重

3 討論及結(jié)論

近年來，科研工作者在重視上游基因工程菌的構(gòu)建和下游分離純化工藝研究的同時，重組菌的發(fā)酵工藝的優(yōu)化也越來越被重視。優(yōu)化發(fā)酵工藝的目的是希望盡可能獲得大量的外源基因產(chǎn)物，減少宿主細(xì)胞自身蛋白對下游工藝的影響。外源基因的高水平表達(dá)不僅僅取決于宿主細(xì)胞、載體和目的基因三者之間的相互關(guān)系，而且與其所處環(huán)境條件密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)已基本確定較為優(yōu)化的發(fā)酵工藝：培養(yǎng)溫度為37 ℃、培養(yǎng)基pH值為7.4、搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。但該工程菌誘導(dǎo)條件仍然可以進(jìn)一步優(yōu)化，這是后續(xù)研究課題。

[1] 紀(jì)孝偉,王興臣,吳春玲.成纖維細(xì)胞生長因子的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述,2014,20(3):411-413.

[2] 劉春英,黃巨恩,吳世芬,等.酸性成纖維細(xì)胞生長因子對慶大霉素誘導(dǎo)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞MDA、NO、SOD、GSH-Px的影響[J].廣東醫(yī)學(xué),2016,29(2):4-6.

[3] 吳艷青,肖健,李校堃.成纖維細(xì)胞生長因子的轉(zhuǎn)化研究及藥物研發(fā)進(jìn)展[J].生物產(chǎn)業(yè)技術(shù),2016(6):21-24.

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[5] 夏慶友,王峰,徐漢福,等.適于家蠶絲腺表達(dá)的改造人酸性成纖維細(xì)胞生長因子基因及其表達(dá)系統(tǒng)和應(yīng)用:中國，CN201410177732.8[P].2016.3.30.

[6] 唐樹堯.堿性成纖維細(xì)胞生長因子和微血管密度在大腸癌中的表達(dá)及意義[D].哈爾濱：哈爾濱醫(yī)科大學(xué),2005.

[7] 劉士君,李建華.堿性成纖維細(xì)胞生長因子和血管內(nèi)皮生長因子在結(jié)腸癌表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報,2012,9(14):50-51.

[8] 謝深科,舒千玉.堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、P53和nm23表達(dá)與乳腺癌及增生性病變的浸潤與轉(zhuǎn)移相關(guān)性分析[J].中國實(shí)用醫(yī)刊,2011,38(16):63-64.

Preliminary Optimization of Conditions for Fermentation of Recombinant Escherichia Coli with aFGF Gene

WuWei,ZhangSiyuan,XuYiqin,ZhangJintao

(School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Objective:to optimize the condition for fermentation of an engineering E.coli strain which expressed human acidic fibroblast growth factor (aFGF).Methods:the engineering E.coli strain with human aFGF gene was grown by batch fermentation,adding IPTG during the logarithmic growth phase supported a high expression of target protein.Results:the optimal condition was confirmed,which was incubation at 37 ℃,200 rpm and pH 7.4 of culture medium.Conclusion:the condition for fermentation of engineering E.coli strain with human aFGF gene was preliminarily optimized.

acidic fibroblast growth factor;fermentation;induction;expression level

2017-05-25

湖北理工學(xué)院校級科研重點(diǎn)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號17xjz07A)。

吳偉，副教授，博士，研究方向：生物技術(shù)制藥。

10.3969/j.issn.2095-4565.2017.05.011

Q939.9

A

2095-4565(2017)05-0051-04

(責(zé)任編輯吳鴻霞)