家兔大型艾美爾球蟲四川株的致病性和免疫原性研究

王 敏，石團(tuán)員，李 銳，郝力力*

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)系，四川 成都 610041；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

家兔大型艾美爾球蟲四川株的致病性和免疫原性研究

王 敏1，石團(tuán)員2，李 銳3，郝力力1*

(1.西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)系，四川 成都 610041；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江 杭州 310021)

【目的】為調(diào)查兔大型艾美爾球蟲四川株的致病性和免疫原性?！痉椒ā勘狙芯坷脤?shí)驗(yàn)室分離到的大型艾美爾球蟲四川株進(jìn)行了動物感染試驗(yàn)?！窘Y(jié)果】5×103和5×104個卵囊組的SPF兔在接種后第4～9天，出現(xiàn)輕微的食欲減少癥狀；5×105組在接種后第6～8天持續(xù)中度腹瀉，第8天體重與對照組有明顯差異(P≤0.05)，但均無死亡現(xiàn)象。感染劑量為5×103時卵囊產(chǎn)量最多，為2.31×108；免疫原性實(shí)驗(yàn)中，7×105個卵囊攻毒后，5×103卵囊免疫組卵囊排出最少，為6.28×104，各組體重與對照組相比無明顯差異。【結(jié)論】大型艾美爾球蟲四川株致病性較弱，但免疫原性良好，可作為兔球蟲疫苗的備選組分。

兔；大型艾美爾球蟲；致病性；免疫原性

【研究意義】我國是家兔生產(chǎn)和貿(mào)易大國。2008年，我國家兔全年屠宰量為4.88 億只，兔肉產(chǎn)量66.0萬噸，在世界上占比各為43.8 %、42.1 %，兩項(xiàng)指標(biāo)都是世界第一。除此之外，我國兔毛產(chǎn)量與貿(mào)易量均居世界首位[1]。兔球蟲病是艾美爾屬的球蟲寄生在兔腸道或肝臟而導(dǎo)致的一種原蟲病，對兔養(yǎng)殖業(yè)危害巨大[2]。盡管化學(xué)藥物是目前控制兔球蟲病的常用手段，但隨著耐藥蟲株的不斷出現(xiàn)和化學(xué)藥物殘留問題的日益凸現(xiàn)，越來越多的學(xué)者尋求用免疫學(xué)方法來防控該病[3]，使得活疫苗接種在不久的將來成為控制球蟲病的主要措施。【前人研究進(jìn)展】浙江、山東和江蘇等省份均是養(yǎng)兔大省，近年來四川省養(yǎng)兔產(chǎn)業(yè)也有長足發(fā)展，兔球蟲病在四川省各地兔場都能檢測到，其中尤其以Eimeriamagna較為常見，形態(tài)上也最易與其它兔艾美耳球蟲相區(qū)別?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)在對大型艾美爾球蟲成功分離培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對其致病性和免疫原性展開了研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以確定能否作為疫苗候選蟲株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

主要儀器設(shè)備和試劑：臺式高速離心機(jī)(eppendorf 5402型)、Bio-Rad伯樂梯度PCR儀(PTC240型)、2×EasyTaqPCR SuperMix(北京全式金公司)、顯微鏡(Nikon E200，Japan)、SPF飼養(yǎng)籠(SS3型)、100 和200目不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩、全血DNA小量試劑盒(天根)飽和食鹽水、瓊脂、麥克馬斯特計(jì)數(shù)板和2.5 %重鉻酸鉀溶液(自制)。實(shí)驗(yàn)動物：母新西蘭種兔購買于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，配種新西蘭公兔由四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。E.magna卵囊：含有E.magna卵囊的糞便樣本采集于成都旭平兔場。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無球蟲SPF兔的培育 配種15只母新西蘭種兔，配種后15 d后，檢查配種情況。所用不銹鋼飼養(yǎng)籠用酒精火焰噴燈噴燒消毒，整個動物房用濃度為28 %的氨水熏蒸48 h。飼料烘烤處理，現(xiàn)用現(xiàn)處理。飲水中按每kg兔體重加入100 μl球蟲凈，稀釋2000倍使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。停藥1 w后，再用糞便直接涂片法檢查球蟲卵囊，連查3 d，檢查待產(chǎn)母兔有無卵囊排出。仔兔18日齡時斷奶，飼喂仔兔顆粒料，并定期補(bǔ)喂嬰幼兒奶粉至28日齡。每天取仔兔糞便鏡檢，連續(xù)10 d未檢出兔球蟲者，即定義為無球蟲兔。整個飼養(yǎng)過程中所用的飼料和飲水經(jīng)無球蟲化處理，動物房嚴(yán)格隔離和人員進(jìn)出，防止外界球蟲傳入。

1.2.2E.magna單卵囊分離和純株擴(kuò)增 在顯微鏡下對卵囊進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，用移液器將含有大型艾美耳球蟲的液滴移到另一塊載玻片上，繼續(xù)觀察大型艾美耳球蟲是否存在，如有其他蟲種，用生理鹽水稀釋，同樣用移液器分成數(shù)滴，直到一滴生理鹽水中只含一個大型艾美耳球蟲卵囊時，用移液器移到瓊脂塊上，在低倍鏡下觀察，當(dāng)確定瓊脂塊內(nèi)只有一個孢子化的大型艾美耳球蟲卵囊時，把此塊瓊脂裝入膠囊。用消毒過的開口器將接種兔的嘴打開，用滅菌鑷子夾住膠囊送入口中，灌服少量蒸餾水，確定其咽下，則接種完成。

1.2.3 樣品OPG 及每天排卵囊量的計(jì)算 每天收取糞便稱重，同時稱取2 g糞便，采用麥克馬斯特法計(jì)算每克糞便中的蟲卵數(shù)(OPG)，用OPG乘以糞重即為每天排出的卵囊數(shù)。

1.2.4 大型艾美爾球蟲18S rRNA 序列的PCR擴(kuò)增、進(jìn)化樹分析 根據(jù)報道的大型艾美爾球蟲18S rRNA基因序列，設(shè)計(jì)上游引物5'-GAAACTGCGAATGG CTCATT-3'；下游引物5'-CTTGCGCCTACTAGGCATTC-3'，PCR產(chǎn)物克隆后送華大測序。核苷酸序列應(yīng)用Clustal X 1.81進(jìn)行比對，分子進(jìn)化樹用MEGA 7構(gòu)建。

1.2.5 致病性實(shí)驗(yàn) 30日齡試驗(yàn)兔共20只，分為A1～A5共5組，每組4只，每籠2只，A2～A5分別按5×102、5×103、5×104和5×105個/只經(jīng)口感染E.magna孢子化卵囊，A1組設(shè)為不感染對照組。分別感染后第2、4、6、8、10、12、14和16天對各組兔稱量體重；每天觀察并記錄各組兔的精神、食欲和排糞便情況，并分別收集感染后第7～15天的兔糞便，用McMaster′s計(jì)數(shù)法計(jì)算OPG，結(jié)合排糞量，計(jì)算出每組兔的排卵囊總量。綜合臨床癥狀、體重和排卵囊量3項(xiàng)指標(biāo)對E.magna的致病性作出判斷。

1.2.6 免疫原性實(shí)驗(yàn) 34日齡試驗(yàn)兔共20只，分為B1～B5共5組，每組4只，每籠2只，B1組不免疫不攻毒，B2組不免疫攻毒，B3～B5組免疫劑量分別為5×101, 5×102和 5×103個/只。于免疫后15 d進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為7×105。分別于攻毒后第2、4、6、8、10、12天對各組兔稱量體重,計(jì)算每2日增重；每天觀察并記錄各組兔的精神、食欲和排糞便情況，并收集感染后第7～13天的糞便，用McMaster′s計(jì)數(shù)法計(jì)算OPG，結(jié)合排糞量，計(jì)算出每組兔的排卵囊總量并記錄臨床癥狀。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0(Tukey test)對各組兔體重進(jìn)行分析，當(dāng)組間P≤0.05時，即認(rèn)為組間存在顯著差異，并利用SPSS16.0對分析結(jié)果進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大型艾美爾球蟲成都株的生物學(xué)特性

單卵囊擴(kuò)增后的第3代E.magna接種實(shí)驗(yàn)兔后，接種后第7天后開始排卵囊，潛伏期是7 d，排卵囊量高峰期是感染后的第9天，持續(xù)到16 d排卵結(jié)束。如圖1所示，E.magna卵囊較大，呈卵圓形，卵壁為黃色或褐色。卵膜孔十分明顯，呈堤狀分布于卵囊壁之外，有斯氏體和孢子囊余體。卵囊的大小為24.6～39.8 μm×16.4～27.9 μm，平均為33.6 μm×22.5 μm，形態(tài)指數(shù)為1.49。在恒溫28 ℃下，完成孢子化發(fā)育的最早時間為28 h，大部分是在48 h。

2.2 18s rRNA PCR檢測

從大型艾美爾球蟲基因組 DNA中成功擴(kuò)增出18s rRNA目的條帶，片段大小約在1500 bp ,見圖2A。應(yīng)用Mega 6軟件對克隆出的18S rRNA的E.magna基因序列與其他11種兔球蟲18S rRNA的序列進(jìn)行同源性分析，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖2B可見，E.magnaSC和E.magnaCzech為同一分支，兩者親緣關(guān)系最近。

圖1 孢子化的第3代大型艾美爾球蟲卵囊Fig.1 Sporulated oocyst of third selection of Eimeria magna

M：DL2000 marker；1：陰性對照；2：DNA樣本； M: DL2000 marker; 1: Negative control; 2: DNA sample;A：E. magna 18S rRNA基因PCR反應(yīng)后電泳圖；B：E. magna 四川株在基于18S rRNA 基因構(gòu)建的兔球蟲進(jìn)化樹上的分布A:The PCR products of E. magna 18S rRNA; B: Distribution of E. magna SC in the phylogenetic tree of rabbit coccidia based on the 18S rRNA 圖2 18S rRNA PCR檢測和進(jìn)化樹分析 Fig.2 Detection of 18S rRNA by PCR and phylogenetic tree of the 18S rRNA gene

星號表示和對照組相比差異顯著(P≤0.05)Asterisks, statistically significant difference between infected and control animals (P≤0.05)圖3 不同劑量卵囊感染后每組兔平均體重Fig.3 Mean body weight per rabbit for A1-A5 groups after the infection with different doses of E. magna oocysts

2.3 大型艾美耳球蟲的致病性

A3和A4組在感染后4～9 d有輕微的食欲減退現(xiàn)象，A5組在感染后第6天出現(xiàn)便秘、腹瀉和食欲減退，其中2只兔子出現(xiàn)中度腹瀉，持續(xù)3 d(6～8 d)，所有組均無死亡現(xiàn)象。所有組體重均持續(xù)增長，只有A5組在感染后第8天和對照組相比，體重差異顯著(P≤0.05)，如圖3所示。各組在感染期間總的卵囊產(chǎn)量如表1所示。

2.4 大型艾美耳球蟲的免疫原性

B3組在攻毒后4～9 d有輕微的食欲減退現(xiàn)象，B2組中度腹瀉持續(xù)了4 d(攻毒后6～9 d)。如圖4所示，和B1組相比，其余組每隔2 d的體增重?zé)o顯著差異。攻毒后7～13 d內(nèi)各組卵囊產(chǎn)量如表2所示，B3和B4組產(chǎn)生了部分保護(hù)力， B5組則保護(hù)力最好，糞便中未檢出卵囊。

表1感染不同劑量后7～16d每組排出的卵囊總量

Table 1 Total oocyst output 7-16 days after infection with different doses ofE.magnaoocysts

組別Group 日齡(d)Age感染劑量(個)Inoculationdoses排出卵囊(個)OocystoutputA1300ndA2305×1021.22×108A3305×1032.31×108A4305×1047.19×107A5305×1057.48×107

注：nd：未檢出。

圖4 7×105個卵囊攻毒后每組組日增重Fig.4 Daily weight gain after challenge inoculation with 7×105 oocysts of E. magna

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中成功分離到大型艾美爾球蟲四川株，PCR得到的18s rRNA序列為1528 bp，經(jīng)NCBI blast比對后，與捷克株和法國株同源性最高，均為99 %，但捷克株與其序列覆蓋度最高，為100 %；其次為法國株，覆蓋度為94 %，進(jìn)化樹上和捷克株為同一分支，說明兩者親緣關(guān)系最近。構(gòu)建進(jìn)化樹的意義在于建立分類系統(tǒng)和確定親緣關(guān)系[4]，但只根據(jù)其18S r RNA也很難鑒別兔球蟲種類。如梨形艾美耳球蟲和黃艾美耳球蟲 2 個種，18S rRNA同源性達(dá)99.6%，具有幾乎一致的序列，但不能由此確定它們是一個種, 應(yīng)該和傳統(tǒng)分類方法(卵囊形態(tài)、生活史、致病性等生物學(xué)特征)相結(jié)合方能確定。

兔球蟲中不同種具有不同的致病力，如E.perforans只有2代裂殖生殖，致病力較弱[5]，而E.magna具有4代裂殖生殖，致病力強(qiáng)或者中等，不同的E.magna地理株具有不同的毒力。如Licois D等[6]分別用2.5×103，1×104和 4×104劑量感染42日齡新西蘭大白兔， 1×104和4×1042 個劑量組在感染后7 d 出現(xiàn)增重遲緩現(xiàn)象，和空白對照組相比，差異極顯著(P≤0.01)，但均無死亡現(xiàn)象。林昆華等[7]用分離到的E.magna蟲株感染35日齡新西蘭大白兔，1×105和1×106劑量組出現(xiàn)厭食、體重下降、腹瀉,甚至有血便等臨床癥狀，感染后4～8 d體重下降很明顯, 并有死亡現(xiàn)象，死亡率分別為12.5 % and 25 %。本實(shí)驗(yàn)中，只有5×105劑量組感染后第8天和空白對照組相比，差異顯著(P≤0.05)，其余均差異不明顯。E.magna四川株感染劑量為5×103時排出的卵囊最多，為2.31×108；Licois D等[6]感染劑量為81個卵囊時，排出卵囊即可達(dá)1.7×108。相比之下，四川株致病力弱，產(chǎn)卵囊量少，在感染后第7天可在糞便中檢測到卵囊，第9天為排卵高峰，與Licois D報道一致。

表2 攻毒后不同免疫劑量組7～16 d每組排出的卵囊總量

注：nd：未檢出。

本實(shí)驗(yàn)中，7×105個卵囊攻毒后，免疫劑量為5×103時可產(chǎn)生較好的保護(hù)力，糞便中只檢出6.28×104卵囊；Drouet-Viard[8]等用3.5×103早熟株對25～29日齡的新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，均可產(chǎn)生較好的保護(hù)力，糞便中未能檢出卵囊；Akpob Y等[9]采用2.5×103早熟株卵囊免疫后攻毒(攻毒劑量為5000個卵囊)，和空白對照組相比，日增重?zé)o顯著差異，但仍然有較多卵囊排出(48.3×105)。由此可見，E.magna四川株具有良好的免疫原性，第三代卵囊即可對被免疫動物產(chǎn)生較好的保護(hù)力。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)分離到的大型艾美爾球蟲四川株致病力弱、免疫原性良好，無需進(jìn)行早熟株的進(jìn)一步選育，可作為兔球蟲疫苗的候選組分之一。

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Eimeriamagna:PathogenicityandImmunogenicityofStrainIsolatedfromRabbit(Oryctolaguscuniculus)inSichuanProvince

WANG Min1, SHI Tuan-yuan2, LI Rui3, HAO Li-li1*

(1.College of Life Science & Technology, Southwest University for Nationalities, Sichuan Chengdu 610041, China; 2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Zhejiang Academy of Agricultural Science, Zhejiang Hangzhou 310021, China; 3.Institute of Quality and Standard for Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Zhejiang Hangzhou 310021, China)

【Objective】The present paper aims to explore the pathogenicity and immunogenicity ofEimeriamagnaisolate in Sichuan province. 【Method】Eimeriamagnafrom our laboratory were used to infect experimental rabbits. 【Result】In the pathogenicity assay, the slight decreases of appetite in SPF rabbits infected with 5×103and 5×104sporulated oocysts during 4-9 days after the infection were observed, respectively; Mild diarrhea of rabbits infected with 5×105oocysts during 6-8 days after the infection lasted for 3 days, and the significant difference of mean body weight per rabbit were observed compared with control group (P≤0.05), however, no death in all groups was found. 5×103oocysts were necessary to attain the maximum oocyst output (2.31×108). In the immunogenicity assay, only 6.28×104oocysts in rabbits immunised with 5×103sporulated oocysts after challenge with 7×105oocysts were detected. Compared with control group, no significant difference in body weight gain in other groups was found. 【Conclusion】TheE.magnaisolate had low virulence but immunogenicity in rabbit, indicating its feasibility as a vaccine component.

Rabbit;Eimeriamagna; Pathogenicity; Immunogenicity

1001-4829(2017)5-1229-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.042

2016-05-20

西南民族大學(xué)中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)青年教師基金項(xiàng)目(2016NZYQN34)；四川省教改項(xiàng)目“獸醫(yī)專業(yè)學(xué)位研究生教育實(shí)踐基地建設(shè)”

王 敏(1991-)，女， 四川瀘州人，碩士，研究方向?yàn)榉肿蛹纳x學(xué)，E-mail: 18683563476@126.com，手機(jī)：18683563476，*為通訊作者：郝力力, E-mail: leelee_hao@ 126.com。

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(責(zé)任編輯 陳 虹)