基質(zhì)金屬蛋白酶-8對(duì)角膜基質(zhì)膠原的作用研究*

金 鑫,劉素素,賀司宇,王麗婭,張芬芬,代閆芳,楊 柯,張晊瑞,張紅敏△

（1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院眼科/河南省眼科研究所/河南省立眼科醫(yī)院，鄭州 450000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)眼科學(xué)碩士研究生，遼寧錦州 121000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院眼科學(xué)碩士研究生，河南新鄉(xiāng) 453000）

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.30.004

基質(zhì)金屬蛋白酶-8對(duì)角膜基質(zhì)膠原的作用研究*

金 鑫1,劉素素1,賀司宇1,王麗婭1,張芬芬2,代閆芳1,楊 柯1,張晊瑞3,張紅敏1△

（1.鄭州大學(xué)人民醫(yī)院眼科/河南省眼科研究所/河南省立眼科醫(yī)院，鄭州 450000；2.錦州醫(yī)科大學(xué)眼科學(xué)碩士研究生，遼寧錦州 121000；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院眼科學(xué)碩士研究生，河南新鄉(xiāng) 453000）

目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶-8（MMP-8）對(duì)角膜的作用。方法選取健康C57BL/6J小鼠15只，右眼角膜基質(zhì)內(nèi)注射10 μL MMP-8作為實(shí)驗(yàn)組，左眼給予等量生理鹽水作為對(duì)照組。于0、4、8 h使用雙光子顯微鏡二次諧波成像技術(shù)對(duì)活體小鼠角膜逐層掃描，Imaris軟件對(duì)所得圖像三維重建，計(jì)算圖像信號(hào)強(qiáng)度。4、8 h在裂隙燈下評(píng)價(jià)角膜混濁度。8 h角膜取材，測(cè)定各角膜羥脯氨酸水平。結(jié)果0 h實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠角膜基質(zhì)纖維信號(hào)強(qiáng)度分別為89.7±11.2、85.3±7.0，4 h分別為14.5±3.4、46.6±14.0，8 h分別為11.0±4.6、34.6±12.5，4 h及8 h，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組角膜基質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度明顯降低（P<0.05）；4 h及8 h，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組角膜明顯混濁（P<0.05）；8 h測(cè)得實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組角膜羥脯氨酸水平分別為（0.433±0.090）、（0.590±0.133）μg/mg，實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組（F=7.193，P=0.014）。結(jié)論MMP-8對(duì)小鼠角膜基質(zhì)膠原有明顯的降解破壞作用，導(dǎo)致角膜透明度下降。

角膜基質(zhì)；基質(zhì)金屬蛋白酶-8；二次諧波成像

真菌性角膜炎（fungal keratitis，F(xiàn)K）是一種嚴(yán)重的致盲性眼病，近年來(lái)發(fā)病率逐漸升高[1]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-8在FK表達(dá)升高[2]。MMP-8屬于MMPs中膠原酶的一種，可降解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原。目前研究認(rèn)為MMP-2和MMP-9在角膜基質(zhì)重塑及膠原降解中有重要作用[3]，而MMP-8對(duì)角膜的作用及作用機(jī)制尚少見研究報(bào)道。二次諧波（second harmonic generation,SHG）成像是近年發(fā)展起來(lái)的一種層面掃描解析組織結(jié)構(gòu)的光學(xué)成像技術(shù)，具有非線性光學(xué)成像特有的三維高分辨率和高成像深度，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域先后應(yīng)用于角膜、活細(xì)胞成像等研究方向[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立小鼠角膜MMP-8基質(zhì)注射模型，使用SHG實(shí)時(shí)活體觀察膠原纖維信號(hào)強(qiáng)度等，探討MMP-8對(duì)小鼠角膜膠原的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8～12周齡無(wú)特殊病原體（SPF）級(jí)雄性C57BL/6J小鼠15只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，經(jīng)裂隙燈檢查無(wú)眼科疾病。實(shí)驗(yàn)小鼠在溫度為（25±1）℃、相對(duì)濕度為59%～61%、12 h光照/12 h黑暗的SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，由專人管理。動(dòng)物的飼養(yǎng)與使用遵照相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。

1.1.2主要試劑及儀器 重組鼠MMP-8（rmMMP-8，美國(guó)R&D公司）、MMP-8檢測(cè)試劑盒（美國(guó)AnaSpec公司）、羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）、4-乙酸汞基苯胺（AMPA，美國(guó)Sigma公司）、酶標(biāo)儀（美國(guó)Perkin Elmer公司）、裂隙燈顯微鏡（日本Topcon公司）、手術(shù)顯微鏡（蘇州六六視覺科技股份有限公司）、體視顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）、雙光子激光掃描顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）。

1.2方法

1.2.1MMP-8活性鑒定 用Assay Buffer配制50 μL 1 ng/μL MMP-8（含1 mmol/L AMPA），37 ℃孵育1 h活化后加入酶板，同時(shí)加入50 μL MMP-8 底物；另設(shè)50 μL Assay緩沖液加入50 μL MMP-8底物作為單純底物孔，各重復(fù)3個(gè)復(fù)孔，室溫孵育30 min。設(shè)置激發(fā)光波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)490 nm，酶標(biāo)儀測(cè)吸光度（A）值。

1.2.2角膜基質(zhì)注射動(dòng)物模型建立及分組 右眼作為實(shí)驗(yàn)組，用Assay緩沖液配置20 ng/μL MMP-8，37 ℃孵育1 h活化，角膜基質(zhì)注射方法參照文獻(xiàn)[5]。實(shí)驗(yàn)小鼠按0.017 mL/g腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉。手術(shù)顯微鏡下，術(shù)者左手輕按小鼠結(jié)膜囊以暴露眼球，右手持微量注射器，角膜緣內(nèi)1 mm處進(jìn)針，進(jìn)入角膜中基質(zhì)層后緩慢注射約10 μL MMP-8。左眼作為對(duì)照組按上述方法注射等量生理鹽水。

1.2.3角膜混濁度臨床評(píng)分 基質(zhì)注射前（0 h）及注射后4、8 h在裂隙燈顯微鏡下觀察小鼠角膜混濁度，評(píng)分系統(tǒng)如下[6]：角膜完全透明，虹膜紋理清晰可見,計(jì)0分；角膜輕度混濁，可見75%及以上虹膜紋理，計(jì)1分；角膜基質(zhì)中度混濁，可見50%～<75%虹膜，計(jì)2分；角膜基質(zhì)重度混濁，僅可見50%以下虹膜，計(jì)3分；角膜基質(zhì)完全混濁，不可透見前房、虹膜及瞳孔，計(jì)4分。

1.2.4SHG觀察角膜基質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度 將小鼠麻醉平穩(wěn)后放在特殊制作的固定頭位的平臺(tái)上，暴露待測(cè)角膜，根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]設(shè)置發(fā)射波長(zhǎng)780 nm，20倍水浸物鏡觀察，使用Z-stack（Z=5 μm）逐層掃描，于0、4、8 h采集圖像，獲得的圖像用Imaris軟件進(jìn)行三維重建，計(jì)算圖像的平均信號(hào)強(qiáng)度。圖像信號(hào)強(qiáng)度越強(qiáng)即說(shuō)明角膜基質(zhì)膠原纖維排布越規(guī)則，角膜基質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，圖像信號(hào)越弱即說(shuō)明角膜基質(zhì)膠原纖維結(jié)構(gòu)紊亂或被降解[7]。

1.2.5羥脯氨酸試劑盒檢測(cè)角膜羥脯氨酸水平 羥脯氨酸為膠原水解產(chǎn)物，測(cè)定羥脯氨酸可反映角膜中膠原的水平，操作參照文獻(xiàn)[8]及試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，方法如下：8 h后經(jīng)腹腔麻醉小鼠，脫頸椎法處死，體視顯微鏡下進(jìn)行角膜取材，測(cè)質(zhì)量（mg）。將角膜放入EP管中剪碎，加入100 μL水解液，95 ℃水浴加熱20 min，調(diào)節(jié)pH在6.0～6.8，加入1 mL蒸餾水及少量活性碳，混勻離心，取100 μL上清液。配置100 μL 5 μg/mL羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品。取100 μL蒸餾水作為空白對(duì)照。向空白管、標(biāo)準(zhǔn)品及各樣品中分別加入100 μL 56 mmol/L Chlormine T試劑，室溫孵育25 min，取100 μL上清液，加入100 μL 1 mol/L Ehrlich′s 液，60 ℃水浴15 min，冷卻后，3 500 r/min離心10 min，取上清液200 μL加入96孔板，各設(shè)2個(gè)復(fù)孔，于波長(zhǎng)550 nm測(cè)定A值。按照公式：（測(cè)定A值-空白A值）/（標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×水解液總體積（0.1 mL）/角膜濕重（mg），計(jì)算樣品中的羥脯氨酸水平（μg/mg）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。角膜混濁度比較采用兩獨(dú)立樣本資料比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。SHG檢測(cè)基質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度組間比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。角膜羥脯氨酸濃度檢測(cè)組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1MMP-8活性鑒定 MMP-8平均A值（A490）為206.3±13.9，單純底物孔為34.0±6.6。

2.2角膜混濁度臨床評(píng)分的比較 于0、4、8 h使用體視顯微鏡對(duì)角膜拍照（圖1）。4 h渾濁度為0分的角膜在實(shí)驗(yàn)組為0只，對(duì)照組為11只，渾濁度為1分在實(shí)驗(yàn)組為12只，對(duì)照組為4只，渾濁度為2分在實(shí)驗(yàn)組為3只，對(duì)照組為0只；8 h渾濁度為0分的角膜在實(shí)驗(yàn)組為0只，對(duì)照組為13只，渾濁度為1分在實(shí)驗(yàn)組為4只，對(duì)照組為2只，渾濁度為2分在實(shí)驗(yàn)組為11只，對(duì)照組為0只。使用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，4 h及8 h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組角膜混濁度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P=0.000）。

圖1 體視顯微鏡下小鼠角膜（×16）

2.3SHG觀察基質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度 0 h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組角膜基質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度分別為89.7±11.2、85.3±7.0；4 h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別為14.5±3.4、46.6±14.0；8 h實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組分別為11.0±4.6、34.6±12.5。重復(fù)測(cè)量方差分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果，根據(jù)Mauchly球形檢驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)不符合球形假設(shè)（P<0.05），故對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量方差分析，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)角膜基質(zhì)信號(hào)強(qiáng)度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組0 h間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.75）；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間4 h及8 h比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），實(shí)驗(yàn)組角膜基質(zhì)纖維信號(hào)強(qiáng)度較對(duì)照組明顯降低。

2.4角膜羥脯氨酸水平測(cè)定 8 h角膜取材，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組角膜羥脯氨酸水平分別為（0.433±0.090）、（0.590±0.133）μg/mg，使用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布（P>0.05），組間方差經(jīng) Levene 檢驗(yàn)證實(shí)方差齊，實(shí)驗(yàn)組角膜羥脯氨酸水平明顯低于對(duì)照組（F=7.193，P=0.014）。

3 討 論

FK是全球范圍內(nèi)一種嚴(yán)重的致盲性眼病，由于共聚焦顯微鏡等早期診斷技術(shù)及抗真菌滴眼劑的早期應(yīng)用，已部分降低真菌性眼內(nèi)炎的發(fā)生率，從而避免眼內(nèi)容剜除。然而臨床上FK患者由于基質(zhì)破壞在晚期往往形成瘢痕愈合，若瘢痕位于瞳孔區(qū)，甚至致盲[1]。由于角膜供體緊缺，雖然人工角膜及各種角膜替代材料正在研究中，目前仍有相當(dāng)一部分患者不能夠進(jìn)行角膜移植，且術(shù)后為預(yù)防角膜排異反應(yīng)需長(zhǎng)期應(yīng)用抗排斥滴眼劑，影響患者的生活質(zhì)量，所以如何防止瘢痕形成已成為近年來(lái)FK研究的重要方向。

FK大致發(fā)病過(guò)程如下，角膜受外傷后，上皮細(xì)胞屏障受損，導(dǎo)致基底膜暴露，致病真菌黏附于受損的角膜上皮，引起機(jī)體天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。一方面，真菌的病原相關(guān)分子結(jié)構(gòu)與宿主角膜上皮細(xì)胞的Toll樣受體（TLRs）相互作用，引起角膜上皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL）-8等誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；另一方面，真菌表面的β-葡聚糖與角膜居留巨噬細(xì)胞表面的Dectin-1結(jié)合，導(dǎo)致酪氨酸激酶（Syk）磷酸化、核因子（NF）-κB轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，NF-κB進(jìn)入核內(nèi)進(jìn)一步引起腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1β、IL-8表達(dá)，擴(kuò)大炎性反應(yīng)，免疫細(xì)胞（主要是中性粒細(xì)胞[9]）釋放水解酶，在殺滅真菌的同時(shí)對(duì)角膜造成破壞[10]。

MMPs分5個(gè)亞組，膠原酶、明膠酶、基質(zhì)水解酶、膜型金屬蛋白酶及廣泛底物酶。其中，MMP-8屬于膠原酶的一種，又名中性粒細(xì)胞膠原酶。正常狀態(tài)下，MMP-8以酶原的形式存在，然而病理狀態(tài)下，如角膜潰瘍[11]、人工角膜移植術(shù)后[10]，MMP-8表達(dá)迅速升高，當(dāng)MMPs與基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）失衡，可導(dǎo)致角膜基質(zhì)降解。

本研究通過(guò)建立MMP-8高表達(dá)模型，以SHG成像技術(shù)活體實(shí)時(shí)觀察角膜基質(zhì)膠原纖維及混濁度變化，并通過(guò)角膜羥脯氨酸的測(cè)定，定量觀察角膜膠原水平，闡明了MMP-8可直接降解角膜Ⅰ型膠原，從而造成基質(zhì)破壞，導(dǎo)致角膜混濁。隨著MMPs/TIMPs在角膜疾病研究的不斷深入，現(xiàn)已研制多種天然及人工合成TIMPs，在角膜炎癥早期使用TIMPs滴眼劑可為角膜瘢痕的治療提供新策略。本研究為TIMPs滴眼劑應(yīng)用于MMP-8高表達(dá)的角膜病以減輕角膜瘢痕提供新思路。

[1]Kredics L,Narendran V,Shobana CS,et al.Filamentous fungal infections of the cornea:a global overview of epidemiology and drug sensitivity[J].Mycoses,2015,58（4）:243-260.

[2]Leal SM,Pearlman E.The role of cytokines and pathogen recognition molecules in fungal keratitis-Insights from human disease and animal models[J].Cytokine,2012,58（1）:107-111.

[3]Ollivier FJ,Gilger BC,Barrie KP,et al.Proteinases of the cornea and preocular tear film[J].Vet Ophthalmol,2007,10（4）:199-206.

[4]王艷艷,韓蒙,孫輝,等.用二次諧波成像技術(shù)研究經(jīng)飛秒激光切削后角膜變化[J].激光生物學(xué)報(bào),2005,14（5）:321-326.

[5]Sonoda Y,Streilein JW.Orthotopic corneal transplantation in mice--evidence that the immunogenetic rules of rejection do not apply[J].Transplantation,1992,54（4）:694-704.

[6]Ghazaryan A,Tsai HF,Hayrapetyan G,et al.Analysis of collagen fiber domain organization by Fourier second harmonic generation microscopy[J].J Biomed Opt,2013,18（3）:31105.

[7]Siddiqi NJ,Alhomida AS.Hydroxyproline concentrations in ocular tissues of Arabian camel （Camelus dromedarius Linn.）[J].Indian J Biochem Biophys,2003,40（6）:451-454.

[8]張紅敏，劉素素，許中中，等.小鼠真菌性角膜炎中主要免疫細(xì)胞的作用[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志,2012,30（9）:779-784.

[9]Lee H,Overall CM,McCulloch CA,et al.A critical role for the membrane-type 1 matrix metalloproteinase in collagen phagocytosis[J].Mol Biol Cell,2006,17（11）:4812-4826.

[10]Robert MC,Arafat SN,Spurr-Michaud S,et al.Tear Matrix Metalloproteinases and Myeloperoxidase Levels in Patients With Boston Keratoprosthesis Type I[J].Cornea,2016,35（7）:1008-1014.

[11]Sakimoto T,Ohnishi T,Ishimori A.Simultaneous study of matrix metalloproteinases,proinflammatory cytokines,and soluble cytokine receptors in the tears of noninfectious corneal ulcer patients[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2014,252（9）:1451-1456.

EffectofMMP-8oncorneacollagen*

JinXin1,LiuSusu1,HeSiyu1,WangLiya1,ZhangFenfen2,DaiYanfang1,YangKe1,ZhangZhirui3,ZhangHongmin1△

（1.DepartmentofOphthalmology,People′sHospitalofZhengzhouUniversity/HenanProvinvcialEyeInstitute/HenanProvinvcialEyeHospital,Zhengzhou,Henan,450000,China;2.DepartmentofOphthalmology,JinzhouMedicalUniversity,Jinzhou,Liaoning121000,China;3.MasterDegreeCandidateofOphthalmology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453000,China）

ObjectiveTo investigate the effect of MMP-8 on cornea.MethodsFifteen C57BL/6J healthy mice were selected.The right eyes corneal stroma was injected by 10μL MMP-8 as the experimental group and the left eyes were injected by same amount of normal saline as the control group.At 0,4,8 h,the two-photon microscope second harmonic generation imaging technology was used to scan mice corneal stroma layer by layer in vivo.The obtained images were performed the 3D reconstruction by Imaris software and the signal intensity of the images were calculated.At 4,8 h,the corneal opacity degree was evaluated under slit lamp.At 8 h,mice were killed and corneas were collected to determine the hydroxyproline concentration.ResultsThe cornea stromal fiber signal strengthes at 0 h in the experimental group and control group were （89.7±11.2） and （85.3±7.0）,which at 4 h were （14.5±3.4） and （46.6±14.0） respectively,which at 8 h were （11.0±4.6） and （34.6±12.5） respectively.The cornea stromal signal strength at 4,8 h in the experiemental group was significantly decreased compared with that in the control group （P<0.05）;the cornea at 4,8 h in the experimental group was significantly turbid than that in the control group （P<0.05）;the cornea hydroxyproline concentrations detected at 8h in the experiemental group and control group were （0.433±0.090） μg/mg and （0.590±0.133） μg/mg respectively,the experimental group was significantly lower than the control group （F=7.193,P=0.014）.ConclusionMMP-8 has obvious degradation and destroy effect on mice corneal stroma collagen,which leads to the decrease of corneal opacity.

corneal matrix;matrix metalloproteinases-8;second harmonic generation

河南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（162300410163）；河南省創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目（144100510015）；河南省國(guó)際合作項(xiàng)目（152102410085）。

金鑫（1991-），住院醫(yī)師，碩士，主要從事角膜病的研究?！?/p>

，E-mail：zhm0906@163.com。

R392.9

A

1671-8348（2017）30-4187-03

2017-01-18

2017-04-06）