肥胖相關(guān)基因與叉頭轉(zhuǎn)錄因子在非酒精性脂肪肝大鼠模型肝臟中的表達(dá)*

陳益耀，陳 軼，何周桃，蔡曼妮

（海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，?？?570311）

論著·基礎(chǔ)研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.30.003

肥胖相關(guān)基因與叉頭轉(zhuǎn)錄因子在非酒精性脂肪肝大鼠模型肝臟中的表達(dá)*

陳益耀，陳 軼，何周桃，蔡曼妮

（海南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，海口 570311）

目的研究肥胖相關(guān)基因（FTO）與叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1（FoxO1）蛋白在非酒精性脂肪肝模型大鼠肝臟中的表達(dá)水平。方法通過(guò)飼喂高能量和高脂肪的大鼠飼料制備非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，然后采集大鼠的血液和肝臟組織，測(cè)定其肝臟指數(shù)和血液生化指標(biāo)，包括三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）；對(duì)大鼠進(jìn)行肝臟病理檢測(cè)；采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定FTO蛋白和FoxO1蛋白在大鼠肝臟中的表達(dá)水平。結(jié)果8周后，模型組大鼠的肝臟質(zhì)量、體質(zhì)量和肝臟指數(shù)3項(xiàng)指標(biāo)均高于對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組大鼠的AST、ALT、LDL、ALP、TG和TC均高于對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組大鼠的HDL低于對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組大鼠肝小葉部分產(chǎn)生脂肪變性、炎癥，對(duì)照組大鼠則沒(méi)有；模型組大鼠的FTO蛋白和FoxO1蛋白在肝臟中的表達(dá)積分高于對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論FTO與FoxO1一起相互作用，可能擾亂正常的能量和脂肪代謝。

叉頭轉(zhuǎn)錄因子類；非酒精性脂肪肝；能量代謝；脂類代謝；肥胖相關(guān)基因

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）作為一種與遺傳、環(huán)境和代謝方式均相關(guān)的疾病，其與人體的肥胖程度具有很高的相關(guān)性。目前醫(yī)學(xué)界對(duì)NAFLD的具體發(fā)病機(jī)制仍然沒(méi)有完全研究透徹，但是“二次打擊”學(xué)說(shuō)獲得了很大程度的認(rèn)可。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為胰島素抵抗（IR）和氧化應(yīng)激分別造成了初次打擊和二次打擊[1]。2007年，F(xiàn)rayling 等[2]發(fā)現(xiàn)了一種新型的基因，該基因在人體內(nèi)分布較為廣泛，并且能夠在很大程度上對(duì)人的食欲進(jìn)行調(diào)節(jié)，同時(shí)對(duì)能量的代謝也有很大影響。隨后，Guo等[3]進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，肥胖相關(guān)基因（FTO）通過(guò)增多丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）氧化應(yīng)激標(biāo)志物進(jìn)而參與到NAFLD的發(fā)病機(jī)制中，且其自身亦在NAFLD中表達(dá)上調(diào)，但是這一過(guò)程的具體分子水平的機(jī)制尚不十分清楚。但已經(jīng)有研究顯示，F(xiàn)TO可以通過(guò)影響人體的肥胖程度參與到NAFLD的發(fā)病機(jī)制過(guò)程中。叉頭轉(zhuǎn)錄因子（FoxO1）是一個(gè)被最早發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)人體肝臟細(xì)胞發(fā)生IR時(shí)，其活性得到提高，通過(guò)不同的途徑最終可能會(huì)導(dǎo)致高血糖癥和高三酰甘油血癥[4]。腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通過(guò)FoxO1來(lái)調(diào)節(jié)肝臟細(xì)胞糖異生過(guò)程中磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶（PEPCK）和葡萄糖-6磷酸酶（G6Pase）這兩種關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，同時(shí)AMPK也是FTO調(diào)節(jié)人體肥胖程度和飲食的中介因子[5]。FTO和FoxO1二者之間的相互作用機(jī)制目前尚少見(jiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)制備NAFLD大鼠模型，研究FTO和FoxO1在大鼠肝臟中的表達(dá)水平，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探究，以期為臨床治療NAFLD提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物來(lái)源 雄性SD大鼠，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量（200±10）g。

1.2方法

1.2.1NAFLD大鼠模型建立 SD大鼠喂養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后，分別抽取15只作為對(duì)照組和模型組，對(duì)照組大鼠飼喂普通動(dòng)物飼料，模型組大鼠飼喂特制高能量和高脂肪動(dòng)物飼料（普通飼料加100 g/kg豬油，加20 g/kg膽固醇，加100 g/kg蔗糖），飼養(yǎng)8周后進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2大鼠血液采集和肝臟分離 大鼠禁食24 h后，腹腔注射10%水合氯醛進(jìn)行麻醉，斷頭采集血液，25 ℃靜置3 h后，使用離心機(jī)以3 000 r/min離心15 min，留取上清液待用。大鼠斷頭處死后快速取出肝臟，計(jì)算肝臟指數(shù)=肝臟重量（g）/大鼠體質(zhì)量（g）×100%，然后切下小片放入甲醛溶液進(jìn)行組織固定，石蠟切塊后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，然后觀察。

1.2.3大鼠血清生化檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化儀（德國(guó)羅氏，Cobas6000）測(cè)定大鼠的血清標(biāo)本，測(cè)定指標(biāo)分別為：三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

1.2.4大鼠肝臟病理切片 挑取大鼠肝臟組織，放入磷酸緩沖液中進(jìn)行漂洗，漂洗干凈后放入甲醛溶液中進(jìn)行固定，然后交由醫(yī)院病理科進(jìn)行下一步的大鼠肝臟病理切片（HE染色）。

1.2.5FTO蛋白和FoxO1蛋白表達(dá)測(cè)定 參照張潔蕾[6]免疫組織化學(xué)S-P法對(duì)大鼠的FTO蛋白和FoxO1蛋白在肝臟中的表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1模型組大鼠與對(duì)照組大鼠的肝質(zhì)量、體質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較 8周后，對(duì)照組大鼠皮毛光滑整齊，活動(dòng)靈敏，精神狀態(tài)良好，無(wú)不良特征，模型組大鼠皮毛特別有光澤，但較為肥胖，行動(dòng)遲緩，習(xí)慣性待在原地打瞌睡。經(jīng)過(guò)8周的喂養(yǎng)，模型組大鼠的肝臟質(zhì)量、體質(zhì)量和肝臟指數(shù)3項(xiàng)指標(biāo)均高于對(duì)照組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠的肝臟質(zhì)量、體質(zhì)量和肝臟指數(shù)比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較

2.2模型組大鼠與對(duì)照組大鼠的血清生化指標(biāo)比較 經(jīng)過(guò)8周喂養(yǎng)后，模型組大鼠的AST、ALT、LDL和ALP高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；模型組大鼠的TG和TC也高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；模型組大鼠的HDL低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠的血清生化指標(biāo)比較

a：P<0.01，b：P<0.05，與對(duì)照組比較

2.3模型組大鼠與對(duì)照組大鼠的肝臟組織病理比較 經(jīng)HE染色法染色后顯示，模型組大鼠肝小葉部分產(chǎn)生很多脂肪變性，有炎癥產(chǎn)生（圖1B）；而對(duì)照組大鼠肝小葉部分則沒(méi)有脂肪變性，也沒(méi)有肝臟細(xì)胞產(chǎn)生炎癥（圖1A）。

A：對(duì)照組；B:模型組
圖1兩組大鼠的肝臟組織病理切片比較

2.4模型組大鼠與對(duì)照組大鼠的FTO蛋白與FoxO1蛋白在肝臟組織的表達(dá)比較 選取合適的肝臟組織進(jìn)行固定、切片，然后經(jīng)免疫組織化學(xué)染色處理，結(jié)果顯示模型組大鼠的FTO蛋白和FoxO1蛋白在肝臟中的表達(dá)積分（6.57±1.86vs.4.71±1.56）與對(duì)照組（1.28±0.49vs.2.67±0.99）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3 討 論

現(xiàn)代社會(huì)隨著生活節(jié)奏和飲食結(jié)構(gòu)的變化，脂肪肝的患者數(shù)量逐年上升，這其中NAFLD患者占有很高的比例。有研究顯示，人體內(nèi)的脂肪酸和脂肪酸的代謝物會(huì)沉積在肝臟細(xì)胞內(nèi)，可能會(huì)導(dǎo)致NAFLD的發(fā)病[7-8]。但目前為止，NAFLD的發(fā)病機(jī)制并沒(méi)有完全闡明，因此，也缺乏相應(yīng)的有效治療藥物和手段，這使得NAFLD對(duì)患者的危害極其嚴(yán)重，發(fā)現(xiàn)NAFLD的發(fā)病機(jī)制并尋找有效的藥物和治療方法十分重要。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，肥胖與人體內(nèi)血脂升高有緊密的聯(lián)系，而肥胖和人體內(nèi)的血脂升高都會(huì)導(dǎo)致NAFLD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的明顯升高[9]。環(huán)境和飲食結(jié)構(gòu)對(duì)人體的肥胖程度及體內(nèi)血脂水平影響巨大，但是隨著科學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)人體本身的基因?qū)Υ艘灿芯薮笥绊?，F(xiàn)TO可以通過(guò)調(diào)節(jié)人對(duì)食物的欲望和能量代謝來(lái)調(diào)節(jié)人體的肥胖及血脂水平。同時(shí)，該基因還可以在下丘腦、胰島等器官中表達(dá)，與許多內(nèi)科疾病的產(chǎn)生有很大關(guān)系[2]。變異后的FTO基因也可導(dǎo)致相關(guān)疾病的產(chǎn)生，如2型糖尿病[10]。FTO可以使MDA和SOD這兩種物質(zhì)在人體內(nèi)的水平升高，這與NAFLD的發(fā)病關(guān)系密切，表明FTO在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中具有某種重要作用[3]。FTO在NAFLD患者體內(nèi)細(xì)胞表達(dá)升高時(shí)，患者體內(nèi)細(xì)胞的脂肪形成和氧化應(yīng)激水平均會(huì)顯著增加[11]。FoxO1活性增高時(shí)，可以引起2型糖尿病的發(fā)病或人體血脂水平的升高[12]。有研究顯示，當(dāng)FoxO1在鼠肝臟內(nèi)過(guò)表達(dá)時(shí)，會(huì)使鼠體內(nèi)游離脂肪酸累積，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟細(xì)胞產(chǎn)生脂肪變性[13]。

本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了在模型組大鼠的肝臟中，F(xiàn)TO蛋白和FoxO1蛋白的表達(dá)與NAFLD的發(fā)病具有緊密聯(lián)系，這說(shuō)明FTO與FoxO1一起相互作用可能擾亂正常的能量和脂肪代謝。

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Expressionofobesity-relatedgeneandforkheadtranscriptionfactorsinliverofnonalcoholicfattyliverdiseaseratmodel*

ChenYiyao,ChenYi,HeZhoutao,CaiManni

（DepartmentofGastroenterology,HainanProvincialPeople′sHospital,Haikou,Hainan570311,China）

ObjectiveTo research the obesity-related gene （FTO） and forkhead transcription factors O1 （FoxO1） protein expression level in the livers of non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD） rat model.MethodsThe animal model of NAFLD in rats was prepared by feeding high energy and high fat feed.Then the rat blood and liver tissue were collected for detecting the liver index and blood biochemical indexes,including triglycerides（TG）,total cholesterol（TC）,alanine aminotransferase（AST）,aspartate aminotransferase（ALT）,alkaline phosphatase（ALP）,high-density lipoprotein （HDL） and low density lipoprotein（LDL）;the liver pathological examination was performed;FTO protein and Fox O1 protein expression levels in rat liver were detected by using the immunohistochemical assay.ResultsThe rat liver weight,body weight and liver index after 8 weeks in the model group were higher than those in the control group,the difference was statistically significant （P<0.05）;the levels of AST,ALT,LDL,ALP,TG and TC in the model group were higher than those in the control group,the difference was statistically significant （P<0.05）,the HDL level in the model group was lower than that in the control group,the difference was statistically significant （P<0.05）;the model group produced steatosis and inflammation in hepatic lobule part,while the control group had no these lesions;the FTO protein and FoxO1 protein expression levels in liver of the model group were higher than those in the control group,the difference was statistically significant （P<0.05）.ConclusionFTO and FoxO1 interaction may disturb the normal energy and fat metabolism.

forkhead transcription factors;nonalcoholic fatty liver disease;energy metabolism；lipid metabolism;obesity related gene

海南省衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)基金資助項(xiàng)目（14A210192）； 海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（814310）；海南省中藥現(xiàn)代化專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（2015ZY02）。

陳益耀（1979-），副主任醫(yī)師，碩士，主要從事非酒精性脂肪性肝病的基礎(chǔ)與臨床研究。

R322.4

A

1671-8348（2017）30-4185-02

2017-01-30

2017-04-18）