沙門氏菌檢測技術(shù)研究進(jìn)展

李 杰， 丁承超， 翟續(xù)昭， 王廣彬， 劉武康， 曾海娟， 王淑娟， 孫靜娟， 董慶利， 劉 箐*

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.徐州綠健乳品飲料有限公司，江蘇 徐州 221006)

菌快速檢測”(3A15308006)

沙門氏菌檢測技術(shù)研究進(jìn)展

李 杰1， 丁承超1， 翟續(xù)昭1， 王廣彬2， 劉武康1， 曾海娟1， 王淑娟1， 孫靜娟1， 董慶利1， 劉 箐1*

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.徐州綠健乳品飲料有限公司，江蘇 徐州 221006)

沙門氏菌(Salmonella)是一種常見的人畜共患病原菌，不僅能引起動物傷寒、霍亂，還會導(dǎo)致人類胃腸炎、敗血癥等疾病，嚴(yán)重威脅人、畜的生命健康，由其引起的食品安全事件高居所有食源性致病菌之首。食品中沙門氏菌的快速、準(zhǔn)確檢測是預(yù)防與控制沙門氏菌傳播蔓延的重要手段。隨著生物學(xué)、化學(xué)、物理等學(xué)科的快速發(fā)展，沙門氏菌的檢測技術(shù)已從傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和生化鑒定，發(fā)展到免疫學(xué)、分子生物學(xué)、電化學(xué)、傳感器、生物芯片等快速、高通量檢測，尤其是近年來與納米技術(shù)、光譜學(xué)、質(zhì)譜學(xué)以及代謝組學(xué)等的結(jié)合使用，為沙門氏菌快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法提供了新的發(fā)展方向。本文在參閱國內(nèi)外最新研究報道的基礎(chǔ)上，對各種方法進(jìn)行總結(jié)闡述，并對沙門氏菌未來檢測技術(shù)的發(fā)展動向予以分析。

沙門氏菌；人畜致病菌；食品安全；檢測技術(shù)；研究進(jìn)展

沙門氏菌(Salmonella)是美國細(xì)菌學(xué)家Salmon 與Smith 于1885 年最早發(fā)現(xiàn)的無芽胞、無莢膜的革蘭陰性桿菌，包括腸道沙門氏菌和邦戈爾沙門氏菌兩個種[1]，目前已發(fā)現(xiàn)存在2 579個血清型[2]。因其營養(yǎng)要求低，在糞便、土壤、食品(肉、蛋、奶、面包等)、水中存活時間長達(dá)5個月至2年之久，且污染食品后沒有明顯的感官變化，因而極易被動物及人類食用造成感染性疾病[3]，如禽傷寒、雞白痢、豬霍亂等動物性疾病，以及人類胃腸炎、類傷寒、敗血癥、感冒等感染型食物中毒。人類感染沙門氏菌后初期癥狀為惡心、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒等，若不及時治療死亡率高達(dá)10%[4-5]。通常情況下沙門氏菌食用量超過105CFU即可造成人類感染，而對于高度易感人群15～20 CFU即可引起沙門氏菌感染[6]。據(jù)世界衛(wèi)生組織2015年發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，自2010年以來有5.82億例22種不同食源性腸道疾病爆發(fā)，造成35余萬人死亡，其中傷寒沙門氏菌5.2萬例，致病性大腸埃希氏菌3.7萬例，諾如病毒3.5萬例[7]。因此，沙門氏菌是食源性致病菌重點的監(jiān)控對象[8]，對食品進(jìn)行沙門氏菌快速、準(zhǔn)確的檢測，是預(yù)防和控制沙門氏菌感染的有效手段?，F(xiàn)有檢測方法主要包括傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、免疫學(xué)檢測方法、分子生物學(xué)檢測方法，以及以此類方法為基礎(chǔ)、多學(xué)科交叉發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)，如傳感器技術(shù)、納米技術(shù)、光譜技術(shù)、生物芯片技術(shù)等，為沙門氏菌的快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測提供了新的思路。

1 沙門氏菌的檢測技術(shù)與方法

1.1傳統(tǒng)方法

目前用于檢測食品中沙門氏菌的主要標(biāo)準(zhǔn)方法有: 國際標(biāo)準(zhǔn)ISO6579: 2002《食品和動物飼料的微生物學(xué) 沙門氏菌檢測的水平方法》[9]，以及《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》(GB 4789.4-2010)[10]。上述的標(biāo)準(zhǔn)方法都是根據(jù)沙門氏菌的繁殖及生長特性，采用細(xì)菌分離、生化鑒定等技術(shù)方案，具體檢測過程包括18～24 h的預(yù)增菌、24 h的選擇性增菌、48 h的分離培養(yǎng)以及生化鑒定和血清分型等五個步驟[11]，檢測時間長達(dá)4～7 d，操作過程煩瑣,較多地依賴于手工操作和主觀判斷，并且腸桿菌科細(xì)菌間的生化反應(yīng)多有交叉,在快速、敏感與特異性等方面有自身的局限性[12]，不能及時、確切地給出食品的安全性評價。近年來，針對傳統(tǒng)檢測方法的缺點，有研究者在傳統(tǒng)檢測方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良，改進(jìn)方式一般集中于提高菌體富集效率，如疏水網(wǎng)膜法(HGMF)[13]，或者提高菌體的分離與鑒定效率，如添加物質(zhì)法[14]和顯色培養(yǎng)基法[15]。這些改進(jìn)顯著降低了沙門氏菌的最低檢測限和檢測時間，但仍然無法從根本上改變傳統(tǒng)生化鑒定耗時費力、效率低下的弊端，是一種注定會被淘汰的檢測方法。因而，建立更加快速、簡便、省時的檢測方法，對于預(yù)防和控制沙門氏菌的發(fā)生和蔓延，保障食品安全具有重要意義。

1.2免疫分析檢測技術(shù)

免疫分析檢測技術(shù)是在免疫學(xué)理論基礎(chǔ)上，利用抗原-抗體反應(yīng)的特異性，再輔以免疫放大技術(shù)來鑒別細(xì)菌[16]。一般分為非標(biāo)記免疫分析技術(shù)和標(biāo)記免疫分析技術(shù)[17]，已經(jīng)建立的沙門氏菌免疫學(xué)檢測方法大致可分為酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、免疫磁珠分離技術(shù)、免疫熒光法、以同位素標(biāo)記抗體(放射免疫試驗)為基礎(chǔ)的方法及其他多種以抗體為基礎(chǔ)，利用乳膠凝集、免疫傳感器、免疫擴(kuò)散、免疫印跡及免疫色譜技術(shù)等方法[18]。

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) ELISA是免疫分析技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的方法，它將抗原、抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用原理有機(jī)地結(jié)合起來，可用于檢測樣品中特異性抗原。ELISA在實際檢測中的應(yīng)用主要包括雙抗體夾心ELISA、直接ELISA、間接ELISA。Bang等[19]建立了檢測鼠傷寒沙門氏菌的間接競爭ELISA法(IC-ELISA)，朱春紅[20]采用間接ELISA法檢測腸炎沙門氏菌。伍新燕等[11]以抗沙門氏菌多克隆抗體作為捕獲抗體，以抗沙門氏菌單克隆抗體作為檢測抗體，建立快速檢測沙門氏菌的雙抗夾心ELISA方法，該方法可以同時檢測A、B、C、D、E等五種典型的沙門氏菌。ELISA法的檢測限一般為104～105cfu/mL,檢測過程耗時48 h左右[21]，96孔酶標(biāo)板的使用增大了檢測通量，ELISA法的檢測效率相對于傳統(tǒng)檢測法略有提高，但仍然費時費力，無法避免檢測前的長時間增菌過程，且實際操作中洗板不徹底易出現(xiàn)假陽性問題。

1.2.2 免疫磁珠分離技術(shù)(Immunomagnetic Beads Separation Techniques，IMBS) 免疫磁珠分離技術(shù)是利用磁珠上包被的特異性抗體與抗原發(fā)生親和反應(yīng),形成的抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物具有較大的磁性,在磁場的作用下定量移動，實現(xiàn)對目標(biāo)物的富集。該技術(shù)從提高待測病原體的分離富集效率著手提高檢測靈敏度。實際應(yīng)用中結(jié)合其他快速檢測技術(shù)如生物學(xué)、免疫學(xué)、電化學(xué)等,使檢測的靈敏度更高、特異性更強(qiáng)、適用范圍更廣且無需前增菌過程，使檢測時間從傳統(tǒng)的幾天縮短到幾小時,在食源性致病菌檢測中得到廣泛的應(yīng)用[22]。 Herzig[23]等將酪胺信號放大技術(shù)(Tyramide signal amplification，TSA技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白或核酸進(jìn)行高密度原位標(biāo)記的酶學(xué)檢測方法)與免疫磁珠分離技術(shù)相結(jié)合用于檢測食品中的鼠傷寒沙門氏菌。檢測經(jīng)人工污染鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌的牛肉和家禽樣品，未經(jīng)增菌處理，檢測限分別為800和200 cfu/mL。試驗中將這種方法與夾心ELISA法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)其靈敏度是后者的50倍。實驗最終結(jié)果表明，將IBMS與酪胺信號放大技術(shù)聯(lián)用能顯著提高食品樣品中沙門氏菌檢測的靈敏度和特異性，有望成為食品中食源性致病菌的監(jiān)測手段。

1.2.3 免疫熒光檢測技術(shù)(Technique Immunofluorescence) 免疫熒光檢測是將免疫學(xué)檢測方法與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，具體操作是先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體(抗原)，再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)[15],這種檢測方法靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測速度快，但是存在非特異性染色、結(jié)果判定客觀性不足等問題。Pandey等[24]應(yīng)用了一個新的基于Vi夾膜多糖檢測的夾心熒光免疫分析法，使用陽離子受體分子多粘菌素B作為粘結(jié)劑而抗Vi抗體作為捕集劑，以堿性磷酸鹽標(biāo)記二抗，對硝基苯酚磷酸鹽為顯示底物，特異性檢測傷寒沙門氏菌，檢測限達(dá)10 cfu/mL 。

1.3分子生物學(xué)檢測方法

分子生物學(xué)檢測技術(shù)是通過檢測特異性核酸序列來橫向比較不同物種、同物種不同個體、同個體的不同細(xì)胞或不同生理(病理)狀態(tài)的差異來檢測、識別某種生物的方法[16]。常用的分子生物學(xué)檢測包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增等[25]，以及以測序技術(shù)為基礎(chǔ)的沙門氏菌檢測方法[26]，這些方法具有高靈敏度、高特異性、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于沙門氏菌的快速檢測。然而，分子生物學(xué)檢測方法對操作人員、儀器以及檢測條件要求較高，因此較難在基層大面積推廣使用。

1.3.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù) PCR技術(shù)是Kary Mullis等人于1985發(fā)明的一種體外擴(kuò)增特定DNA片段的方法，能對微量的DNA片段進(jìn)行大量擴(kuò)增。Widjojoatmodjo等于1991年首次將其應(yīng)用到沙門氏菌的特異性檢測中[27]。PCR檢測法與傳統(tǒng)的檢測方法相比，具有較高的特異性、靈敏度，自動化程度高，特別適合微量抗原的檢測。但是，PCR技術(shù)在樣品的實際檢測各環(huán)節(jié)操作相對復(fù)雜，結(jié)果重復(fù)性較差。Elisabetta等[28]利用Real-time PCR技術(shù)檢測豬肉中的沙門氏菌，檢測結(jié)果與國標(biāo)法完全一致，其中檢測限為10 cfu/25 g，檢測時間為23 h。 Alves等[29]首次運用水解探針和一種內(nèi)部放大控制(Internal Amplification Control, IAC)相結(jié)合的多重實時熒光定量PCR(multiplex real-time PCR)檢測方法同時檢測彎曲桿菌和沙門氏菌。實驗中對雞肉中的沙門氏菌和彎曲桿菌進(jìn)行多重實時熒光定量PCR檢測，未經(jīng)富集培養(yǎng)得到的檢測限分別為105、103cfu/mL。經(jīng)過富集培養(yǎng)，24 h均得到檢測限為1 cfu/mL的檢測結(jié)果。該研究采用的多重實時熒光定量PCR可以作為食品中沙門氏菌和彎曲桿菌的快速檢測工具，其中ICA的存在可以區(qū)別出由于抑制劑存在等造成的假陰性問題，大大提高檢測的準(zhǔn)確性。1.3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP) LAMP技術(shù)是 Notomi等[30]于2000年發(fā)明的一種基于并優(yōu)于PCR的擴(kuò)增技術(shù)，是利用具有鏈置換活性的Bst(Bacillusstearothermophilus) DNA聚合酶，通過對靶基因的6個區(qū)段設(shè)計的4條特異性的引物[31]，在65 ℃條件下水浴1 h即達(dá)到對目的基因的高效擴(kuò)增。Li等[32]針對沙門氏菌高度特異性基因62181533，建立LAMP法檢測食品中的沙門氏菌，檢測限為4.1 cfu/mL，檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法完全相同，特異性強(qiáng)、靈敏度高，檢測時間低于1 h，加上12 h預(yù)增菌時間，與傳統(tǒng)方法相比較為快速。該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標(biāo)上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術(shù)，檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。但是，正因為其較為靈敏，容易形成氣溶膠污染，加之操作環(huán)境、食品樣品中細(xì)菌種類極其復(fù)雜，因此很容易造成假陽性問題，并且對引物設(shè)計要求較高。Abirami等[33]比較了基于LAMP和生物熒光技術(shù)的3MTM分子檢測(Molecular Detection Assay MDA)[34]試劑盒、 3MTMPetrifilmTM沙門氏菌表達(dá)系統(tǒng)(Salmonella Express (SALX) System)[35]與傳統(tǒng)生化培養(yǎng)檢測法對家禽本身及其飼養(yǎng)環(huán)境中的沙門氏菌進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示三種檢測方法的陽性率基本一致。表明3M MDA以及3MTMPetrifilmTMSALX均是敏感度高、特異性強(qiáng)、較為準(zhǔn)確且快速的檢測方法。尤其是基于LAMP熒光檢測技術(shù)的沙門氏菌試劑盒3M MDA的使用，完全可以規(guī)避氣溶膠污染等導(dǎo)致的假陽性問題。

1.3.3 基因芯片技術(shù)(gene chip) 基因芯片(DNA微陣列)檢測技術(shù)是基于核酸雜交原理，將大量的核酸探針同時固定于支持物(硅片、玻片)上，一次可對大量核酸分子進(jìn)行檢測分析，彌補(bǔ)了PCR免疫雜交等只限于檢測一種或少數(shù)幾種靶標(biāo)微生物或基因，操作復(fù)雜，效率低等的不足之處，是一種準(zhǔn)確、高通量且自動化程度較高的檢測技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)是分子生物學(xué)與計算機(jī)應(yīng)用的一種融合，只是目前還沒有具體的標(biāo)準(zhǔn)對基因芯片技術(shù)進(jìn)行一個綜合性的說明，且目前來說，基因芯片在沙門氏菌的檢測中仍然存在技術(shù)成本(探針合成與固定、分子的標(biāo)記、數(shù)據(jù)的讀取與分析等方面)較高、重復(fù)性差等問題。 許俊剛[36]應(yīng)用基因芯片技術(shù)對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、志賀氏菌4種30份標(biāo)本進(jìn)行檢測，8 h內(nèi)得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。祝儒剛等[37]將多重PCR技術(shù)與基因芯片技術(shù)進(jìn)行比較，多重 PCR 檢測靈敏度為20 pg，而基因芯片檢測靈敏度可達(dá)2 pg。同時建立一種運用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)結(jié)合基因芯片技術(shù)檢測大腸埃希菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌5種食源性致病菌的快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法。Li[38]建立一種可視化的DNA微陣列技術(shù)，結(jié)合多重PCR技術(shù)，用于檢測食品中常見的食源性致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、大腸埃希菌、單細(xì)胞增生李斯特菌)。實驗首先用多重PCR對各種檢測菌的特異性基因片段進(jìn)行擴(kuò)增。將生物素連接在PCR擴(kuò)增產(chǎn)物核酸探針上，用標(biāo)記有堿性磷酸酶的鏈霉親和素與底物硝基四氮唑藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯二鈉鹽(NBT/BCIP)進(jìn)行反應(yīng)，觀察芯片表面顯藍(lán)色可確定為陽性。實驗中對沙門氏菌等十四種食源性致病菌的菌體稀釋液、人工污染的食品基質(zhì)進(jìn)行檢測，檢測限為102cfu/mL。證明這是一種高通量、敏感、快速的沙門氏菌等食源性致病菌檢測手段。

1.4沙門氏菌的新型檢測技術(shù)

1.4.1 生物傳感器檢測技術(shù) 生物傳感器(biosensor)具有接收信號并轉(zhuǎn)換和放大信號的能力，對生物物質(zhì)極其敏感并且可將濃度信號轉(zhuǎn)換為電信號進(jìn)行檢測。其基本原理是由固定化的生物敏感材料作為識別元件(包括酶、抗體、抗原、微生物、細(xì)胞、組織、核酸等生物活性物質(zhì))與適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器(如氧電極、光敏管、場效應(yīng)管、壓電晶體等)及信號放大裝置構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。目前用于沙門氏菌檢測的傳感器包括酶傳感器、免疫傳感器、電化學(xué)生物傳感器、基因傳感器、光敏傳感器等。Oh等[39]將免疫傳感器與光學(xué)顯微成像系統(tǒng)(LMIS)相結(jié)合，用于快速檢測雞肉中的沙門氏菌，該實驗方法對沙門氏菌的檢測限僅為103cfu/25 g雞肉，是一種靈敏度相對較高的檢測手段。利用生物傳感器便于觀察和計數(shù)的優(yōu)點，將其與光學(xué)顯微成像系統(tǒng)(LMIS)相結(jié)合之后具有具體、敏感、簡單、實用等更多的優(yōu)勢。Sheikhzadeh等[40]建立基于3-吡咯羧基多聚物適配體的非標(biāo)記阻抗傳感器，并將其應(yīng)用于鼠傷寒沙門氏菌的檢測。通過檢測適配體與靶標(biāo)物在3-吡咯羧基多聚物內(nèi)部共軛效應(yīng)以及電學(xué)特性方面的相互作用測定阻抗。該傳感器對鼠傷寒沙門氏菌的檢測濃度范圍為102～108cfu/mL，檢測限為3 cfu/mL。是一種經(jīng)濟(jì)、敏感、快速的檢測方法。電化學(xué)免疫傳感器(Electrochemical Immunosensor)是將免疫分析與電化學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合而構(gòu)建的一類生物傳感器，應(yīng)用于痕量免疫原性物質(zhì)的分析研究。電化學(xué)免疫傳感器將抗原或抗體分子作為生物感受器和電化學(xué)轉(zhuǎn)換器，根據(jù)檢測的信號分為電流、電位、電導(dǎo)、電容四種主要類型，幾乎所有類型的電化學(xué)免疫傳感器都能應(yīng)用于食品中沙門氏菌的檢測[1]。Fei等[41]將電化學(xué)免疫傳感器用于雞傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的快速檢測。傳感器制備的第一步是用于捕獲抗體、提高信號強(qiáng)度的金納米粒子的電沉積。絲網(wǎng)印刷碳電極(SPCE)表面修飾離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗譜檢測修飾過程。分別將未標(biāo)記的抗體固定到SPCE表面，從而形成了可以用于檢測雞傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的夾心免疫分析中，加入待測物后再添加標(biāo)記辣根過氧化物酶的二抗，再加入過氧化氫和硫堇后，后者被氧化產(chǎn)生的信號由循環(huán)伏安法測定，對雞傷寒沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的檢測限均為3×103cfu/mL。該研究中提供的電化學(xué)免疫傳感器是一種敏感性高、特異性強(qiáng)、且重復(fù)性好的沙門氏菌檢測方法，并且可以考慮通過改變抗體而作為其他食源性致病菌的檢測工具。

1.4.2 納米技術(shù) 納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1～100 nm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料[42]。納米材料具有的小尺寸效應(yīng)﹑表面效應(yīng)﹑量子尺寸效應(yīng)﹑宏觀量子隧道效應(yīng)等基本特征，通過與生物學(xué)、電子材料相結(jié)合，便具有針對分析物的特定識別機(jī)制(比如抗體或酶)，并且可以從分析物中產(chǎn)生獨特的標(biāo)志信號等特點。納米材料如氧化石墨烯、磁珠、碳納米管、等離子納米金、銀納米粒子等已被成功地應(yīng)用于食源性致病菌的檢測[43]。在食品安全檢測中的應(yīng)用主要是納米金免疫標(biāo)記技術(shù)，納米生物傳感器技術(shù)以及以納米金為探針的基于電荷檢測的新型基因芯片。與常規(guī)檢測技術(shù)結(jié)合，可以提高檢測的靈敏度、實現(xiàn)大通量的檢測，更可以實現(xiàn)現(xiàn)場檢測、省時省力，若能解決此技術(shù)檢測成本昂貴、技術(shù)要求高等問題，會成為未來檢測技術(shù)的發(fā)展方向。Kim等[44]用微流體納米生物傳感器來快速檢測沙門氏菌。其原理是用量子點檢測沙門氏菌細(xì)胞，將抗沙門氏菌多克隆抗體共價固定于量子點表面，采用超順磁性顆粒和微流控芯片來分離并富集樣品中的沙門氏菌。使用便攜式熒光儀測量附著于樣品中沙門氏菌上的量子點納米顆粒的熒光信號，納米生物傳感器的熒光響應(yīng)隨細(xì)胞濃度的增加而增加。試驗中對連續(xù)稀釋的沙門氏菌硼酸鹽緩沖液和雞肉提取物進(jìn)行致病性沙門氏菌的靈敏度檢測，結(jié)果顯示在硼酸鹽緩沖液和食品提取物中，該傳感器對沙門氏菌的檢測限均為103cfu /mL。該研究實現(xiàn)了納米技術(shù)與生物傳感器的較好結(jié)合，為生物傳感器的發(fā)展提供了更好的前景，納米生物傳感器靈敏度高、微型化攜帶方便、自動化程度高等使用優(yōu)點使其能夠廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境中沙門氏菌的的快速檢測。Liu等[45]用一個基于夾心免疫分析法，結(jié)合抗體修飾Fe3O4磁性納米粒(immunoMNPs)的一個高度敏感的表面等離子體共振(SPR)傳感器用于快速檢測腸炎沙門氏菌。immunoMNPs不僅是將分析物從樣品中快速呈遞到傳感器表面的運載工具，也作為增加與分析物的結(jié)合導(dǎo)致的可測量折射率的變化標(biāo)志。此方法對沙門氏菌的檢測限為14 cfu/mL，在1.4×101～1.4×109cfu/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。此外，與腸炎沙門氏菌常規(guī)SPR免疫傳感器檢測相比，與immunoMNPs的結(jié)合使用之后其靈敏度改善了四個數(shù)量級。實驗研制的SPR免疫傳感器有潛力成為一個簡單、低成本的、敏感的原位檢測食源性病原菌的方法。

1.5其他檢測技術(shù)

目前各種沙門氏菌快速檢測技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法相比都表現(xiàn)出很多優(yōu)點,但同時也具有一定的缺陷。為了彌補(bǔ)單一檢測技術(shù)的不足，研究者們將各種檢測技術(shù)如光譜技術(shù)、電化學(xué)技術(shù)、納米技術(shù)、傳感技術(shù)、電子顯微技術(shù)以及以微生物代謝為基礎(chǔ)的阻抗法等相互結(jié)合，為檢測和鑒定致病性沙門氏菌帶來了新的契機(jī)。 Kurt等[46]研究了一種將光譜學(xué)、納米技術(shù)以及傳感技術(shù)完美的結(jié)合，用于沙門氏菌檢測的雙激發(fā)傳感器。分別使用斯托克斯發(fā)光的核酸適配體功能化的量子點和反斯托克斯發(fā)光的上轉(zhuǎn)換納米粒子，結(jié)合核酸適配體功能化的發(fā)光納米粒子和磁珠，構(gòu)成與部分核酸序列互補(bǔ)的短DNA序列，促進(jìn)用于熒光測定的游離物的結(jié)合。紫外可見光譜、圓二色光譜、動態(tài)光散射和聚丙烯酰胺凝膠電泳等技術(shù)檢測了核酸適體的特性。將這種靶向特異性發(fā)光共軛物用于食源性致病菌如鼠傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等的多重檢測。此方法中鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的檢測限分別為28、16 cfu/mL。通過使用更大數(shù)目的量子點和非重疊熒光發(fā)射的上轉(zhuǎn)換納米粒子，上述方法可能實現(xiàn)多種分析物的同時檢測。這是將光譜學(xué)、納米技術(shù)以及傳感技術(shù)完美結(jié)合用于沙門氏菌檢測的一種新型技術(shù)，有效地多次利用檢測光譜，避免檢測物之間的信號干擾，另外，特異性靶向的DNA核酸序列的使用，更是提高了方法的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。 Jia等[47]結(jié)合納米技術(shù)、電子顯微技術(shù)及電化學(xué)阻抗譜等技術(shù)于一體，開發(fā)了一種用于快速、準(zhǔn)確檢測沙門氏菌的生物傳感器。將氧化還原石墨烯的納米復(fù)合材料(rGO)和羧基改性的多壁碳納米管(MWCNTs)直接電化學(xué)固定在玻碳電極表面，針對沙門氏菌的氨基修飾的特異性核酸適配體與rGO-MWCNT通過酰胺鍵共價結(jié)合。通過透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡來觀察描述rGO-MWCNT的形態(tài)，循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗譜被用來監(jiān)測裝配的全過程。當(dāng)樣品中含有沙門氏菌時，沙門氏菌可與抗沙門氏菌的核酸適配體結(jié)合阻斷電流，電阻大幅度增大，該信號由納米復(fù)合材料捕捉并放大。此裝置可實現(xiàn)沙門氏菌的量化檢測，檢測范圍為75～7.5×105cfu/mL，檢測限為25 cfu/mL，檢測時間為1 h。該傳感器可免除樣品前處理和菌體富集過程，是一個高選擇性、特異性強(qiáng)、靈敏、快速的沙門氏菌檢測傳感器。

2 展 望

隨著人們對沙門氏菌關(guān)注度的提高，沙門氏菌檢測技術(shù)和方法也得到了不斷的發(fā)展，傳統(tǒng)生化檢測法、免疫學(xué)檢測法、分子生物學(xué)檢測法是最常用的檢測技術(shù)。其中以生化培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)檢測方法仍然是美國食品和藥品管理局(FDA)、美國農(nóng)業(yè)部(USDA)、國際官方分析化學(xué)家協(xié)會(AOAC)、國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)認(rèn)可的沙門氏菌檢測金標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)檢測方法的檢測成本低，對檢測試驗的硬件條件要求低，是之后各種檢測方法的基礎(chǔ)，并且目前仍被用于判定各種檢測方法的有效性。但其操作過程復(fù)雜，費時耗力，不能及時給出食品安全性評價，是在食品安全檢測中注定要被逐漸淘汰的檢測方法。免疫學(xué)檢測方法，靈敏度高，檢測速度相對較快，尤其是以ELISA為基礎(chǔ)的免疫檢測試劑盒法應(yīng)用，使沙門氏菌的檢測更加經(jīng)濟(jì)、高效、易于操作，但是靈敏度偏低，對設(shè)備、技術(shù)人員有一定要求，并且檢測效果過多依賴一抗的質(zhì)量，實際中一抗的制作本身就是一個耗時費力的工作，且目前沒有能夠結(jié)合所有沙門氏菌血清型的單克隆抗體作為檢測抗體，檢測范圍有限?，F(xiàn)代分子生物學(xué)檢測技術(shù)快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異性較強(qiáng)，但對設(shè)備、技術(shù)人員、環(huán)境要求較高，難以在基層普及推廣。

每一種檢測技術(shù)都有一定的優(yōu)缺點，目前較多新型的沙門氏菌檢測方法，是將兩種或兩種以上的方法結(jié)合使用，取長補(bǔ)短。且隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，尤其是一些新型的材料如納米材料，新的沙門氏菌檢測技術(shù)如傳感技術(shù)等與沙門氏菌常規(guī)檢測方法的結(jié)合，使得沙門氏菌檢測技術(shù)與方法迅猛發(fā)展，但是目前大部分新型檢測技術(shù)，由于成本昂貴、技術(shù)要求較高或推廣力度不足等問題僅僅停留在實驗室或者少部分大型食品公司使用等階段。相信在不久的將來，會有更多的靈敏度高、特異性強(qiáng)、快捷精準(zhǔn)、效果穩(wěn)定并且成本較低、易于推廣普及的沙門氏菌檢測技術(shù)出現(xiàn)并應(yīng)用于龐大的中國食品工業(yè)，更好地預(yù)防與控制沙門氏菌病的發(fā)生。

[1] Melo A M A, Alexandre D L, Furtado R F, et al. Electrochemical immunosensors forSalmonelladetection in food[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2016，100(12):pp5301-5312.

[2] Malorny B, Huehn S, Dieckmann R, et al. Polymerase chain reaction for the rapid detection and serovar identification ofSalmonellain food and feeding stuff[J]. Food Analytical Methods, 2009, 2(2): 81-95.

[3] 梁智安. 淺談對食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)檢驗方法的理解與應(yīng)用[J]. 科技信息,2011,(4):37-38.

[4] Abdelhaseib M U, Singh A K, Bailey M, et al. Fiber optic and light scattering sensors: Complimentary approaches to rapid detection ofSalmonellaentericain food samples[J]. Food Control, 2016, (61): 135-145.

[5] 任防振,徐國勛. 兼氧/好氧膜生物反應(yīng)器處理食品廢水研究[J]. 上海理工大學(xué)學(xué)報,2007,(3):285-288,293.

[6] Kokkinos P A, Ziros P G, Bellou M, et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for the detection ofSalmonellain food[J]. Food Analytical Methods, 2014, 7(2): 512-526.

[7] WHO.World Health Day 2015: From farm to plate, make food Safe.http://www.who.int/campaigns/world-health-day/2015/en/.2015

[8] 王利剛,夏永鵬,張磊,等. 食品中致病菌的風(fēng)險監(jiān)測預(yù)警概述[J]. 食品與發(fā)酵科技,2015,51(6):73-76.

[9] ISO6579: 2002 食品和動物飼料的微生物學(xué) 沙門氏菌檢測的水平方法[S]. 2002.

[10] 中華人民共和國衛(wèi)生部.GB4789.4-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗[S]. 2010.

[11] 伍燕華,牛瑞江,賴衛(wèi)華,等. 雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測沙門氏菌[J]. 食品工業(yè)科技,2014,35(10):62-65.

[12] 陳金頂,索青利,廖明,等. 沙門氏菌的invA基因序列分析與分子檢測[J]. 中國人獸共患病雜志,2004,20(10):868-871.

[13] 劉知奇,周勇,張健,等. 雞白痢的診斷與防治研究概況[J]. 中國畜牧獸醫(yī)文摘,2013,(6):119-120.

[14] 黃文宇,柳陳堅. 食源性沙門氏菌檢測方法的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù),2009,19(3):95-97.

[15] 劉喆,張書蕭,王少輝,等. 沙門氏菌的檢測技術(shù)進(jìn)展[J]. 中國動物傳染病學(xué)報,2012,20(2):81-86.

[16] 孫園園, 趙鵬, 劉駿,等. 沙門氏菌檢測方法研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2011, 38(1):218-221.

[17] 張萍, 馮芳. 沙門氏菌的檢測技術(shù)和方法的研究進(jìn)展[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報, 2015，(5): 1834-1841.

[18] 劉佩紅, 屠益平, 徐鋒, 等. 沙門氏菌檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2006，(6): 2-3.

[19] Bang J, Shukla S, Kim Y H, et al. Development of indirect competitive ELISA for the detection ofSalmonellatyphimurium[J]. Romanian Biotechnological Letters, 2012, 17(2): 7194-7204.

[20] 朱春紅. 腸炎沙門氏菌SEF14菌毛功能探索[D].揚州：揚州大學(xué),2010.

[22] 劉細(xì)霞, 涂俊銘. 免疫磁珠分離技術(shù)及其在食源性致病菌檢測中應(yīng)用的進(jìn)展[J]. 中國抗生素雜志, 2014, 39(12): 956-960.

[23] Herzig G P D, Aydin M, Dunigan S, et al. Magnetic Bead-Based Immunoassay Coupled with Tyramide Signal Amplification for Detection of Salmonella in Foods[J]. Journal of Food Safety, 2016,36(3):1395-1401.

[24] Pandey S K, Vinayaka A C, Rishi D B, et al. Immuno-fluorescence based Vi capsular polysaccharide detection for specific recognition of Salmonella enterica serovar Typhi in clinical samples[J]. Analytica chimica acta, 2014, (841): 51-57.

[25] 楊柳,胡文忠,姜愛麗,等. 分子生物學(xué)方法檢測沙門氏菌的研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2016,37(9):372-375,379.

[26] 朱珠,王永,蘭青闊,等. 應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)快速檢測食品中沙門氏菌[J]. 食品科學(xué),2013,34(2):182-186.

[27] Malorny B, Huehn S, Dieckmann R, et al. Polymerase chain reaction for the rapid detection and serovar identification ofSalmonellain food and feeding stuff[J]. Food Analytical Methods, 2009, 2(2): 81-95.

[28] Delibato E, Rodriguez-Lazaro D, Gianfranceschi M, et al. European validation of Real-Time PCR method for detection ofSalmonellaspp. in pork meat[J]. International journal of food microbiology, 2014, 184(4):134-138.

[29] Alves J, Hirooka E Y, de Oliveira T C R M. Development of a multiplex real-time PCR assay with an internal amplification control for the detection ofCampylobacterspp. andSalmonellaspp. in chicken meat[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 72:175-181.

[30] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic acids research, 2000, 28(12): e63-e63.

[31] Bapanpally C, Maganty G, Khan S, et al. Immunomagnetic Separation and Visual Fluorescence Detection ofSalmonellaspp., Using AOAC Approved SASTM Molecular Tests[J]. Journal of AOAC International, 2014, 97(4): 1067-1072.

[32] Li J, Zhai L, Bie X, et al. A novel visual loop-mediated isothermal amplification assay targeting gene62181533 for the detection ofSalmonellaspp. in foods[J]. Food Control, 2016, (60): 230-236.

[33] Abirami N, Nidaullah H, Chuah L O, et al. Evaluation of commercial loop-mediated isothermal amplification based kit and ready-to-use plating system for detection ofSalmonellain naturally contaminated poultry and their processing environment[J]. Food Control, 2016,70:74-78.

[34] Loff M, Mare L, de Kwaadsteniet M, et al. 3MTMMolecular Detection system versus MALDI-TOF mass spectrometry and molecular techniques for the identification ofEscherichiacoli0157: H7,Salmonellaspp. &Listeriaspp[J]. Journal of microbiological methods, 2014, 101(7): 33-43.

[35] Schraft H, Watterworth L A. Enumeration of heterotrophs, fecal coliforms and Escherichia coli in water: comparison of 3MTMPetrifilmTMplates with standard plating procedures[J]. Journal of microbiological methods, 2005, 60(3): 335-342.

[36] 許俊鋼. 基因芯片快速檢驗細(xì)菌的臨床應(yīng)用[J]. 中國實用醫(yī)藥,2016,(1):33-34.

[37] 祝儒剛,李拖平,宋立峰. 應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測肉及肉制品中5種致病菌[J]. 食品科學(xué),2012,33(14):211-215.

[38] Li Y. Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens[J]. Analytical Sciences, 2016, 32(2): 215-218.

[39] Oh J H, Park M K. Immunosensors combined with a light microscopic imaging system for rapid detection of Salmonella[J]. Food Control, 2016, 59:780-786.

[40] Sheikhzadeh E, Chamsaz M, Turner A P F, et al. Label-free impedimetric biosensor forSalmonellaTyphimurium detection based on poly [pyrrole-co-3-carboxyl-pyrrole] copolymer supported aptamer[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2016,80:194-200.

[41] Fei J, Dou W, Zhao G. A sandwich electrochemical immunosensor for Salmonella pullorum andSalmonellagallinarum based on a screen-printed carbon electrode modified with an ionic liquid and electrodeposited gold nanoparticles[J]. Microchimica Acta, 2015, 182(13-14): 2267-2275.

[42] Duncan T V. Applications of nanotechnology in food packaging and food safety: barrier materials, antimicrobials and sensors[J]. Journal of colloid and interface science, 2011, 363(1): 1-24.

[43] Kurt H, Yüce M, Hussain B, et al. Dual-excitation upconverting nanoparticle and quantum dot aptasensor for multiplexed food pathogen detection[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2016,81:280-286.

[44] Kim G, Moon J H, Moh C Y, et al. A microfluidic nano-biosensor for the detection of pathogenicSalmonella[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2015, 67: 243-247.

[45] Liu X, Hu Y, Zheng S, et al. Surface plasmon resonance immunosensor for fast, highly sensitive, and in situ detection of the magnetic nanoparticles-enrichedSalmonellaenteritidis[J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2016, 230: 191-198.

[46] Kurt H, Yüce M, Hussain B, et al. Dual-excitation upconverting nanoparticle and quantum dot aptasensor for multiplexed food pathogen detection[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2016, 81:280-286.

[47] Jia F, Duan N, Wu S, et al. Impedimetric salmonella aptasensor using a glassy carbon electrode modified with an electrodeposited composite consisting of reduced graphene oxide and carbon nanotubes[J]. Microchimica Acta, 2016, 183(1): 337-344.

AdvancesinSalmonellaDetectionTechniques

LI Jie1, DING Cheng-chao1, ZHAI Xu-zhao1, WANG Guang-bin2, LIU Wu-kang1, ZENG Hai-juan1, WANG Shu-juan1, SUN Jing-juan1, DONG Qing-li1, LIU Qing1

(1.Schl.ofMed.Instrum't&FoodEngin.,Uni.ofShanghaiforSci. &Technol.,Shanghai200093; 2.XuzhouGreen&HealthyDairyDrinksLtd.Co.,Xuzhou221006)

Salmonellais a common pathogen shared by human and animals which can not only cause animal typhoid, cholera, but also lead to human gastroenteritis, septicaemia, and it is a serious threat to life and health of human and animals.Salmonellais the main reason that highly causes foodborne diseases among all the food safety events. Therefore, rapid and accurate detection ofSalmonellain food is an important means to prevent and control the disease. With the rapid development of biology, chemistry, physics and other subjects, the detection technology ofSalmonellahas been developed from the traditional isolation and biochemical identification, to the immunology, molecular biology, electrochemistry, sensors, bio-chips and so on, especially in recent years, the combined uses of those methods with nanotechnology, spectroscopy, mass spectrometry and metabolomics, providing many new methods for the detection ofSalmonella. Various detection methods and analyses of futureSalmonelladetection technology, and the tendency of the development based on a large number of latest domestic and foreign research reports were summarized in this paper.

Salmonella; human and animal pathogens; food safety; detection technology; research progress

“科技創(chuàng)新行動計劃” 長三角科技聯(lián)合攻關(guān)領(lǐng)域項目(15395810900)；市級橫向項目一“乳制品生產(chǎn)體系致病

李杰 女，碩士研究生。研究方向為食源性致病菌致病機(jī)理研究及檢測。E-mail:13569416654@163.com

* 通訊作者。男，教授，博士，博士生導(dǎo)師。研究方向為食源性致病菌致病機(jī)理及快速檢測技術(shù)。E-mail：liuq@usst.edu.cn

2016-11-26；

2016-12-25

Q93-332

A

1005-7021(2017)04-0126-07

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.019