水平基因轉(zhuǎn)移介導(dǎo)抗菌素耐藥性傳播機(jī)制的研究進(jìn)展

藍(lán)惠華， 張 玲， 王厚照

(廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院 檢驗(yàn)科，福建 廈門 361003)

水平基因轉(zhuǎn)移介導(dǎo)抗菌素耐藥性傳播機(jī)制的研究進(jìn)展

藍(lán)惠華， 張 玲， 王厚照*

(廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院 檢驗(yàn)科，福建 廈門 361003)

近幾十年來(lái)，病原菌耐藥性的出現(xiàn)和蔓延已上升為嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題。越來(lái)越多研究表明，抗菌素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)不僅僅見(jiàn)于臨床所分離的病原體，而是包括所有的致病菌、共生菌以及環(huán)境中的細(xì)菌，它們都能在可移動(dòng)遺傳元件和噬菌體的作用下，通過(guò)水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer，HGT)途徑獲得耐藥性，進(jìn)而形成抗菌素耐藥基因簇(耐藥基因組)。HGT可導(dǎo)致抗菌素的耐藥性在環(huán)境共生菌和病原菌之間傳播擴(kuò)散，這可通過(guò)臨床上一些重要的抗菌素耐藥基因的傳播證實(shí)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為HGT的三種機(jī)制中，接合對(duì)ARGs的傳播影響最大，最近研究表明轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)ARGs播散起到不可忽視的作用。通過(guò)深入了解耐藥基因組的傳播及其在動(dòng)員病原菌耐藥中發(fā)揮的作用，對(duì)于控制這些基因的播散是至關(guān)重要的。將討論耐藥基因組的概念，提供臨床相關(guān)的抗菌素抗性基因水平基因轉(zhuǎn)移的例子，對(duì)當(dāng)前已研究的促使抗菌素耐藥性傳播的各種HGT機(jī)制進(jìn)行回顧。

抗菌素抗性；耐藥基因組；轉(zhuǎn)化；接合；轉(zhuǎn)導(dǎo)；基因水平轉(zhuǎn)移

人類病原體感染中細(xì)菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，限制了對(duì)細(xì)菌感染的治療方案，從而降低了臨床療效，同時(shí)增加治療費(fèi)用和死亡率。細(xì)菌耐藥性問(wèn)題逐年加重，新藥研發(fā)的速度遠(yuǎn)跟不上其耐藥速度，有必要更合理應(yīng)用抗生素，以延緩或避免耐藥菌株的產(chǎn)生和擴(kuò)散。天然抗生素已存在了數(shù)十億年，是微生物在生長(zhǎng)過(guò)程中為了生存競(jìng)爭(zhēng)需要而產(chǎn)生的，可保證其自身生存，同時(shí)還可殺滅或抑制其他細(xì)菌。同樣，通過(guò)研究古代凍土樣本[1]以及孤立的洞穴微生物[2]可證明各種抗菌素耐藥基因的存在，并證實(shí)在史前時(shí)期已經(jīng)生成了抗菌素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)?？咕啬退幍漠a(chǎn)生可通過(guò)突變或水平基因轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因，后者被認(rèn)為是目前抗菌素耐藥性廣泛流行的最重要因素。HGT介導(dǎo)的ARGs的產(chǎn)生也遠(yuǎn)早于人類抗生素的生產(chǎn)和使用。例如，在數(shù)百萬(wàn)年前就存在的OXA型β-內(nèi)酰胺酶基因被發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)，并能夠在細(xì)菌之間進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移[3]。然而，由于人類抗菌素的濫用，耐藥菌株的數(shù)量在過(guò)去的幾十年里大大增加，抗菌素耐藥性現(xiàn)狀令人擔(dān)憂，本文描述了抗菌素抗性產(chǎn)生的背景，并重點(diǎn)闡述了水平基因轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)抗菌素耐藥基因傳播的作用。

1 抗菌素選擇壓力及抗菌素抗性儲(chǔ)備

抗菌素的發(fā)現(xiàn)對(duì)醫(yī)學(xué)界產(chǎn)生了巨大的影響，其大規(guī)模的生產(chǎn)和消耗普遍影響了微生物生態(tài)系統(tǒng)。Van Boeckel等[4]研究表明，全球人類抗菌素消耗量逐年上升，細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可產(chǎn)生耐藥性突變，在抗菌素使用量不斷增加的選擇壓力下，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生并擴(kuò)散?？咕卦卺t(yī)藥、農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖的使用和濫用引起環(huán)境中耐藥菌的不斷出現(xiàn)?？咕貧埩魧?dǎo)致其使用的影響進(jìn)一步擴(kuò)大，耐藥性細(xì)菌和耐藥遺傳元件隨后可蔓延到相鄰的環(huán)境中。大多數(shù)的抗菌素以原型排泄，然后直接或通過(guò)廢液進(jìn)入環(huán)境。垃圾以及污水處理廠，被認(rèn)為是細(xì)菌耐藥性的傳播熱點(diǎn)，因?yàn)槟退幓?、可移?dòng)遺傳元件(mobile genetic elements，MGEs)在抗菌素選擇壓力下可從各方面?zhèn)鞑サ焦采筒≡衃5]。Larsson等[6]研究顯示，在印度污水處理工廠的藥品生產(chǎn)處取水，發(fā)現(xiàn)了其直接接觸的表層、地面和該地區(qū)的飲用水等環(huán)境中含有非常高水平的抗菌素?？咕剡x擇壓力的增加已經(jīng)改變細(xì)菌HGT途徑[7]，使得多重耐藥菌株不僅在處理廠內(nèi)常見(jiàn)，在附近的河流沉積物中也檢測(cè)出高水平的ARGs和MGEs。

為了解抗菌素耐藥性的傳播，有必要勘查不同環(huán)境中的耐藥基因組，闡明這些環(huán)境變成細(xì)菌性病原體ARGs儲(chǔ)存?zhèn)鞑ッ浇榈木売伞＝鼛啄?，該領(lǐng)域的相關(guān)研究引起研究者極大的興趣，很多實(shí)驗(yàn)室采用各種技術(shù)抽樣檢測(cè)調(diào)查環(huán)境中的耐藥基因組，當(dāng)然該類研究不僅僅限于自然環(huán)境，還包括人和動(dòng)物的腸道菌群[8-10]。 通過(guò)檢測(cè)可以明確臨床相關(guān)的抗生素抗性基因是否廣泛存在于所監(jiān)測(cè)的環(huán)境中[11]。采用宏基因組學(xué)方法直接提取生物樣品中所有微生物的DNA進(jìn)行研究，用于微生物生態(tài)系統(tǒng)的耐藥基因組的調(diào)查，這可避免因單純選擇某些微生物而引起的偏差。對(duì)各種環(huán)境中提取的宏基因組進(jìn)行測(cè)序，能夠得到了大量的公開(kāi)可用的數(shù)據(jù)。這些龐大的數(shù)據(jù)組成的數(shù)據(jù)庫(kù)可以挖掘各種耐藥基因的存在。例如，從宏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘出質(zhì)粒介導(dǎo)的多粘菌素耐藥基因MCR-1，最近在國(guó)內(nèi)臨床病人腸道病原菌及共生菌株中研究發(fā)現(xiàn)[12]，表明這種基因已經(jīng)在我國(guó)人類腸道微生物中出現(xiàn)并蔓延。

雖然在已知序列基礎(chǔ)上的深入研究已為我們提供了大量的數(shù)據(jù)，但針對(duì)預(yù)測(cè)的已知基因或功能的高同源性新序列的研究還是相當(dāng)有限的。利用宏基因組學(xué)的研究將確定新的ARGs，越來(lái)越多的研究揭示了大量未知的ARGs出現(xiàn)在土壤[13]或活性污泥[14]、以及動(dòng)物[15]和人類[16]的菌群中。最近關(guān)于基因研究[17]也發(fā)現(xiàn)ARGs在生態(tài)中主要呈聚類分布，這意味著在土壤和污水處理廠中的耐藥基因組，與人類病原體中的耐藥基因組顯著不同，盡管如此，研究者發(fā)現(xiàn)其中部分耐藥基因組是類似的，并強(qiáng)調(diào)了對(duì)這類環(huán)境中的耐藥基因組進(jìn)行持續(xù)的探索的重要性。

blaCTX-M基因已成為全球腸桿菌科超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)流行的最常見(jiàn)原因和臨床治療問(wèn)題的主要原因[18]，因其與抗壞血酸克呂沃爾菌染色體AmpC酶具有高度同源性而推測(cè)其來(lái)源于AmpC酶[19]，可在不同種類的細(xì)菌菌屬中傳播。來(lái)源于海藻希瓦菌喹諾酮類藥物的耐藥性，被發(fā)現(xiàn)源于其質(zhì)粒編碼的qnrA基因[20]。而不同弧菌科細(xì)菌可能是質(zhì)粒編碼的其他qnr基因的儲(chǔ)庫(kù)[21]，可在全球范圍內(nèi)各種腸桿菌科細(xì)菌中傳播，在某些領(lǐng)域有非常高的患病率。碳青霉烯類抗生素水解的OXA-48型β-內(nèi)酰胺酶基因在世界范圍內(nèi)腸道菌屬中報(bào)道的越來(lái)越多，也發(fā)現(xiàn)是來(lái)源于環(huán)境希瓦氏菌菌屬[22]。由此可見(jiàn)，許多臨床相關(guān)耐藥基因被認(rèn)為是來(lái)源于非致病性細(xì)菌，突出水平基因轉(zhuǎn)移在病原菌抵抗抗菌素中的巨大作用。

2 水平基因轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)抗菌素耐藥基因傳播的作用

2.1接合

接合，又稱結(jié)合作用，是通過(guò)性菌毛互相溝通，將遺傳物質(zhì)(主要是質(zhì)粒DNA)從供體菌轉(zhuǎn)移給受體菌，通過(guò)供體菌和受體菌完整細(xì)胞間的直接接觸而傳遞大段DNA的遺傳重組現(xiàn)象。這種現(xiàn)象由Joshua Lederberg和Edward Tatum于1946年在大腸埃希菌K12株中發(fā)現(xiàn)的，是基因水平轉(zhuǎn)移機(jī)制中最常見(jiàn)的研究。ARGs在許多情況下與接合元件如質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)座子相關(guān)。雖然這些元件的轉(zhuǎn)移也可能通過(guò)轉(zhuǎn)換或轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生，接合通常被認(rèn)為是最有可能的主要機(jī)制。這是因?yàn)樗绒D(zhuǎn)化提供了更好的保護(hù)周圍環(huán)境以及更有效的方法進(jìn)入宿主細(xì)胞，通常比噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)有一個(gè)更廣泛的宿主范圍?？咕啬退庂|(zhì)粒在人類病原體的傳播可以在不同的菌株、菌種間甚至屬間迅速蔓延。blaCTX-M 型ESBL基因就是很好的例子，它可傳播給各種具有局部和廣泛宿主范圍的質(zhì)粒，包括在大腸埃希菌以及其他人類的條件致病菌中。這些基因在人類、動(dòng)物和環(huán)境中無(wú)處不在。此外，病原菌中質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了眾多抗菌素耐藥基因編碼的對(duì)β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類藥物和許多其他類藥物的耐藥性在全球廣泛傳播[23]。尤其值得關(guān)注的是，關(guān)于質(zhì)粒攜帶碳青霉烯類抗生素耐藥傳播[24]越來(lái)越多，另外，最新國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒編碼的多粘菌素耐藥[12]的報(bào)道逐漸增多，歐洲[25]等也有相關(guān)的報(bào)道，這些可能導(dǎo)致真正的泛耐藥腸桿菌科細(xì)菌的形成。此外，多個(gè)ARGs往往是同時(shí)定位在相同的質(zhì)粒上，這使得多重耐藥相對(duì)更容易傳播。

2.2轉(zhuǎn)化

受體細(xì)菌通過(guò)直接吸收來(lái)自供體細(xì)菌或人工重組的含有特定基因的DNA片段，從而獲得相應(yīng)遺傳性狀，這種現(xiàn)象稱為細(xì)菌轉(zhuǎn)化，這是1928年英國(guó)學(xué)者在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)的。細(xì)菌轉(zhuǎn)化的過(guò)程是一個(gè)DNA導(dǎo)入和表達(dá)的過(guò)程。很明顯，細(xì)菌可以利用轉(zhuǎn)化作用轉(zhuǎn)移交換抗菌素耐藥基因，從而引起細(xì)菌多重耐藥的產(chǎn)生。1951年，Hotchkiss[26]把肺炎鏈球菌敏感菌株暴露在耐藥菌株的DNA中，誘導(dǎo)其青霉素和鏈霉素耐藥。Alexander等[27]進(jìn)一步研究顯示鏈霉素耐藥性在流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌和豬嗜血菌之間種內(nèi)或種間的轉(zhuǎn)移。

轉(zhuǎn)化的發(fā)生必須滿足以下條件：細(xì)胞外環(huán)境必須有DNA存在；受體菌必須具有轉(zhuǎn)化的能力；轉(zhuǎn)運(yùn)的DNA必須是穩(wěn)定的，通過(guò)整合轉(zhuǎn)到受體基因組，或直接導(dǎo)入受體菌中(質(zhì)粒DNA)。奈瑟氏菌屬具有這種轉(zhuǎn)化能力，其他種類的細(xì)菌可能只在一定條件下，如多肽類或誘導(dǎo)劑、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)或其他壓力條件，才能夠自然轉(zhuǎn)化[28]。研究表明[29]，抗生素的使用可誘導(dǎo)許多細(xì)菌的轉(zhuǎn)化作用，這意味著抗生素不僅會(huì)選擇耐藥菌株，也激發(fā)了它們的ARGs轉(zhuǎn)化。體外實(shí)驗(yàn)也闡明了ARGs的轉(zhuǎn)化作用。早期的研究顯示ARGs可以發(fā)生轉(zhuǎn)化，為此，鏈霉素、利福平、紅霉素、萘啶酸和卡那霉素的耐藥性在淋病奈瑟菌、芽胞桿菌、輸卵管炎和肺炎鏈球菌等不同細(xì)菌中轉(zhuǎn)化。分子技術(shù)的引入可識(shí)別轉(zhuǎn)化中的ARGs。體外研究表明，parC和gyrA基因參與了肺炎鏈球菌和草綠色鏈球菌氟喹諾酮類抗生素耐藥基因的轉(zhuǎn)化[30]，penA基因參與了共生奈瑟菌和腦膜炎奈瑟菌青霉素耐藥的轉(zhuǎn)化[31]。

分子生物學(xué)技術(shù)使體外實(shí)驗(yàn)尋找轉(zhuǎn)化的證據(jù)成為可能。Spratt等確定青霉素結(jié)合蛋白基因(penA)突變是造成淋球菌臨床分離株對(duì)青霉素耐藥的原因[32]，基因序列分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)含有鑲嵌狀penA基因的結(jié)構(gòu)，阻礙了同源性敏感型penA基因的擴(kuò)散。這類“抗性阻力”可分離自沒(méi)有抗生素年代的共生菌中，表明這些共生菌可能是青霉素耐藥性無(wú)處不在的緣由[33]。當(dāng)外源基因被整合到受體基因組中時(shí)，就形成了嵌合基因，這是轉(zhuǎn)化的一種情況[34]。在鏈球菌中，鑲嵌的青霉素結(jié)合蛋白(PBP)基因編碼的PBPs使β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力下降，是青霉素耐藥基因在相關(guān)物種的轉(zhuǎn)移結(jié)果，并可在各種鏈球菌間傳播青霉素耐藥基因[35]。對(duì)氟喹諾酮類抗菌素耐藥的研究已經(jīng)表明，parC、parE和gyrA基因的嵌合體變種比較容易在肺炎鏈球菌、輕型鏈球菌和口腔鏈球菌之間[36]及化膿性鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌之間[37]轉(zhuǎn)化。在特定的環(huán)境中，可通過(guò)轉(zhuǎn)化作用，細(xì)胞外的DNA攜帶更大的基因信息而成為一個(gè)大型基因儲(chǔ)備庫(kù)。此外，Domingues等[38]證明MGEs，如轉(zhuǎn)座子、整合子和基因盒可在物種之間有效傳播，而與它們基因水平無(wú)關(guān)。同樣，鏈球菌屬已被證明除了接合外還可通過(guò)轉(zhuǎn)化交換接合轉(zhuǎn)座子[39]。所有這一切表明，在不同物種之間，轉(zhuǎn)化提供了一個(gè)廣泛的水平傳播耐藥元件的能力。

2.3轉(zhuǎn)導(dǎo)

噬菌體對(duì)于細(xì)菌微生物在任何環(huán)境中的塑造起著重要的作用。噬菌體可通過(guò)局限性或普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移有利于微生物宿主的基因，進(jìn)而促進(jìn)自身的生存和傳播?？赊D(zhuǎn)移的DNA序列包括染色體DNA 和MGEs，如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子及基因組島。通過(guò)噬菌體動(dòng)員或轉(zhuǎn)移ARGs已在不同種類的細(xì)菌中證實(shí)：紅霉素、四環(huán)素耐藥或多重耐藥在化膿性鏈球菌菌株之間的傳導(dǎo)[40]；四環(huán)素和慶大霉素耐藥在腸球菌之間的轉(zhuǎn)移；噬菌體攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因[41]在大腸埃希菌和沙門氏菌間轉(zhuǎn)移；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)中抗生素耐藥性質(zhì)粒[42]的轉(zhuǎn)移。

最近采用宏基因組學(xué)的方法從各種環(huán)境抽樣檢查的研究，可見(jiàn)噬菌體在ARGs的傳播中的作用尤為重要。Colomer-Lluch等[43]用熒光定量PCR的方法檢測(cè)河流和城市污水樣本，表明β-內(nèi)酰胺類ARGs中的blaTEM基因、blaCTX基因和mecA基因存在于噬菌體中；此外，將噬菌體DNA導(dǎo)入氨芐西林敏感的大腸桿菌宿主中繁殖，可產(chǎn)生具有抗性的轉(zhuǎn)化子，包含了blaTEM基因，blaCTX-M基因，或未確定的ARGs。Modi等[44]證明，抗生素的應(yīng)用增加了老鼠腸道噬菌體ARGs的數(shù)量，促進(jìn)了噬菌體和細(xì)菌之間的相互作用，基于前面討論的環(huán)境抗生素暴露的增加這是一個(gè)重要的觀察。此外，在動(dòng)物和人類的糞便樣本、來(lái)自污水處理廠的廢水和污泥、醫(yī)院污水處理廠廢水等樣本中，使用實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)樣本中噬菌體的ARGs，表明噬菌體是ARGs的重要儲(chǔ)存庫(kù)[10，45-47]。有研究報(bào)道[48]，從雞肉分離噬菌體，發(fā)現(xiàn)約1/4的隨機(jī)分離的噬菌體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)一種或多種抗生素耐藥基因到大腸埃希菌宿主中。此外，他們發(fā)現(xiàn)噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)卡那霉素ARGs和耐卡那霉素大腸埃希菌菌株之間存在顯著的相關(guān)關(guān)系，這意味著此機(jī)制在AMR傳播的一個(gè)可能作用?？紤]某些噬菌體已報(bào)告具有廣泛的宿主范圍，跨越不同物種甚至不同種別之間，通過(guò)大量的觀察，在各種細(xì)菌群落和環(huán)境中檢測(cè)細(xì)菌噬菌體攜帶的ARGs，提供了轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)微生物生態(tài)系統(tǒng)中ARGs的傳播作用的新見(jiàn)解。

3 小 結(jié)

在醫(yī)療和農(nóng)業(yè)需求的驅(qū)動(dòng)下，抗菌素耐藥水平的增高是前所未有的，破壞了微生物與抗菌素之間的自然平衡。這對(duì)微生物群落的影響極其廣泛，也越來(lái)越明顯地威脅著人類的醫(yī)療衛(wèi)生，同時(shí)抵抗所有已知的在全球范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用的抗生素。此類研究不只局限于臨床醫(yī)療環(huán)境，還囊括了全世界各地的不同生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)，獲得很多抗菌素和耐藥性之間的相互作用相關(guān)的知識(shí)并為人類提供了寶貴的見(jiàn)解。目前抗菌素耐藥問(wèn)題的愈發(fā)嚴(yán)重，而微生態(tài)系統(tǒng)是抗菌素耐藥基因的巨大儲(chǔ)存庫(kù)，因而繼續(xù)深入闡明微生態(tài)系統(tǒng)耐藥基因組間的傳播至關(guān)重要。

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DisseminationofAntimicrobialResistancethroughHorizontalGeneTransfer

LAN Hui-hua, ZHANG Ling, WANG Hou-zhao

(Dept.ofClin.Lab.Affil.ChenggongHosp.,XiamenUni.,Xiamen361003)

In recent decades, the emergence and spread of antibiotic resistance among pathogenic bacteria has been a rising problem of graveness for public health. More and more studies suggested that antibiotic resistance genes (ARGs) were not only encountered in clinical isolated pathogens, but all of the pathogenic bacteria, symbiotic bacteria, as well as the environment of bacteria. Under the action of the mobile genetic elements and bacteriophages, all of them were able to obtain drug resistance via the horizontal gene transfer (HGT) and then proceeded to form antibiotics resistance genes (ARG) cluster (medicine resistance genome). HGT could cause antibiotic resistance to spread among commensal bacteria in environment and pathogens, as has been proven through the spread of some clinically important ARGs. Traditional sense considered that among the three mechanisms of HGT, conjugation was thought to have the greatest influence on the spread of ARGs. And recent studies suggested that metaplasia and transduction were deemed to play a position in the dissemination of ARGs that could not be ignored.Thorough understanding the spread of the ARG and its role played in the mobilization of pathogen resistance is the most important to control the spread of these genes. Here, the concept of ARG will be discussed to provide examples of HGT of clinically related ARGs and present an overview of the current studies that have been carried out on the spread of ARGs of various HGT mechanisms that hasten to the spread of ARGs.

antibiotic resistance; ARG; metaplasia; conjugation; joint; horizontal gene transfer

福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2013D006)

藍(lán)惠華 女，主管技師，碩士。主要研究方向?yàn)榕R床微生物學(xué)與免疫。E-mail:lanhuihua2010@sina.com

* 通訊作者。男，副主任技師。主要研究方向?yàn)槲⑸锱c免疫。E-mail:wanghouzhao@126.com

2016-10-12；

2016-10-22

Q93

A

1005-7021(2017)04-0093-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.04.014