堿脅迫下燕麥幼苗對(duì)外源過(guò)氧化氫的生理響應(yīng)

劉建新，王金成，劉秀麗，李博萍

(甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅慶陽(yáng) 745000)

堿脅迫下燕麥幼苗對(duì)外源過(guò)氧化氫的生理響應(yīng)

劉建新，王金成，劉秀麗，李博萍

(甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，甘肅慶陽(yáng) 745000)

為探討過(guò)氧化氫(H2O2)對(duì)堿脅迫下植物的生理調(diào)節(jié)作用，以燕麥品種定莜6號(hào)的幼苗為材料，采用沙培方法，設(shè)置0、50和150 μmol·L-1三個(gè)H2O2濃度水平，研究了外源H2O2對(duì)100 mmol·L-1NaHCO3脅迫下燕麥葉片活性氧代謝、滲透溶質(zhì)積累和幼苗生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，NaHCO3脅迫下，與不添加H2O2處理(0 μmol·L-1)相比，50和150 μmol·L-1H2O2處理均不同程度降低了燕麥葉片超氧陰離子、H2O2、丙二醛、可溶性糖含量和細(xì)胞質(zhì)膜的相對(duì)透性，明顯提高可溶性蛋白質(zhì)、脯氨酸和類胡蘿卜素含量及葉綠素a/b值。 NaHCO3脅迫下，50 μmol·L-1H2O2處理的燕麥葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性和谷胱甘肽(GSH)含量下降，過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性及抗壞血酸(AsA)含量提高；150 μmol·L-1H2O2處理則提高了SOD、POD、APX活性和AsA含量，降低了CAT活性，對(duì)GSH含量無(wú)明顯影響。50 μmol·L-1H2O2顯著緩解了NaHCO3脅迫對(duì)燕麥幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，150 μmol·L-1H2O2的緩解效應(yīng)不明顯。

過(guò)氧化氫；燕麥；堿脅迫；活性氧代謝；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)是生物細(xì)胞應(yīng)答各種逆境脅迫的一種信號(hào)分子[8]，它參與調(diào)控脫落酸誘導(dǎo)的擬南芥(Arabidopsisthaliana)氣孔關(guān)閉過(guò)程[9]。外源H2O2處理能夠緩解干旱脅迫誘導(dǎo)的活性氧積累對(duì)黃瓜(Cucumissativus)葉綠體膜的傷害[10]；提高玉米(Zeamays)的耐鹽性[11]；并通過(guò)調(diào)節(jié)多磷酸肌醇激酶基因 VvIPK2表達(dá)，參與葡萄(Vitis)低溫脅迫響應(yīng)[12]；提高水稻(Oryzasativa)鎘脅迫耐性[13]。外源H2O2能否提高植物耐堿性？目前鮮見(jiàn)這方面的報(bào)道。本研究以燕麥品種定莜6號(hào)的幼苗為材料，檢測(cè)施加H2O2后其葉片活性氧代謝、滲透溶質(zhì)積累等生理指標(biāo)的變化，探討堿脅迫下燕麥幼苗對(duì)外源H2O2的生理響應(yīng)，以期為燕麥耐堿栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料培養(yǎng)與處理

1.1.1 材料培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)于2015年4-8月在甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室日光溫室進(jìn)行。供試燕麥品種為定莜6號(hào)，種子由甘肅省定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心提供。選取飽滿、大小一致的燕麥種子，用1%次氯酸鈉表面消毒15 min，25 ℃催芽，露白后播種在裝滿珍珠巖的塑料盆(口徑20 cm，高14 cm)中，澆水后置日光溫室培養(yǎng)，晝/夜溫度為(22±5) ℃/(16±6) ℃，相對(duì)濕度為65%±15%，光照強(qiáng)度420～680 μmol·m-2·s-1。2015年5月二葉一心期每盆留苗約200株，當(dāng)幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)設(shè)6個(gè)處理，分別為Hoagland營(yíng)養(yǎng)液(CK)、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 + 100 mmol·L-1NaHCO3(T1)、 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 + 100 mmol·L-1NaHCO3+ 50 μmol·L-1H2O2(T2)、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 + 100 mmol·L-1NaHCO3+ 150 μmol·L-1H2O2(T3)、Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 + 50 μmol·L-1H2O2(T4)、 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液 + 150 μmol·L-1H2O2(T5)。用以上處理液于每天19:00澆灌幼苗根部，每盆澆灌量約300 mL。為了避免鹽堿沖擊幼苗，NaHCO3脅迫濃度每天遞增25 mmol·L-1，4 d后濃度達(dá)到100 mmol·L-1時(shí)，記為實(shí)驗(yàn)處理正式開(kāi)始。處理7 d后取幼苗倒數(shù)第1、第2片功能葉，液氮速凍后-70 ℃保存，用于測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)。每處理取50株完整幼苗洗凈拭干后稱量鮮重。每5盆為1個(gè)重復(fù)，重復(fù)3次，隨機(jī)區(qū)組排列。

1.2 測(cè)定指標(biāo)與方法

采用高俊鳳[14]的方法測(cè)定超氧陰離子含量和細(xì)胞質(zhì)膜相對(duì)透性；參照Sergiev等[15]的方法測(cè)定H2O2含量；丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用李合生[16]的方法；超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)和抗壞血酸過(guò)氧化物酶(APX)活性及抗壞血酸(AsA)和谷胱甘肽(GSH)含量采用陳建勛和王曉峰[17]的方法測(cè)定；可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸和脯氨酸含量測(cè)定分別采用李合生[16]的蒽酮比色法、考馬斯亮藍(lán)法、茚三酮染色法和磺基水楊酸法；光合色素含量按高俊鳳[14]的方法測(cè)定。每個(gè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算平均值。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003整理數(shù)據(jù)及繪圖，用SPSS 20.0方差分析和Duncan法多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1堿脅迫下燕麥幼苗葉片活性氧產(chǎn)生和膜脂過(guò)氧化對(duì)外源H2O2的響應(yīng)

與CK相比，NaHCO3脅迫(T1處理)下燕麥幼苗葉片超氧陰離子、H2O2、MDA含量和質(zhì)膜相對(duì)透性均顯著提高(表1)。NaHCO3脅迫下，與T1處理相比，添加50 μmol·L-1H2O2(T2處理)后，幼苗超氧陰離子含量無(wú)顯著變化，但H2O2、MDA含量和質(zhì)膜相對(duì)透性均明顯下降；添加150 μmol·L-1H2O2(T3處理)后，幼苗MDA含量和質(zhì)膜相對(duì)透性與T1處理無(wú)顯著差異，而超氧陰離子和H2O2含量明顯降低。單施150 μmol·L-1H2O2(T5處理)使燕麥幼苗葉片MDA含量較CK明顯提高，而單施50 μmol·L-1H2O2(T4處理)對(duì)超氧陰離子、H2O2、MDA含量和相對(duì)質(zhì)膜透性均無(wú)顯著影響。這說(shuō)明外源H2O2可在一定程度上抑制NaHCO3脅迫下燕麥幼苗中活性氧的產(chǎn)生，降低膜脂過(guò)氧化水平，減輕質(zhì)膜的傷害。

表1 外源H2O2對(duì)堿脅迫下燕麥幼苗葉片超氧陰離子、內(nèi)源過(guò)氧化氫、丙二醛和相對(duì)質(zhì)膜透性的影響Table 1 Effect of exogenous H2O2 on , endogenous H2O2, malondialdehyde contents and relative plasma membrane permeability in oat seedling leaves under alkali stress

同列不同字母表示處理間5%水平差異顯著。表2同。

Different letters within the same column indicate significant difference among the treatments at 5% level. The same in table 2.

2.2堿脅迫下燕麥幼苗葉片活性氧清除系統(tǒng)對(duì)外源H2O2的響應(yīng)

與CK相比，NaHCO3脅迫(T1處理)顯著提高了燕麥幼苗葉片SOD、APX活性和GSH含量，明顯降低CAT和POD活性，對(duì)AsA含量影響不顯著(圖1)。NaHCO3脅迫下，與T1處理相比，添加50 μmol·L-1H2O2(T2處理)后，幼苗葉片SOD活性和GSH含量顯著下降，而CAT、POD、APX活性和AsA含量明顯提高；添加150 μmol·L-1H2O2(T3處理)后，幼苗葉片SOD、POD、APX活性和AsA含量顯著提高，CAT活性明顯下降，GSH含量則變化不大。單施50 μmol·L-1H2O2處理(T4)的SOD活性與CK無(wú)顯著差異，CAT、POD活性和GSH含量明顯下降，APX活性和AsA含量顯著升高；單施150 μmol·L-1H2O2處理(T5)使SOD活性和AsA含量明顯升高，CAT、POD活性和GSH含量顯著下降，APX活性則與CK差異不明顯。這表明，外源H2O2可提高NaHCO3脅迫下燕麥幼苗的活性氧清除能力，有助于減輕堿脅迫的傷害。

2.3堿脅迫下燕麥幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)外源H2O2的響應(yīng)

與CK相比，NaHCO3脅迫(T1處理)顯著提高了燕麥葉片可溶性糖和脯氨酸含量，降低可溶性蛋白質(zhì)含量，對(duì)游離氨基酸含量影響不大(圖2)。NaHCO3脅迫下，與T1處理相比，添加50 μmol·L-1H2O2(T2處理)顯著降低葉片可溶性糖和游離氨基酸含量，提高了可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量；添加150 μmol·L-1H2O2(T3處理)也使可溶性糖含量明顯下降，但下降幅度明顯小于T2處理，可溶性蛋白質(zhì)、游離氨基酸和脯氨酸含量均顯著提高，其中可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸的增幅小于T2處理。單施H2O2處理(T4和T5)均不同程度提高了幼苗葉片可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸含量，游離氨基酸含量則明顯下降，其中T4處理的下降幅度大于T5處理。由此可見(jiàn)，外源H2O2對(duì)NaHCO3脅迫下燕麥幼苗的滲透調(diào)節(jié)有一定的改善效應(yīng)。

2.4堿脅迫下燕麥幼苗葉片光合色素含量對(duì)外源H2O2的響應(yīng)

與CK相比，NaHCO3脅迫(T1處理)提高了燕麥葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)和類胡蘿卜素含量，但對(duì)葉綠素a/b值無(wú)明顯影響(表2)。NaHCO3脅迫下，與T1處理相比，添加50 μmol·L-1H2O2(T2處理)后葉綠素a、葉綠素(a+b)含量沒(méi)有顯著改變，葉綠素b含量卻明顯下降，葉綠素a/b值和類胡蘿卜素含量明顯提高；添加150 μmol·L-1H2O2(T3處理)后光合色素的變化與T2處理相似，但葉綠素b的降幅和葉綠素a/b的增幅更大，類胡蘿卜素增幅則較小。單施H2O2(T4和T5處理)均提高了燕麥葉片葉綠素a、葉綠素b、葉綠素(a+b)、類胡蘿卜素含量和葉綠素a/b值。這說(shuō)明外源H2O2主要影響了葉綠素b和類胡蘿卜素的合成。

2.5堿脅迫下燕麥幼苗生物量對(duì)外源H2O2的響應(yīng)

與CK相比，NaHCO3脅迫(T1處理)顯著降低了燕麥幼苗鮮重，下降幅度為30.7%(圖3)。NaHCO3脅迫下，添加50 μmol·L-1H2O2(T2處理)后幼苗鮮重較T1處理顯著升高，說(shuō)明該處理在一定程度上緩解了NaHCO3脅迫對(duì)燕麥幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，但添加150 μmol·L-1H2O2處理(T3)的燕麥幼苗鮮重與T1處理無(wú)明顯差異。單施50 μmol·L-1H2O2(T4處理)能顯著提高燕麥幼苗鮮重，而單施用150 μmol·L-1H2O2(T5處理)的燕麥幼苗鮮重與CK無(wú)明顯差異。

圖柱上不同字母表示處理間在5%水平差異顯著。圖2同。

Different letters above the columns indicate significant difference among the different treatments at 5% level. The same in figure 2.

圖1外源H2O2對(duì)堿脅迫下燕麥幼苗葉片活性氧清除系統(tǒng)的影響

Fig.1EffectofexogenousH2O2onactiveoxygenscavengingsysteminoatseedlingleavesunderalkalistress

圖2 外源H2O2對(duì)堿脅迫下燕麥幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

表2 外源H2O2對(duì)堿脅迫下燕麥幼苗葉片光合色素含量的影響Table 2 Effect of exogenous H2O2 on photosynthetic pigment content in oat seedling leaves under alkali stress

圖3 不同處理下燕麥幼苗鮮重

3 討 論

3.1外源H2O2對(duì)燕麥活性氧代謝響應(yīng)堿脅迫的調(diào)節(jié)

郭慧娟等[18]研究表明，隨著堿脅迫處理液pH的升高，多年生黑麥草(Loliumperenne)幼苗膜脂過(guò)氧化水平也顯著升高。Gong等[3]指出，與NaCl脅迫相比，NaHCO3短期脅迫誘導(dǎo)了番茄(Lycopersiconesculentum)更高的活性氧積累和抗氧化系統(tǒng)活性及脂質(zhì)過(guò)氧化，而較長(zhǎng)時(shí)間脅迫則產(chǎn)生相反結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)表明，外源H2O2能夠有效抑制NaHCO3脅迫下燕麥幼苗超氧陰離子和H2O2含量的提高，減緩膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的積累和質(zhì)膜透性的增大。這與外源H2O2能夠緩解干旱脅迫誘導(dǎo)的活性氧積累對(duì)黃瓜葉綠體膜傷害[10]的結(jié)果一致。這說(shuō)明外源H2O2能夠減輕堿脅迫誘導(dǎo)的燕麥膜脂過(guò)氧化傷害。

SOD催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2，CAT、POD、APX等協(xié)同作用進(jìn)一步催化H2O2反應(yīng)生成H2O，而AsA和GSH直接或通過(guò)AsA-GSH循環(huán)途徑參與了H2O2的清除[19]。在NaHCO3脅迫下黃瓜幼苗SOD、CAT、POD和APX活性顯著升高[2]；黑麥草幼苗SOD活性隨堿處理液pH升高而先升后降，CAT活性逐步遞減，POD活性呈遞增趨勢(shì)[18]。本實(shí)驗(yàn)表明，燕麥幼苗通過(guò)提高葉片SOD、APX活性和GSH含量增強(qiáng)了NaHCO3脅迫下的抗氧化能力，但不同濃度的外源H2O2效應(yīng)有所差異。施用50 μmol·L-1H2O2明顯降低了NaHCO3脅迫下燕麥葉片的SOD活性和GSH含量，提高了CAT、POD、APX活性及AsA含量；施用150 μmol·L-1H2O2則提高了SOD、POD和APX活性及AsA含量，降低了CAT活性，GSH含量卻沒(méi)有變化。這與外源H2O2預(yù)處理可通過(guò)提高SOD、CAT、APX、GSH-PX活性來(lái)降低熱脅迫下黃瓜葉片活性氧和MDA含量的結(jié)果類似[21]。

3.2外源H2O2對(duì)堿脅迫下燕麥幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

張波等[22]研究表明，外源H2O2能夠通過(guò)提高可溶性糖和GSH含量來(lái)增強(qiáng)小麥(Triticumaestivuml)幼苗的耐鹽性。本研究表明，外施50和150 μmol·L-1H2O2顯著提高了NaHCO3脅迫下燕麥葉片的可溶性蛋白和脯氨酸含量，卻降低了可溶性糖含量，50 μmol·L-1H2O2還降低了NaHCO3脅迫下燕麥的游離氨基酸含量，150 μmol·L-1H2O2作用則相反。這與Wahid等[19]的H2O2預(yù)處理能夠促進(jìn)鹽脅迫下小麥幼苗脅迫蛋白表達(dá)的結(jié)果類似。說(shuō)明外源H2O2對(duì)可溶性蛋白和脯氨酸積累的促進(jìn)作用可能是其增強(qiáng)燕麥在堿脅迫下滲透調(diào)節(jié)能力的重要原因。H2O2提高堿脅迫下燕麥可溶性蛋白含量的原因可能是其抑制依賴光合電子傳遞鏈活性氧的產(chǎn)生，從而阻止了活性氧誘導(dǎo)的蛋白酶活性升高對(duì)可溶性蛋白的降解[23]或誘導(dǎo)新脅迫蛋白形成所致[19]。脯氨酸水平的提高可能與H2O2能夠激活燕麥幼苗脯氨酸合成的谷氨酸途徑和鳥(niǎo)氨酸途徑、抑制脯氨酸的降解有關(guān)[24]。但外源H2O2對(duì)燕麥可溶性糖及游離氨基酸含量的影響機(jī)理還需進(jìn)一步深入探討。

3.3外源H2O2對(duì)堿脅迫下燕麥幼苗光合色素含量和生物量的影響

在篩選NaHCO3和H2O2濃度的預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，用100 mmol·L-1NaHCO3處理2葉1心期燕麥幼苗7 d后，植株鮮重顯著下降56.3%。用 0～1 000 μmol ·L-1H2O2處理2葉1心期燕麥幼苗12 d后，25～300 μmol ·L-1H2O2處理下鮮重顯著提高，500和1 000 μmol ·L-1H2O2處理下鮮重變化不大或明顯下降, 其中50和150 μmol ·L-1H2O2處理下鮮重最大。本實(shí)驗(yàn)中，外施50和150 μmol ·L-1H2O2對(duì)100 mmol·L-1NaHCO3脅迫下燕麥葉綠素含量沒(méi)有影響，卻提高了葉綠素a/b值和類胡蘿卜素含量；50 μmol·L-1H2O2處理顯著緩解了100 mmol·L-1NaHCO3脅迫對(duì)燕麥幼苗生長(zhǎng)的抑制作用，但100 mmol·L-1NaHCO3脅迫下添加150 μmol·L-1H2O2后燕麥幼苗鮮重變化不明顯。這說(shuō)明適宜濃度H2O2才可以緩解堿脅迫對(duì)燕麥生長(zhǎng)的抑制作用。葉綠素a/b值反映類囊體的垛疊程度，垛疊程度越高，植株抵御環(huán)境脅迫的能力越強(qiáng)，類胡蘿卜素除輔助光能吸收外，還可吸收剩余光能和淬滅活性氧[20]。外源H2O2對(duì)堿脅迫下燕麥葉綠素a/b值和類胡蘿卜素含量的提升作用，可能促進(jìn)了過(guò)剩激發(fā)能的耗散和活性氧的淬滅，進(jìn)而緩解了堿脅迫對(duì)燕麥生長(zhǎng)的抑制。這與外源H2O2能夠減輕受旱黃瓜葉綠體膜損傷[10]及通過(guò)提高葉綠素和可溶性糖含量增強(qiáng)小麥耐鹽性[22]的結(jié)論一致。

綜上所述，外源H2O2可緩解NaHCO3脅迫對(duì)燕麥幼苗的氧化傷害及生長(zhǎng)抑制，增強(qiáng)燕麥植株的耐堿性。這種作用一方面可能歸因于其誘導(dǎo)了高效的活性氧清除系統(tǒng)；另一方面，可能歸因于其調(diào)節(jié)了滲透平衡，提高了葉綠素a/b值和類胡蘿卜素含量。

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EffectofExogenousHydrogenPeroxideonPhysiologicalResponsesofAvenanudaL.SeedlingsunderAlkaliStress

LIUJianxin,WANGJincheng,LIUXiuli,LIBoping

(College of Life Science and Technology, Longdong University；Provincial Key Laboratory for Protection andUtilization of Longdong Bio-resources in Gansu Province,Qingyang,Gansu 741500,China)

To understand the regulative effect of H2O2, a signaling molecule on the physiological response of oat(AvenanudaL.) seedlings under alkali stress, in the present study, a sand culture experiment was conducted to investigate the effect of H2O2on leaves active oxygen metabolism, osmotica accumulation and growth of ‘Dingyou 6’ oat seedlings under 100 mmol·L-1NaHCO3stress. The results showed that under the NaHCO3stress, the application of 50 and 150 μmol·L-1H2O2both could effectively decrease the contents of superoxide anion, H2O2, malondialdehyde, soluble sugar and plasma membrane permeability in leaves, while increased the contents of soluble protein, proline, carotenoid and chlorophyll a/b values. The application of 50 μmol·L-1H2O2significantly alleviated the inhibitory effect of NaHCO3stress on the growth of oat seedlings, decreased superoxide dismutase(SOD) activity and glutathione(GSH) content, and increased activities of catalase(CAT), peroxidase(POD), ascorbate peroxidase(APX) and ascorbic acid(AsA) content in the leaves of the seedlings under NaHCO3stress. While 150 μmol·L-1H2O2had no significantly alleviate growth inhibitory of oat seedlings induced by NaHCO3stress, but it increased SOD, POD, APX activities and AsA content, and decreased CAT activity, but no significant difference was observed in the GSH content compared with NaHCO3stress.

H2O2; Oat; Alkali stress; Active oxygen metabolism; Osmotic adjustment substance

時(shí)間：2017-10-11

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20171011.1602.030.html

2017-03-11

2017-04-21

甘肅省慶陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(kz2014-19)

E-mail：liujx1964@163.com

劉建新(E-mail: liujx1964@163.com)

S512.1；S311

A

1009-1041(2017)10-1383-07