興奮劑19-去甲雄酮和19-去甲本膽烷醇酮的檢測研究

王靜竹 楊瑞，2 劉欣

1 國家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

2 北京體育大學（北京100084）

興奮劑19-去甲雄酮和19-去甲本膽烷醇酮的檢測研究

王靜竹1楊瑞1，2劉欣1

1 國家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

2 北京體育大學（北京100084）

目的：19-去甲雄酮（19-Norandrosterone，19NA）和19-去甲本膽烷醇酮（19-Noretiocholanolone，19NE）是競技體育中禁用的內源性類固醇興奮劑，可由諾龍代謝而來。本研究的目的是采用同位素比質譜方法對尿中19NA和19NE進行檢測規(guī)律研究。方法：征集2名男性志愿者?？诜?0 mg諾龍，并于服藥前后收集尿樣。對尿樣中19NA和19NE的濃度及同位素比進行測定。結果：服藥后尿樣中19NA和19NE的濃度迅速上升，其同位素比降低至接近受試品的同位素比值。結論：攝入諾龍不影響尿中孕烷二醇、雄酮、本膽烷醇酮的同位素比值。尿樣在服藥后27小時內提示尿樣為陽性。

19-去甲雄酮；19-去甲本膽烷醇酮；同位素比質譜；興奮劑檢測

19-去甲雄酮（19-Norandrosterone，19NA）和19-去甲本膽烷醇酮（19-Noretiocholanolone，19NE）是諾龍（19-去甲睪酮）、19-去甲雄烯二酮、19-去甲雄烯二醇在人體內的主要代謝產物。它們都屬于19位去甲基的類固醇激素，可以促進蛋白質的合成，運動員服用可減少脂肪貯存，增加瘦體重。19NA和19NE是世界反興奮劑機構（World Anti-Doping Agency，簡稱WADA）禁用的興奮劑[1]，其結構見圖1。

圖1 19-去甲雄酮和19-去甲本膽烷醇酮的化學結構

在20世紀80年代前，19位去甲基的類固醇激素被認為都是外源合成的，即體內不能產生此種物質。在此后的有關研究中，首先在馬和豬等動物體內發(fā)現了內源性的諾龍，隨后的研究表明，諾龍和其它19去甲基類固醇激素可以由人體自身合成和代謝的[2]。此類物質屬于內源性類固醇興奮劑。由于19NA和19NE在人體內可以自身合成，按照WADA的要求，對于它們的檢測需采用氣相色譜/燃燒爐/同位素比質譜（isotope ratio mass spectrometry，IRMS）的方法來判斷其來源。檢測時，測定尿樣中19NA和19NE的碳同位素比值（即δ值，單位為‰），以及內源性參照物的碳同位素比值，計算兩者之間的差值，即△δ值，當該值大于3時，即表示19NA和19NE是外源性的，樣本被判定為興奮劑陽性[3]。在檢測19NA和19NE時，內源性參照物可選擇孕烷二醇（5β-Pregnane-3ɑ，20ɑ-diol，PD）、雄酮（An）、11-羥基雄酮等。

對19NA和19NE的檢測研究主要集中在定量和來源鑒別方面。Bagchus等人研究了三種劑量的癸酸諾龍在血液及尿液中藥物代謝動力學特點，確定了可以檢測到19NA和19NE的時間窗口期[4]。Tseng等人對服用了營養(yǎng)補劑后的尿樣中19NA和19NE進行了定性和定量分析研究[5]。在Baume等人的研究中，志愿者口服25 mg同位素標記諾龍，通過對尿樣中19NA和19NE的定性和定量分析，探討了諾龍在代謝過程中的個體差異[6]。另外，有研究介紹了同位素比方法檢測尿樣中19NA來源的實驗方法[7，8]，并討論了內源性19NA的來源。

由于飲食、地域、環(huán)境、人種等因素對同位素比值有影響，IRMS檢測方法的建立應該對這些因素加以考察。應用IRMS方法對中國地域內的中國人口服諾龍的檢測研究以及尿中19NA和19NE的檢測研究尚未見報道。本研究針對口服諾龍后中國人的尿樣中19NA和19NE興奮劑進行同位素比檢測研究。諾龍在體內可被代謝為19NA和19NE，因此可采用口服諾龍后收集尿樣的方法得到具有19NA和19NE代謝信息的樣本。諾龍、19NA、19NE這三者均為興奮劑，因19NA和19NE是諾龍的代謝產物，檢測19NA和19NE即是檢測諾龍。如果它們在尿樣中含量高，超過WADA設定的相關界限，樣品為陽性，不需要采用同位素比質譜方法鑒別內源性與外源性。如果代謝物19NA和19NE在尿樣中濃度低，則需要排除內源性的可能，此時采用IRMS方法鑒別來源。本研究的目的是采用IRMS方法檢測口服興奮劑諾龍及檢測19NA和19NE。尿中19NA和19NE有外源性來源時，樣本中An和本膽烷醇酮（Etiocholanolone，Etio）是否受到影響也在本實驗中進行驗證。

1 實驗材料

1.1 儀器與設備

氣相色譜/質譜聯用儀（GC/MS）：HP6890/5973，Agilent Technologies；超純水制備儀：Milli-Q，MILLIPORE公司；高效液相色譜儀（HPLC）：Waters 2796，Waters公司；氣相色譜/燃燒爐/同位素比質譜儀（GC/C/IRMS）：DELTA PLUS，Thermo Scientific公 司。

1.2 試劑、對照品

β-葡萄糖醛酸甙酶：b-Glucuronidase from E.coli IX-A型，Sigma，美國；叔丁基甲醚[（CH3）3COCH3]：TEDIA COMPANY.INC，美國；N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（N-methyl-N-trimethylsilyltri-fluoroacetamide，MSTFA）：Sigma，美國；三甲基碘硅烷（Trimethylsilyliodide，TMSI）：Sigma，美國；二硫代赤蘚糖醇（ Dithioerythritol）：Aldrich，美國。其它試劑為分析純，由北京化工廠等提供。

19NA、19NE、An、Etio、PD、甲基睪酮（17a-Methyltestosterone，MT）、諾龍等對照品購自美國Sigma公司。受試品為裝入膠囊的20 mg諾龍對照品。

2 實驗步驟

2.1 試劑的制備

β-葡萄糖醛酸苷酶溶液：取β-葡萄糖醛酸苷酶適量，溶解于磷酸鹽緩沖液中，配制成50000 unit/mL溶液，置4℃冰箱中保存，備用。

磷酸鹽緩沖液：在0.2 M磷酸二氫鉀水溶液中，加入0.2 M磷酸氫二鉀水溶液，用pH計檢測pH值，pH=6.9。

2.2 儀器操作條件

2.2.1 GC/MS色譜條件

色譜柱：HP-1毛細管色譜柱（17 m×0.2 mm i.d.×0.11 μm）；進樣口溫度：280℃；接口溫度：300℃；采用恒壓模式，柱壓：87 kPa；分流比10∶1；進樣1 mL；柱升溫程序為：180℃-3.3℃ /min→231℃-30℃/min→310℃（2min）。

2.2.2 HPLC色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水，于35分鐘內，流動相由30%乙腈增加至100%乙腈。流速1 mL/min，柱溫27℃。

2.2.3 GC/C/IRMS色譜條件

色譜柱：HP-5毛細管色譜柱（25 m×0.25 mm i.d.×0.33 μm）；進樣口溫度：260℃；采用恒流模式，柱流速為1 mL/min，不分流進樣；柱溫采用程序升溫：180℃（2min）-6℃/min→255℃-3℃/min→285℃（5min）。

氧化爐溫度為960℃；還原爐溫度為600℃。

2.3 受試品同位素比值檢測

采用IRMS測定諾龍受試品同位素比值。

2.4 尿樣中19NA和19NE濃度測定

精密吸取2mL尿樣，加入MT內標溶液，再加入1 mL磷酸鹽緩沖液和50 mL β-葡萄糖醛酸甙酶溶液，混勻，在55℃恒溫水浴中酶解3 hr，取出。加入4 mL叔丁基甲醚振蕩萃取。離心，吸取上層有機溶液，在55℃加熱下用氮氣吹干，加入50 mL衍生化試劑（MSTFA/TMSI/Dithioerythritol 1000∶3∶1），溶解殘渣，轉入樣品瓶中，封蓋，70℃反應30min。備用。

依據峰面積以內標法進行定量分析，并按照下列公式進行濃度的比重校正。

2.5 樣品同位素比測定

取6 mL尿樣，加入1 mL磷酸鹽緩沖液和100 mL β-葡萄糖醛酸甙酶溶液，混勻，在55℃恒溫水浴中酶解3 hr，取出。加入8 mL叔丁基甲醚振蕩萃取。離心，吸取上層有機溶液，在55℃加熱下用氮氣吹干，加入50 mL甲醇溶解殘渣，轉入樣品瓶中，封蓋，備用。依HPLC條件，及對照品的保留時間，分離并收集相關組分，并于55℃氮氣流吹干。依據GC/C/IRMS條件測定待測物的同位素比值。

2.6 體內代謝研究

2.6.1 受試及尿樣采集

征集2名健康男性志愿者（N1、N2）參加受試，年齡為22～25歲。志愿者受試通過倫理審查，并簽署知情同意書。受試者在受試前的尿樣為空白尿樣（0 h）。受試者單次口服受試品1粒。在服藥后收集11份尿樣。尿樣采集安排如下：受試后當天（第1天）留尿6份，間隔約2～3小時；第2天留尿3份，間隔約5～10小時；第3天留晨尿2份。

2.6.2 樣品處理及數據分析

將采集的尿樣依照上述樣品制備方法進行處理，對尿中19NA和19NE、PD進行含量測定并進行19NA、19NE、An、Etio、PD同位素比值的測定，繪制尿排曲線。

3 結果與討論

3.1 受試品諾龍同位素比值及檢測方法的驗證

諾龍同位素比值（‰）為-30.92 ±0.41（n=6）。

實驗所用方法已通過方法驗證。19NA和19NE日內精密度（‰，n=6）分別為-31.50±0.29和-30.52±0.26；日間精密度（‰，n=6）分別為-31.64 ±0.29和-30.52 ±0.09；重復性（‰，n=6）分別為-31.11 ±0.18和-31.22 ±0.22；19NA線性（300～5000 mv）RSD為1.60%；19NE線性（300～4000 mv）RSD為1.21%。

3.2 19NA和19NE濃度隨時間變化規(guī)律

繪制2名受試者19NA和19NE濃度尿排曲線（見圖2）。

圖2 受試者尿樣中19NA和19NE濃度尿排曲線

受試者服用諾龍之后，尿樣中19NA和19NE濃度迅速升高。約在2小時到達最大值，之后濃度下降。此二受試者尿中19NA濃度大于19NE。 10小時后，濃度降至很低水平。此后，濃度在27小時略有升高，之后，再次降低。

3.3 19NA、19NE、An、Etio、PD同位素比值隨時間變化規(guī)律

繪制2名受試者19NA、19NE、An、Etio、PD的同位素比值尿排曲線（見圖3）。

受試者服藥后2～13小時內及27小時尿中19NA和19NE的濃度高于檢測限（2 ng/mL），對樣品進行了同位素比檢測，同位素比值以δ值表示，單位為‰。測定結果表明，服藥后尿樣中19NA和19NE的δ值保持在約-30‰，與受試品的δ值-30.92‰接近。PD作為內源性參照物，其δ值未發(fā)生變化。An和Etio的δ值未發(fā)生變化。19NA和19NE的δ值與PD的δ值的差值均大于WADA的陽性標準3‰，其與An的δ值的差值均大于3‰。An和Etio的δ值不因攝入諾龍而受影響。尿樣在服藥后10小時內及27小時檢測為陽性。

3.4 內源性諾龍及19NA、19NE的來源

相關研究表明內源性諾龍是體內雄性激素在芳香酶的作用下向雌性激素轉化時產生的[9]。諾龍可在婦女胎盤中檢測到，同時在尿樣也中檢測到19NA的存在[10]。攝入動物臟器，可導致尿樣中的19NA升高。使用炔諾酮類的藥物，也會產生19NA。另有研究表明，19NA和19NE也來自An和Etio[11]。尿樣中存在著19位去甲基的反應，19-去甲類固醇激素代謝物可在樣品前處理過程中，由An和Etio代謝形成[12]。

圖3 受試者尿樣中19NA和19NE同位素比值尿排曲線

3.5 本研究在常規(guī)檢測中的意義

本研究已應用于實際檢測工作，填補了我國在此方面檢測方法的空白。本研究一方面對所建立的相關檢測方法進行了應用驗證，另一方面了解了以19NA和19NE為被檢測物質的諾龍的檢測規(guī)律。因此，本研究對于實際檢測工作具有重要意義。

4 結論

口服諾龍20 mg使尿中的19NA和19NE濃度在2小時內迅速升高，δ值與受試品的δ值接近。尿中PD、An、Etio的δ值未發(fā)生變化。尿樣在服藥后10小時內及27小時檢測為陽性。

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Study for the Doping Control of 19-Norandrosterone and 19-Noretiocholanolone with Isotope Ratio Mass Spectrometry

Wang Jingzhu1，Yang Rui1，2，Liu Xin1
1 National Anti-Doping Laboratory，China Anti-Doping Agency，Beijing 100029，China
2 Beijing Sports University，Beijing 100084，China

Wang Jingzhu，Email：wangjingzhu@chinada.cn

ObjectiveThe 19-Norandrosterone（19NA）and 19-Noretiocholanolone（19NE）are endogenous steroids abused as dope.The aim of this study was to investigate the detection of 19NA and 19NE using isotope ratio mass spectrometry.MethodsTwo male volunteers were recruited.Each volunteer was orally administered a single dose of 20 mg of nandrolone，and their urine samples were collected after administration.The analyses of urinary concentrations and isotope ratios of 19NA and 19NE were performed.ResultsConcentrations of 19NA and 19NE increased rapidly after administration，and their isotope ratios decreased to the value of the drug ingested.ConclusionThe intake of nandrolone has no effect on the isotope ratios of pregnanediol，androsterone and etiocholanolone.The urine samples were positive within 27 hours after administration.

19-norandrosterone，19-noretiocholanolone，IRMS，doping test

2017.03.25

國家體育總局重點研究領域攻關課題（2013B003）

王靜竹,Email：wangjingzhu@chinada.cn