病原菌核酸檢測(cè)技術(shù)在兒童肺炎診斷中的臨床應(yīng)用分析

山東省煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院（264000）柳宏波 李愛敏

社區(qū)獲得性肺炎(CAP)是兒童期尤其是嬰幼兒常見感染性疾病。引起CAP的病原種類繁多，有細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體、真菌、病原蟲等[1][2]，傳統(tǒng)臨床上對(duì)其中細(xì)菌病原的診斷一般采用培養(yǎng)法，但培養(yǎng)法耗時(shí)較長，容易貽誤病情。近年來，各種分子診斷技術(shù)在臨床上得到了越來越廣泛的應(yīng)用，這些技術(shù)包括抗原抗體免疫技術(shù)、基于PCR的技術(shù)和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）等。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是Notomi發(fā)明的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)，基于LAMP的檢測(cè)方法具有檢測(cè)時(shí)間短、靈敏度高和檢測(cè)結(jié)果易于判讀等優(yōu)點(diǎn)，能輔助進(jìn)行病原早期診斷。我們使用北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增芯片法）對(duì)本科室2016年收治的30份病例進(jìn)行了檢測(cè)，并與痰細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)方法進(jìn)行了對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集痰液樣本30例，均來源于2016年收治的兒童肺炎患者。其中2歲以下的患者18例，2歲～3歲的患者4例，3歲～4歲的患者2例，4歲～5歲的患者5例，5歲～6歲的患者1例。合格的痰液要求白細(xì)胞數(shù)大于25/低倍視野且上皮細(xì)胞＜10/低倍視野，痰液收集于樣本收集管內(nèi)。

1.2 痰細(xì)菌學(xué)檢查 采用自然咳痰法留取痰標(biāo)本，對(duì)留取痰液困難患者，采用吸痰法采集痰標(biāo)本。將收集的合格痰液標(biāo)本按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》第3版進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。

1.3 痰液核酸檢測(cè) 使用痰液樣本0.6mL，選擇北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的晶芯?細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒II（玻璃珠法）作為核酸提取試劑盒進(jìn)行痰液基因組核酸的提取，使用該公司的呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒（恒溫?cái)U(kuò)增芯片法）、RTisochipTM-A恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀和配套軟件對(duì)提取的痰液核酸進(jìn)行檢測(cè)，使用核酸檢測(cè)試劑盒能檢測(cè)常見的8種呼吸道病原（肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌），大約1小時(shí)能得到檢測(cè)結(jié)果。每個(gè)樣本檢測(cè)時(shí)，取20μL恒溫?cái)U(kuò)增試劑加入34.5μL提取的核酸混合配成擴(kuò)增反應(yīng)液，取50μL擴(kuò)增反應(yīng)液加入芯片進(jìn)行核酸檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 痰細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果 30例患者的痰樣本經(jīng)過培養(yǎng)都得到陽性培養(yǎng)結(jié)果，我們選擇與呼吸道病原菌8項(xiàng)指標(biāo)一致的檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行分析，其中有22例陽性培養(yǎng)結(jié)果，檢出率為73.3%，結(jié)果見附表1。其中肺炎鏈球菌陽性例數(shù)最多，為11例，在樣本中的檢出率為36.7%；其次為肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血桿菌，各占樣本的13.3%；銅綠假單胞菌的比例為10%。以上結(jié)果與2006年的一項(xiàng)全國性調(diào)查結(jié)果接近[3]，肺炎鏈球菌是肺炎患者中最主要的細(xì)菌感染源，其次為肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌的檢出率較高可能是因?yàn)槠湓趦和R床標(biāo)本中較常見，當(dāng)然也不能排除定植菌和環(huán)境污染的影響[4]。

2.2 試劑盒檢測(cè)結(jié)果 30例患者的痰液核酸DNA檢測(cè)結(jié)果見附表2，肺炎鏈球菌的檢出率最高，為40%，其次肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血桿菌檢出率為13.3%，另檢出三例銅綠假單胞菌、一例金黃色葡萄球菌。在試劑盒檢出的肺炎鏈球菌的病例中，有9例與培養(yǎng)法的檢測(cè)結(jié)果一致，有2例使用試劑盒檢出肺炎鏈球菌的同時(shí)也檢出肺炎克雷伯氏菌，但細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果為肺炎克雷伯氏菌陽性；1例試劑盒同時(shí)檢出肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的病例，細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果為流感嗜血桿菌陽性；試劑盒檢出的3例肺炎克雷伯氏菌陽性病例的細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果也是肺炎克雷伯氏菌陽性；試劑盒檢出的3例流感嗜血桿菌陽性病例中，有2例與細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果一致。在試劑盒未檢出的病例中，2例細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果為肺炎鏈球菌，1例為肺炎克雷伯氏菌，2例為流感嗜血桿菌，3例為銅綠假單胞菌。試劑盒與細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果的陽性符合率為77.3%（17/22）。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 分別對(duì)兩種檢測(cè)方法的肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血桿菌檢出情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（附表3、附表4、附表5）。

附表1 細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果統(tǒng)計(jì)

附表2 呼吸道病原菌核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果

附表3 細(xì)菌學(xué)方法和試劑盒檢測(cè)肺炎鏈球菌結(jié)果的比較

附表4 細(xì)菌學(xué)方法和試劑盒檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌結(jié)果的比較

附表5 細(xì)菌學(xué)方法和試劑盒檢測(cè)流感嗜血桿菌的結(jié)果比較

肺炎鏈球菌陽性符合率為81.8%，陰性符合率為84.2%，總符合率為83.3%，試劑盒檢測(cè)與細(xì)菌學(xué)檢測(cè)的結(jié)果一致（Kappa值=64.8%）。

肺炎克雷伯氏菌陽性符合率為75%，陰性符合率為100%，總符合率為96.7%，試劑盒檢測(cè)與細(xì)菌學(xué)檢測(cè)的一致性較好（Kappa值=83.9%）。

流感嗜血桿菌陽性符合率為75%，陰性符合率為96.2%，總符合率為90%，試劑盒檢與細(xì)菌學(xué)檢測(cè)的結(jié)果一致（Kappa值=71.6%）。

3 討論

兒童是社區(qū)獲得性肺炎的多發(fā)人群，特別是5歲以下兒童的病情常常發(fā)展迅速并且死亡率高。目前，臨床上對(duì)社區(qū)獲得性肺炎細(xì)菌學(xué)的診斷還主要依賴于傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，但痰液的培養(yǎng)耗時(shí)較長，而且由于細(xì)菌培養(yǎng)有定植菌和非病原菌優(yōu)勢(shì)生長甚至環(huán)境菌污染的可能，導(dǎo)致細(xì)菌學(xué)結(jié)果與病因相關(guān)性差，容易造成對(duì)患者治療的延誤。近年來，LAMP技術(shù)因其快速簡便的特點(diǎn)，已經(jīng)得到了越來越多學(xué)者和專家的推薦，LAMP技術(shù)在肺炎相關(guān)病原的檢測(cè)中的應(yīng)用也已經(jīng)有很多報(bào)道，比如將LAMP用于肺炎衣原體檢測(cè)[5]、腺病毒檢測(cè)[6]、呼吸道合胞病毒檢測(cè)[7]、肺炎鏈球菌檢測(cè)[8]、肺炎常見病原菌檢測(cè)等。本研究使用的試劑盒也是基于LAMP技術(shù)，且一次能對(duì)8種常見的呼吸道病原菌進(jìn)行檢測(cè)，能大大縮短對(duì)未知病原的檢測(cè)時(shí)間，在實(shí)際使用中更具有時(shí)效性。

本研究發(fā)現(xiàn)，試劑盒對(duì)臨床感染率較高的3種病原，肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯氏菌和流感嗜血桿菌的檢測(cè)效果較好，與傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)方法有較好的一致性。根據(jù)2006年的統(tǒng)計(jì)，這3種菌在肺炎病原體檢測(cè)中的總陽性率達(dá)20%以上[4]，所以我們推薦對(duì)初診病人使用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，這樣能在發(fā)病初期對(duì)患者進(jìn)行分流。

本研究中出現(xiàn)了一些試劑盒檢測(cè)結(jié)果與細(xì)菌學(xué)結(jié)果不符的情況，其中細(xì)菌學(xué)發(fā)現(xiàn)3例銅綠假單胞菌陽性結(jié)果，而試劑盒檢測(cè)結(jié)果有2例為銅綠假單胞菌陽性，銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，我們推測(cè)這1例樣本的痰液中銅綠假單胞菌數(shù)量過少，細(xì)菌學(xué)陽性是因?yàn)槎ㄖ簿L或環(huán)境污染造成。

使用試劑盒檢測(cè)到的幾例兩種致病菌同時(shí)陽性的病例中，2例在檢出肺炎鏈球菌的同時(shí)檢出肺炎克雷伯氏菌，而細(xì)菌學(xué)方法只檢出肺炎克雷伯氏菌陽性；1例同時(shí)檢出肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的病例的細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果為流感嗜血桿菌陽性；以上結(jié)果顯示出試劑盒檢測(cè)方法在混合感染病例檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榕囵B(yǎng)法一般只能檢出一種優(yōu)勢(shì)生長菌，且優(yōu)勢(shì)生長菌可能不是真正的致病菌。

綜上所述，呼吸道病原菌核酸檢測(cè)技術(shù)具有較好臨床適用性，能輔助我們對(duì)肺炎患者進(jìn)行早期的診斷。目前，應(yīng)用于臨床的核酸檢測(cè)產(chǎn)品越來越多，希望今后能有更多更好的檢測(cè)試劑服務(wù)于醫(yī)療機(jī)構(gòu)，促進(jìn)我國醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展。