RIZ1蛋白表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)及放療敏感性的相關(guān)性研究

張?jiān)破G 劉亞琴 王 磊 張 琳 成海燕 楊?yuàn)檴?/p>

RIZ1蛋白表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌臨床病理參數(shù)及放療敏感性的相關(guān)性研究

張?jiān)破G 劉亞琴 王 磊 張 琳 成海燕 楊?yuàn)檴?/p>

目的探討宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Rb蛋白結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)基因1(RIZ1)的表達(dá)及其與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)及放療敏感性的關(guān)系。方法采用免疫組化法觀察RIZ1在159例宮頸鱗癌(Ⅱ b、Ⅲ a 期)患者及20例正常宮頸組織中的表達(dá)情況，分析RIZ1在宮頸鱗癌組織中不同組間的差異表達(dá)情況，及其與宮頸癌放療敏感性的相關(guān)性。結(jié)果與正常宮頸組織相比，RIZ1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯下降(P<0.001)；RIZ1蛋白的表達(dá)水平與宮頸癌的放療敏感性密切相關(guān)(P=0.012)，并與FIGO分期(P=0.004)、深肌層浸潤(P=0.026)、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.021)以及放療后復(fù)發(fā)(P=0.005)密切相關(guān)，Logistic回歸結(jié)果提示RIZ1蛋白高表達(dá)是宮頸癌放療敏感性的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P=0.045)。結(jié)論RIZ1可能參與宮頸鱗癌的發(fā)生與發(fā)展過程，并可能成為評(píng)估宮頸鱗癌放療敏感性的候選標(biāo)志物。

宮頸腫瘤；RIZ1；免疫組化；放療敏感性

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)居于女性惡性腫瘤的第四位[1]。在美國，2014年宮頸癌的新增病例為12 360例，死亡病例為4 020例[2]。放射治療是中晚期宮頸癌的主要治療方法，也是早期宮頸癌術(shù)后輔助治療的主要手段，然而有一部分患者放療敏感性差，預(yù)后欠佳。研究表明腫瘤的放療敏感性與細(xì)胞缺氧微環(huán)境、細(xì)胞周期及增殖活性、DNA損傷修復(fù)以及細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[3-5]。因此如何預(yù)測(cè)和提高宮頸癌的放療敏感性，改善放療抵抗患者的預(yù)后，已成為目前宮頸癌治療中亟待解決的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。

研究發(fā)現(xiàn)，Rb蛋白結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)基因(Retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene，RIZ)在多種腫瘤組織中表達(dá)降低，包括卵巢癌、肝癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤及骨肉瘤等[6-9]，在腫瘤細(xì)胞中恢復(fù)Rb蛋白結(jié)合鋅指結(jié)構(gòu)基因1(RIZ1)的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)凋亡。本研究擬探討宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中RIZ1的表達(dá)及其與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)及放療敏感性的關(guān)系，為臨床判斷宮頸癌患者的放療敏感性及預(yù)后提供了客觀指標(biāo)，為治療難治性宮頸癌提供了新的治療策略。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源

研究的病例來自2012年1月—2013年6月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科放療病房住院的宮頸鱗癌患者，共159例，年齡32～72歲，平均52.4±4.8歲。臨床分期為FIGO分期Ⅱb及Ⅲa 期，其中Ⅱb期63例，Ⅲa期96例。所有石蠟標(biāo)本均為放療前活檢標(biāo)本，病理結(jié)果均為鱗狀細(xì)胞癌。所有患者均按療程完成根治性放療，治療方案為以鉑類藥物為基礎(chǔ)的同步放化療。同時(shí)收集并完善患者的相關(guān)臨床資料，分為放療敏感組及放療抵抗組。全部病例在治療前及放療后3個(gè)月均行MRI或CT掃描，按照國際統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)(WHO實(shí)體瘤療效判斷標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行放療后近期療效的評(píng)價(jià)：完全緩解(CR)：所有目標(biāo)病灶消失，結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常；部分緩解(PR)：腫瘤縮小≥50%，結(jié)構(gòu)大部分恢復(fù)正常；微效(MR)：腫瘤縮小<50%，結(jié)構(gòu)大部分未正常；無變化(NC)：腫瘤大小無明顯縮??；進(jìn)展(PD)：腫瘤增大。其中CR+PR為放療敏感組，MR+NC+PD為放療抵抗組。同時(shí)于病理科選取20例因子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)的正常宮頸組織標(biāo)本作為正常對(duì)照。

1.2 主要抗體

兔抗人RIZ1多克隆抗體購自美國Abcam公司(ab3790，工作濃度按1∶100 稀釋)；即用型免疫組化超敏 Ultra Sensitive TM SP 試劑盒(KIT-9720)購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.3 免疫組化染色及結(jié)果評(píng)估

應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色SP法，石蠟切片常規(guī)68℃烤片20 min，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O2孵育20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，PBS沖洗3次，每次5 min，置于0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液中煮沸20 min后自然冷卻修復(fù)抗原，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加封閉血清孵育10 min，傾去血清后勿洗；滴加一抗(工作濃度1∶100稀釋)，4℃孵育過夜，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；除去PBS液，滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；DAB溶液顯色；自來水充分沖洗，蘇術(shù)素復(fù)染，PBS沖洗返藍(lán)，常規(guī)梯度酒精脫水后干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固；光鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。應(yīng)用PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照組，其余步驟均同實(shí)驗(yàn)組。染色結(jié)果的評(píng)估分別由兩位高級(jí)職稱的病理科醫(yī)生進(jìn)行觀察和評(píng)分，每張切片均在高倍鏡下(40×10倍)隨機(jī)觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野內(nèi)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，RIZ1蛋白的染色結(jié)果以細(xì)胞的胞漿呈現(xiàn)淡黃色至棕褐色者為陽性，根據(jù)每張切片的陽性細(xì)胞比例以及染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：無胞漿染色評(píng)分為0(陰性)；陽性細(xì)胞<10%(染色強(qiáng)度為淡黃色)評(píng)分為1(弱表達(dá))；陽性細(xì)胞≥10%且<50%(染色強(qiáng)度為棕黃色)評(píng)分為2(中表達(dá))；陽性細(xì)胞≥50%(染色強(qiáng)度為棕褐色)評(píng)分為3分(強(qiáng)表達(dá))。最終評(píng)分0～1分者為低表達(dá)；最終評(píng)分2～3分者為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)相關(guān)的數(shù)據(jù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，組間樣本率比較采用χ2檢驗(yàn)，宮頸癌放療敏感性影響因素分析采用Logistics回歸分析，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RIZ1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)情況

RIZ1陽性染色呈棕黃色顆粒狀，定位于癌細(xì)胞的細(xì)胞漿(圖1)，RIZ1在宮頸鱗癌患者中的表達(dá)率為32.7%(52/159)，而在正常宮頸組織中的表達(dá)率為85.0%(17/20)，與正常宮頸組織相比，RIZ1在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平明顯下降(P<0.001)(表1)。

2.2 RIZ1蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

根據(jù)WHO實(shí)體瘤療效判斷標(biāo)準(zhǔn)，將保存的宮頸癌組織標(biāo)本分為放療敏感組及放療抵抗組，RIZ1在放療敏感組中的表達(dá)率為37.2%(48/129)，而在放療抵抗組中的表達(dá)率為13.3%(4/30)，RIZ1在放療敏感組中的表達(dá)水平明顯上升(P=0.012)(表2)。同時(shí)結(jié)果表明RIZ1高表達(dá)與宮頸鱗癌的FIGO分期、深肌層浸潤、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及放療后復(fù)發(fā)密切相關(guān)(P<0.05)。而RIZ1的表達(dá)水平與患者年齡、血清SCC水平及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)(表2)。

表1 RIZ1在不同宮頸組織中的表達(dá)情況

表2 在FIGO IIb和Ⅲa期宮頸鱗癌中RIZ1的表達(dá)與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系

2.3 RIZ1蛋白與宮頸癌放療敏感性的關(guān)系

對(duì)RIZ1表達(dá)水平及各個(gè)臨床病理參數(shù)與宮頸癌患者放療敏感性的關(guān)系行單因素Logistic分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者年齡、FIGO分期、血清SCC值、腫瘤大小及深肌層浸潤與患者放療敏感性無關(guān)(P>0.05)，而盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.002)及RIZ1表達(dá)水平(P=0.017)與患者放療敏感性密切相關(guān)(表3)。進(jìn)一步對(duì)單因素分析中與宮頸癌患者放療敏感性有關(guān)的參數(shù)行Logistic逐步回歸分析，將患者年齡帶入進(jìn)行校正，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RIZ1表達(dá)水平(OR=0.313，95%CI：0.101～0.974；P=0.045)是宮頸癌患者是否出現(xiàn)放療抵抗的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，即RIZ1高表達(dá)的患者出現(xiàn)放療抵抗的風(fēng)險(xiǎn)降低(表3)。

表3 FIGO Ⅱb和Ⅲa期宮頸鱗癌患者發(fā)生放療抵抗的危險(xiǎn)因素分析

圖1 免疫組化檢測(cè)RIZ1在人不同宮頸組織中的表達(dá)情況(200×)Figure 1 The expression of RIZ1 protein in different cervical tissues(200×)Note：A.High RIZ1 expression in cervical squamous cell cancer tissues；B.Low RIZ1 expression in cervical squamous cell cancer tissues；C.High RIZ1 expression in nomal cervical tissues；D.Low RIZ1 expression in nomal cervical tissues.

3 討論

Buyse等[7]在進(jìn)行功能性篩選可與Rb結(jié)合的蛋白質(zhì)過程中通過Rb探針分離出RIZ基因，RIZ基因可以表達(dá)兩種蛋白：RIZ1蛋白(280 kDa)及其替換蛋白產(chǎn)物RIZ2(250 kDa)[10-11]，RIZ1定位于染色體1q36。RIZ1屬于核組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶超家族[12]，為Rb結(jié)合蛋白，其基因產(chǎn)物可以與Rb DNA相結(jié)合，抑制Rb基因(Retinoblastoma gene)轉(zhuǎn)錄，同時(shí)RIZ1蛋白可以與Rb蛋白結(jié)合參與Rb途徑，進(jìn)而發(fā)揮其抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的作用[13]。

處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞放療敏感性有所不同，主要原因?yàn)槿旧w結(jié)構(gòu)和內(nèi)源性cAMP含量的差異。其中處于G2期和M期的細(xì)胞放療敏感性最高，G1期的細(xì)胞次之，而S晚期的細(xì)胞對(duì)放療的敏感性最差。細(xì)胞受到輻射后最主要的死亡方式是凋亡，而以凋亡形式死亡的細(xì)胞在整個(gè)腫瘤的細(xì)胞群體中所占的比例越大，此腫瘤對(duì)放射的敏感程度越高。既往關(guān)于RIZ1的研究已表明RIZ1在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌作用，可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，將細(xì)胞阻滯于G2/M期，并且在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要作用[6-7，14]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為RIZ1的生物學(xué)作用是通過與p53的相互作用產(chǎn)生的[15-17]。在單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞中，RIZ1基因的表達(dá)受NF-κB和Akt信號(hào)通路的調(diào)控，RIZ1基因可誘導(dǎo)p53表達(dá)上調(diào)[18]，通過激活p53參與細(xì)胞周期的調(diào)控，進(jìn)而抑制白血病細(xì)胞的增殖。在實(shí)體瘤的研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)RIZ1基因在卵巢癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤組織中表達(dá)降低，且與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[8-9]。RIZ1基因的表達(dá)沉默同時(shí)存在啟動(dòng)子甲基化和組蛋白修飾兩種機(jī)制。而DNA啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化是RIZ1基因表達(dá)沉默的最常見原因。用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑處理肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞和食管鱗狀細(xì)胞，可使RIZ1重新表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[19-21]。

通過本研究發(fā)現(xiàn)，RIZ1在宮頸鱗癌組織中表達(dá)下調(diào)，與放療抵抗組相比，放療敏感組中RIZ1的表達(dá)水平升高，而且Logistics回歸分析結(jié)果提示RIZ1表達(dá)水平(OR=0.313，95%CI：0.101～0.974；P=0.045)是宮頸癌患者是否出現(xiàn)放療抵抗的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，即RIZ1高表達(dá)的患者出現(xiàn)放療抵抗的風(fēng)險(xiǎn)降低。因此，本研究推測(cè)RIZ1基因可通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯(阻滯于G2/M期)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而提高宮頸鱗癌細(xì)胞的輻射敏感性，去除其由于甲基化而發(fā)生的表達(dá)抑制，將會(huì)提高臨床宮頸鱗癌的放療療效，為宮頸癌的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示RIZ1在宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的臨床意義，其過度表達(dá)預(yù)示著放療敏感性升高，可以作為判斷宮頸鱗癌放療敏感性的潛在候選標(biāo)志物，指導(dǎo)患者制定個(gè)體化的治療方案，有針對(duì)性的采用常規(guī)及非常規(guī)治療(如超分割放療、聯(lián)合化療、使用放療增敏劑等)，既可以提高放療療效、改善病人生存質(zhì)量，又可以避免聯(lián)合化療對(duì)機(jī)體的損傷，減輕患者的病痛及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

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RelationshipbetweenexpressionofRIZ1andclinicopathologicalfactorsorradiosensitivityinhumancervicalsquamouscellcarcinoma

ZHANGYunyan，LIUYaqin，WANGLei，ZHANGLin，CHENGHaiyan，YANGShanshan

Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

ObjectiveThe aim of this study was to analyze the expression of RIZ1 and its association with clinicopathological factors or radiosensitivity in cervical squamous cell carcinoma.Methods159 samples from patients with FIGO stage Ⅱ b and Ⅲ a cervical squamous cell carcinoma were collected and preserved before radiotherapy.The expression of RIZ1 in cervical squamous cell carcinoma tissues and 20 normal cervical tissues was assessed by immunohistochemistry.The relationship between the RIZ1 expression and the clinicopathological factors or radiosensitivity in cervical squamous cell carcinoma was analyzed by statistical analysis.ResultsThe expression of RIZ1 protein was down-regulated in patients with cervical cancer(P<0.001).The level of RIZ1 protein expression was close related to radiosensitivity(P=0.012)，F(xiàn)IGO staging(P=0.004)，deep myometrial invasion(P=0.026)，and pelvic lymph node metastasis(P=0.005).Logistic regression analysis showed that the high expression of RIZ1 protein was an independent predictor of radiosensitivity in cervical cancer(P=0.045).ConclusionRIZ1 may be involved in the occurrence and development process of cervical squamous cell carcinoma and regard as a candidate biomarker for the sensitivity in cervical squamous cell carcinoma in radiotherapy.

Cervical cancer；RIZ1；Immunohistochemistry；Radiosensitivity

黑龍江省教育廳課題(12541371)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(哈爾濱 150081)

張?jiān)破G，女，(1972-)，博士，主任醫(yī)師，從事宮頸癌放療增敏的相關(guān)研究。

楊?yuàn)檴櫍珽-mail：doctor_yss@hotmail.com

R735.7

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.05.004

(收稿：2017-01-18)