海水養(yǎng)殖廢水沉積物中硝化細(xì)菌的分離及修復(fù)無機(jī)氮污染的研究*

劉彥彥 許振成# 曾 東 陳峻峰 胡艷芳 張偉麗 胡立瓊

(1.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東 廣州 510655；2.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 廣州 510006)

海水養(yǎng)殖廢水沉積物中硝化細(xì)菌的分離及修復(fù)無機(jī)氮污染的研究*

劉彥彥1許振成1#曾 東1陳峻峰2胡艷芳1張偉麗1胡立瓊1

(1.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所，廣東 廣州 510655；2.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院，廣東 廣州 510006)

針對海水養(yǎng)殖廢水中的無機(jī)氮污染，從某石斑魚養(yǎng)殖池底沉積物中篩選出5株硝化細(xì)菌(5～9號(hào))，并利用該菌進(jìn)行去除養(yǎng)殖廢水中無機(jī)氮的實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，5株硝化細(xì)菌對養(yǎng)殖廢水中氨氮、總氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮均具有去除作用，對硝酸鹽氮的去除存在相對延滯。其中，7號(hào)菌株去除效果最好，6h時(shí)對氨氮、總氮、亞硝酸鹽氮的去除率分別為48%、17%和13%；36h對硝酸鹽氮的去除率達(dá)18%。

養(yǎng)殖廢水 硝化細(xì)菌 無機(jī)氮 生態(tài)修復(fù)

Abstract: For inorganic nitrogen pollution of mariculture wastewater，five nitrifying strains (number 5-9) were screened out from a grouper aquaculture bottom sediments. The five nitrifying strains had certain removal effect of ammonia，total nitrogen, nitrate nitrogen and nitrite nitrogen to the grouper aquaculture wastewater, however, there was a relative delay for the removal of nitrate nitrogen. The screened number 7 strains had a better removal efficiency of ammonia nitrogen, total nitrogen and nitrite nitrogen in short time，the removal efficiency was 48%，17% and 13% at 6 h;and the number 7 strains achieved 18% of the removal efficiency of nitrate nitrogen at 36 h.

Keywords: mariculture wastewater; nitrifying strains; inorganic nitrogen; biological remediation

近幾十年來，我國的海水養(yǎng)殖產(chǎn)量呈逐年遞增態(tài)勢，水產(chǎn)養(yǎng)殖已成為我國農(nóng)業(yè)的支柱性產(chǎn)業(yè)之一[1-2]。傳統(tǒng)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)已由小范圍、分散經(jīng)營向規(guī)?；?、集約化方向發(fā)展[3-5]。污染的問題也隨之產(chǎn)生，近海水域環(huán)境嚴(yán)重惡化，從而導(dǎo)致了近岸海域生態(tài)系統(tǒng)失衡，嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖生態(tài)安全，制約了海水養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[6]。海水養(yǎng)殖廢水污染主要來源于殘剩飼料、養(yǎng)殖體排泄物、各類化學(xué)藥品等，主要污染元素為氮、磷和有機(jī)物[7]。海水養(yǎng)殖廢水具有兩個(gè)明顯的特點(diǎn)：潛在污染物含量低、水量大和廢水分布分散。水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，水體的氨、硝酸鹽、亞硝酸鹽等營養(yǎng)元素含量過高所造成的富營養(yǎng)化情況頻繁出現(xiàn)[8-12]。除了會(huì)改變水質(zhì)與生物平衡外，氨氮和亞硝酸鹽氮等毒性較高會(huì)對水生動(dòng)物造成嚴(yán)重影響[13-16]。目前，海水養(yǎng)殖修復(fù)技術(shù)主要包括3類：物理、化學(xué)和生物修復(fù)。常見物理修復(fù)有底泥疏浚、換水、曝氣、篩網(wǎng)、潑撒沸石灰等，但這類方法常需要較高的投資和運(yùn)轉(zhuǎn)費(fèi)用，并且處理效果不徹底[17]；化學(xué)修復(fù)主要是運(yùn)用水質(zhì)改良劑、水質(zhì)消毒劑和殺藻劑等改善養(yǎng)殖環(huán)境，但化學(xué)修復(fù)劑易產(chǎn)生有害的次生產(chǎn)物，使得水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況惡化，水產(chǎn)品品質(zhì)退化[18]；生物修復(fù)是指生物尤其是微生物催化降解環(huán)境污染物，減少或消除環(huán)境污染的自發(fā)過程[19-22]。微生物法是一種較理想的方法，由微生物引起的硝化-反硝化作用是水中氮素釋放的重要機(jī)制之一[23-25]。

目前，已知的硝化細(xì)菌大多是從淡水環(huán)境中分離得來，能用于海水養(yǎng)殖中水處理的報(bào)道較少[26-29]。硝化細(xì)菌是一類具有硝化作用的化能自養(yǎng)細(xì)菌，是生物硝化中起主要作用的微生物，污水中硝化細(xì)菌的含量與硝化速度成正比關(guān)系[30-31]。因此，硝化細(xì)菌具有良好的凈化水質(zhì)的效果，可用于海水養(yǎng)殖生物修復(fù)過程[32]。本研究從海水養(yǎng)殖廢水沉積物中進(jìn)行硝化細(xì)菌的篩選和分離，然后利用該菌種進(jìn)行去除養(yǎng)殖廢水無機(jī)氮的實(shí)驗(yàn)，從而為海水養(yǎng)殖廢水無機(jī)氮污染的生物修復(fù)提供菌種儲(chǔ)備和理論支持。

表1 養(yǎng)殖廢水主要水質(zhì)指標(biāo)

1 材料與方法

1.1 菌株和廢水來源

菌株分離樣品采自海南省馮家灣區(qū)域某石斑魚養(yǎng)殖池底沉積物，該養(yǎng)殖場地理坐標(biāo)為110°41′43.6″E，19°24′31.0″N。將菌株分離樣品裝入無菌離心管中，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)用養(yǎng)殖廢水取自該養(yǎng)殖池，主要水質(zhì)指標(biāo)見表1。

1.2 培養(yǎng)基

微量元素溶液：ZnSO42.2 g，CaCl2·2H2O 5.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.61 g，MnCl2·4H2O 5.0 g，Na2MoO4·4H2O 1.1 g，乙二胺四乙酸二鈉63.7 g，去離子水1 000 mL組成。

亞硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基：每升由NH4Cl 0.4 g、K2HPO4·3H2O 8.0 g、KH2PO41.5 g、CH3COONa 4.4 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、微量元素溶液1 mL組成，pH為7.0～7.3。于121 ℃下滅菌20 min備用。

硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基：每升由NaNO21.0 g、NaCO31.0 g、CaCO31.0 g、K2HPO4·3H2O 8.0 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、微量元素溶液1 mL組成，pH為7.0～7.3。于121 ℃下滅菌20 min備用。

固體培養(yǎng)基：相應(yīng)液體培養(yǎng)基中加入3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉。

固體斜面培養(yǎng)基：將相應(yīng)的液體培養(yǎng)基裝入20 mL試管中，每支試管裝入1/3(體積分?jǐn)?shù))，再加入3%的瓊脂粉。

1.3 硝化細(xì)菌的富集培養(yǎng)

稱取兩份40 g沉積物樣品，在無菌操作臺(tái)上分別接種于事先已滅菌、內(nèi)裝玻璃珠的200 mL亞硝酸細(xì)菌、硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置于水浴恒溫振蕩器內(nèi)以26 ℃、160 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)2 d。于無菌操作臺(tái)上分別將培養(yǎng)液接種至新的亞硝酸細(xì)菌、硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基，接種量為5%(體積分?jǐn)?shù))。重復(fù)此操作3次，共培養(yǎng)8 d，待用。

1.4 硝化細(xì)菌的分離純化

取上述已富集的培養(yǎng)液分別劃線至亞硝酸細(xì)菌、硝酸細(xì)菌固體培養(yǎng)基。用接種環(huán)挑取培養(yǎng)液在事先制好的平板上劃線至劃滿整個(gè)平皿，再于30 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～4 d后挑取單菌落劃線至新的平板，重復(fù)操作5次，最后分離出長勢較好的單菌落。

1.5 硝化細(xì)菌的菌種保存

用接種環(huán)分別將上述長勢較好的10株亞硝酸細(xì)菌和硝酸細(xì)菌單菌落劃線至亞硝酸細(xì)菌、硝酸細(xì)菌固體斜面培養(yǎng)基，于30 ℃下恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后，放置4 ℃冰箱保存。

1.6 硝化細(xì)菌的鑒定

1.6.1 生理指標(biāo)鑒定

亞硝酸細(xì)菌鑒定：取10株亞硝酸細(xì)菌單菌落接種于亞硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基，另取一份亞硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基接種無菌水作為對照。于26 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)液及對照液于白瓷比色板上，加格里斯試劑甲液和乙液各一滴，若有亞硝酸存在則呈紅色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5～9號(hào)菌株培養(yǎng)液均呈現(xiàn)紅色，而其他菌株及對照并沒有顯色。因此，5～9號(hào)菌株均有硝化活性，即為亞硝酸細(xì)菌。

硝酸細(xì)菌鑒定：取10株硝酸細(xì)菌單菌落接種于硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基，另取一份硝酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基接種無菌水作為對照。于26 ℃恒溫振蕩器中培養(yǎng)48 h。取培養(yǎng)液10 mL于試管中，加入醋酸5～8滴使之酸化，再加入數(shù)粒對氨基苯磺酸，當(dāng)停止放氣時(shí)，加入一粒對氨基苯磺酸，此過程中NO-轉(zhuǎn)化為氮?dú)庖莩觥７謩e取去除NO-后的培養(yǎng)液及對照液于白瓷比色板上，逐滴加入加格里斯試劑，如不呈現(xiàn)紅色，證明亞硝酸已完全消失。再加二苯胺試劑2～4滴，如呈現(xiàn)藍(lán)色說明有硝化細(xì)菌的存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，均未出現(xiàn)藍(lán)色，證明不存在將亞硝酸氧化成硝酸的菌株，即不存在硝酸細(xì)菌。

1.6.2 分子生物學(xué)鑒定

對所篩選細(xì)菌做16S rDNA做norB的基因擴(kuò)增，根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)設(shè)計(jì)：上游引物F(5’-CGGAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC-3’)和下游引物R(5’-CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC-3’)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增體系：DNA聚合酶(Easy Taq DNA Polymeerase)1 μL(5 U)，10倍的內(nèi)切酶緩沖液(Easy Taq Buffer)5 μL(200 mmol/L三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl，200 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，20 mmol/L MgSO4)，2.5 mmol/L三磷酸堿基脫氧核苷酸(dNTPs)4 μL，引物為1 μL(20 μmol/L)，模板DNA為1 μL，其余用雙蒸水補(bǔ)足至50 μL。PCR程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)后以1%(體積分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測[33-34]。

1.7 硝化細(xì)菌去除無機(jī)氮性能測試

養(yǎng)殖廢水使用前先經(jīng)121 ℃下滅菌20 min。將篩出的5株硝化細(xì)菌(5～9號(hào))菌株于無菌臺(tái)分別接種于500 mL養(yǎng)殖廢水中。使用接種環(huán)向每瓶培養(yǎng)液接入3環(huán)菌株，另取一瓶養(yǎng)殖廢水接種無菌水作為對照。將培養(yǎng)液置于120 r/min、30 ℃的恒溫振蕩器中。每次取樣測定樣品DO、氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮，測定方法見文獻(xiàn)[35]，取樣時(shí)間為接種后6、12、24、36、48 h。養(yǎng)殖廢水經(jīng)菌種處理后排入集中處理工程。

2 結(jié)果與討論

2.1 硝化菌株的分子生物學(xué)鑒定

將PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因科技有限公司做測序，所測的序列長度在1 000 bp左右。將所得序列使用GenBank的BLAST程序進(jìn)行比對，獲得各序列的同源性信息，然后運(yùn)用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5.0中的Kimura2-parameter模型計(jì)算各序列間的距離和序列相似性等，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，5、6號(hào)菌與硝化桿菌(Nitrobacter)(NC_007406.1)具有最大同源相似性；7號(hào)菌與硝化菌(Nitrobactersp.)(NZ_CH672423.1、NZ_CH672418.1)具有最大同源相似性；8、9號(hào)菌與NitrobacterNC_007964.1具有最大的同源相似性。因此，結(jié)合1.6節(jié)，所篩選的5～9號(hào)細(xì)菌均為硝化細(xì)菌。

2.2 硝化細(xì)菌去除無機(jī)氮性能測試結(jié)果

2.2.1 氨 氮

氨氮過高對水產(chǎn)養(yǎng)殖有毒害，非離子氨進(jìn)入水生生物體內(nèi)后，對酶水解反應(yīng)和膜穩(wěn)定性產(chǎn)生明顯影響，影響水生生物的生理生化指標(biāo)與生長狀況，進(jìn)而影響水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量，因此要降低氨氮濃度。由圖2可知，5號(hào)菌隨著時(shí)間的延長對氨氮的去除率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，12 h時(shí)對氨氮達(dá)到最大去除率(42%)，之后對氨氮的去除率持續(xù)下降；6號(hào)菌在前36 h內(nèi)對氨氮的去除率呈現(xiàn)緩慢增長趨勢，36 h時(shí)達(dá)到最大去除率(27%)，36～48 h對氨氮去除率明顯下降；7號(hào)菌在6 h時(shí)對氨氮去除率達(dá)到最大(48%)，之后呈緩慢降低的趨勢，但其對氨氮均保持較高的去除率；8號(hào)菌隨著時(shí)間的延長對氨氮去除率穩(wěn)定在12%左右，表明8號(hào)菌對氨氮的去除效果具有持續(xù)穩(wěn)定性；9號(hào)菌對氨氮去除率呈先降低后升高的趨勢，6 h時(shí)去除率最大(36%)，24 h時(shí)去除率最小(18%)，36～48 h又恢復(fù)到較高的去除率?？傮w上，7、9號(hào)菌對氨氮去除效果具有穩(wěn)定高效的去除效果，且7號(hào)菌對氨氮的去除效果優(yōu)于9號(hào)菌；5、6號(hào)菌對氨氮去除作用時(shí)間較長，不利于氨氮的快速去除；8號(hào)菌對氨氮去除效果持續(xù)穩(wěn)定，但其去除率較低，不利于氨氮的高效去除。不同菌株對氨氮去除效果存在較大差異可能與其本身對氨氮的耐受性、自身新陳代謝營養(yǎng)需求及其他環(huán)境因素(如DO、pH的變化)的差異而造成。劉少敏等[36]以聚乙烯醇-海藻酸鈉作為包埋載體固定硝化細(xì)菌，制備固定小球，對生活污水中的氨氮去除效果進(jìn)行研究，結(jié)果表明，在最佳條件狀態(tài)下對生活污水中氨氮去除率超過90%。本實(shí)驗(yàn)采用的原位添加細(xì)菌處理養(yǎng)殖廢水的方法達(dá)到48%的去除效果，表明所篩選硝化細(xì)菌具有良好的氨氮去除效果。

圖1 根據(jù)序列和BLAST建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees of bacterial based on the results of BLAST of sequences

圖2 不同硝化菌株處理下廢水氨氮變化情況Fig.2 The changes of ammonia content of the waste water under the different nitrifying strains

2.2.2 總 氮

水產(chǎn)養(yǎng)殖中總氮升高，會(huì)影響水體C/N，造成水質(zhì)惡化，并影響水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量。由圖3可知，對總氮的整體去除效果為7號(hào)菌>9號(hào)菌>8號(hào)菌>5號(hào)菌>6號(hào)菌。7號(hào)菌株在6 h對總氮達(dá)到一個(gè)較大的去除率(17%)，且隨著時(shí)間的推移，7號(hào)菌對總氮去除效果持續(xù)高效穩(wěn)定在17%左右。由此可知，所篩選出的5株硝化細(xì)菌對總氮的去除均具有一定的作用，而總氮的去除與反硝化作用有關(guān)，水產(chǎn)養(yǎng)殖一步步消耗水體中的DO，使得水體呈現(xiàn)缺氧狀態(tài)，通過反硝化作用，將硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)鈴乃w中逸出，總氮得以在反硝化作用下去除。蘇俊峰等[37]從生物陶粒反應(yīng)器中篩選出6株異養(yǎng)硝化細(xì)菌，將異養(yǎng)硝化細(xì)菌擴(kuò)大培養(yǎng)后，建立序批式活性污泥法(SBR)反應(yīng)器并進(jìn)行了總氮去除的研究，結(jié)果表明，其對總氮的最大去除率為47.27%。本研究中總氮去除率低于該值，這與SBR間歇運(yùn)行方式有關(guān)，故其總氮去除率相對較高。

圖3 不同硝化菌株處理下廢水總氮變化情況Fig.3 The changes of total nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains

2.2.3 硝酸鹽氮

由圖4可知，6、12 h，硝酸鹽氮呈現(xiàn)增加趨勢。這與硝化細(xì)菌將氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮有關(guān)，相應(yīng)的氨氮含量降低。24～48 h，隨著大部分的氨氮已初步轉(zhuǎn)化，硝化細(xì)菌開始其對硝酸鹽氮的降解產(chǎn)生作用，不同菌株對硝酸鹽氮的去除效果總體為7號(hào)菌>8號(hào)菌>5號(hào)菌>6號(hào)菌>9號(hào)菌，36 h時(shí)7號(hào)菌株對硝酸鹽氮的去除率達(dá)到最大(18%)。由此可知，所篩選出的硝化菌株對硝酸鹽氮均具有一定的去除效果，且其作用時(shí)間均存在相對延滯。張峰峰等[38]研究表明，硝酸鹽氮的去除主要是反硝化細(xì)菌起作用。本實(shí)驗(yàn)中大部分的氨氮初步轉(zhuǎn)化完全后，硝化細(xì)菌開始以硝酸鹽氮為氮源，硝酸鹽氮含量減少。

圖4 不同硝化菌株處理下廢水硝酸鹽氮變化情況Fig.4 The changes of nitrate nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains

2.2.4 亞硝酸鹽氮

水體中亞硝酸鹽濃度過高，易造成水生生物亞硝酸鹽中毒，也是對水產(chǎn)養(yǎng)殖危害較大的無機(jī)氮污染[39]。由圖5可知，不同硝化菌株對亞硝酸鹽氮的去除效果總體為7號(hào)菌>9號(hào)菌>5號(hào)菌>6號(hào)菌>8號(hào)菌；7號(hào)菌在取樣的前3個(gè)時(shí)間段均對亞硝酸鹽氮的去除保持一個(gè)較高穩(wěn)定的去除率，6 h時(shí)達(dá)到最大去除率(13%)。隨著時(shí)間推移，氨氮被硝化細(xì)菌氧化成硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮，使得硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮的含量呈現(xiàn)增加狀態(tài)，從而使得亞硝酸鹽氮在48 h時(shí)去除相對不明顯。部分的硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮在缺氧狀態(tài)下隨著反硝化作用生成氮?dú)獾靡匀コ?，亞硝酸鹽氮維持在一個(gè)相對平衡的緩慢減少的狀態(tài)，這對于水產(chǎn)養(yǎng)殖是十分有利的。何騰霞等[40]研究表明，亞硝酸鹽氮的去除與反硝化細(xì)菌有關(guān)，其篩選出的耐冷反硝化細(xì)菌對亞硝酸鹽具有高效的去除效果。

圖5 不同硝化菌株處理下廢水硝酸鹽氮變化情況Fig.5 The changes of nitrite nitrogen of the waste water under the different nitrifying strains

3 結(jié) 論

5株硝化細(xì)菌對養(yǎng)殖廢水中氨氮、總氮、硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮均具有去除作用，對硝酸鹽氮的去除存在相對延滯。其中，7號(hào)菌株去除效果最好，6 h時(shí)對氨氮、總氮、亞硝酸鹽氮的去除率分別為48%、17%和13%；36 h對硝酸鹽氮的去除率達(dá)18%。

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Researchonscreeningofnitrifyingbacteriafrommariculturewastewatersedimentsandbioremediationinorganicnitrogen

LIUYanyan1，XUZhencheng1，ZENGDong1，CHENJunfeng2，HUYanfang1，ZHANGWeili1，HULiqiong1.

(1.SouthChinaInstituteofEnvironmentalScience，MEP，GuangzhouGuangdong510655；2.SchoolofEnvironmentandEnergy，SouthChinaUniversityofTechnology，GuangzhouGuangdong510006)

2016-05-03)

劉彥彥，女，1989年生，碩士，主要從事水污染控制與給水凈化方面的工作。#

。

*國家水體污染控制與治理科技重大專項(xiàng)(No.2012ZX07206)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.08.002