微生物源揮發(fā)性化合物苯并噻唑?qū)颐共【囊种菩?yīng)

崔凱娣，黃學(xué)屏，何磊鳴，翟永彪，慕衛(wèi)，劉峰,3

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微生物源揮發(fā)性化合物苯并噻唑?qū)颐共【囊种菩?yīng)

崔凱娣1,3，黃學(xué)屏1,3，何磊鳴1,2，翟永彪1，慕衛(wèi)1,2，劉峰1,2,3

（1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安 271018；2山東省農(nóng)藥毒理與應(yīng)用技術(shù)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018；3山東農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省蔬菜病蟲生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

【】評(píng)價(jià)揮發(fā)性化合物苯并噻唑防治灰霉病的應(yīng)用潛力，為進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)?！尽坎捎妹芊獗P菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定山東省73株灰霉病菌（）對(duì)苯并噻唑的敏感性，并比較不同地區(qū)和不同表現(xiàn)型菌株（多菌靈抗性和敏感菌株：CarR，CarS；腐霉利抗性和敏感菌株：PrcR，PrcS；嘧霉胺抗性和敏感菌株：PyrR，PyrS；啶酰菌胺抗性和敏感菌株：BosR，BosS）間的敏感性差異；測(cè)定苯并噻唑與多菌靈、啶酰菌胺室內(nèi)混用對(duì)灰霉病菌的抑制作用。通過離體黃瓜葉片接種試驗(yàn)驗(yàn)證苯并噻唑?qū)S瓜灰霉病的保護(hù)、治療效果以及不同熏蒸劑量和時(shí)間對(duì)灰霉病菌致病力的影響，并用掃描電子顯微鏡觀察苯并噻唑?qū)颐咕z形態(tài)的影響。【】苯并噻唑?qū)颐共【z的EC50范圍為0.38—1.08 μL·L-1，均值為0.62 μL·L-1，不同地區(qū)之間無敏感性差異；山東地區(qū)多菌靈、腐霉利、嘧霉胺、啶酰菌胺抗性和敏感灰霉病菌對(duì)苯并噻唑均比較敏感，說明這4種殺菌劑與苯并噻唑無交互抗性；在苯并噻唑0.1—3 μL·L-1范圍內(nèi)，菌絲比孢子對(duì)其更敏感；2 μL·L-1苯并噻唑?qū)z的抑制率高達(dá)86.12%，對(duì)芽管伸長(zhǎng)的抑制率為55.15%，而對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率僅為19.30%。可見，病菌不同生長(zhǎng)階段對(duì)此化合物的敏感性不同。苯并噻唑與多菌靈混用防治黃瓜灰霉病無增效或相加作用，兩者混用時(shí)哪種藥劑發(fā)揮主要抑菌作用與各組分在混用中使用的濃度和比例有關(guān)；苯并噻唑與啶酰菌胺混用有顯著增效作用，其田間實(shí)際應(yīng)用方式、效果以及增效機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。離體葉片試驗(yàn)表明，苯并噻唑?qū)S瓜灰霉病兼具保護(hù)和治療防效，2 μL·L-1的治療防效為91.01%，高于對(duì)照藥劑啶酰菌胺300mg·L-1（78.90%），并顯著高于48.25%的保護(hù)防效。苯并噻唑能夠顯著降低灰霉病菌菌絲的致病力，受抑制程度與苯并噻唑濃度呈正相關(guān)。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，苯并噻唑能夠使菌絲形態(tài)異常，菌絲干癟，分枝增多，表面凹陷。【】苯并噻唑?qū)ι綎|省不同地區(qū)的灰霉病菌均有較高的毒力，適合作為防治灰霉病的熏蒸劑使用。

揮發(fā)性化合物；苯并噻唑；灰霉病菌；毒力；敏感性

0 引言

【研究意義】灰霉病是由灰葡萄孢（）引起的世界性病害[1]。灰霉病菌可以侵染生長(zhǎng)期和儲(chǔ)藏期的蔬菜、水果等作物，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，在中國(guó)灰霉病的防治以化學(xué)防治為主，常用藥劑包括苯并咪唑類（如多菌靈）、二甲基酰亞胺類（如腐霉利）、苯胺基嘧啶類（如嘧霉胺）和琥珀酸脫氫酶抑制劑類（如啶酰菌胺）殺菌劑等?；瘜W(xué)藥劑的頻繁使用使灰霉病菌對(duì)以上幾類殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗性[2]，為保證防效，農(nóng)民往往通過加大施藥劑量和使用頻率等方式防治病害，導(dǎo)致農(nóng)藥殘留超標(biāo)。因此，亟需開發(fā)與常規(guī)殺菌劑無交互抗性、安全、高效的友好型殺菌劑。苯并噻唑是一種微生物源揮發(fā)性有機(jī)化合物，目前在食品中主要用作香料添加劑，對(duì)人畜安全，有望開發(fā)為較理想的果蔬殺菌劑。【前人研究進(jìn)展】揮發(fā)性化合物廣泛存在于植物和微生物次生代謝產(chǎn)物中，具有易揮發(fā)、安全高效、低殘留等特點(diǎn)[3-4]，逐漸應(yīng)用于植物病蟲害防治。研究表明，具有高效抑菌活性的揮發(fā)性化合物有望用于保護(hù)地或儲(chǔ)藏病害的防治，如內(nèi)生真菌白色麝香霉（）已被美國(guó)Agraquest公司注冊(cè)專利成為商業(yè)化生防產(chǎn)品，其產(chǎn)生的揮發(fā)物對(duì)黃萎病菌等具有抑菌活性，同時(shí)可防治溫室土傳病害[5]，預(yù)防采后水果腐爛[6]；生姜（）和碧桃（）產(chǎn)生的植物精油用于采后葡萄灰霉病的防治等[7]。有研究表明，苯并噻唑具有廣泛的殺菌譜，能夠抑制菌核病菌（）[8]、尖鐮孢（）[9]和水稻紋枯病菌（）[10]菌絲的生長(zhǎng)。同時(shí)，苯并噻唑?qū)Τ鄶M谷盜（）[10]和馬鈴薯腐爛莖線蟲（）[11]具有強(qiáng)烈的毒殺活性，對(duì)韭菜遲眼蕈蚊（）表現(xiàn)出顯著的熏蒸活性[12]。這些研究表明，苯并噻唑兼具殺蟲和殺菌活性，具有開發(fā)為生物源熏蒸劑用于農(nóng)業(yè)有害生物防治的潛力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】苯并噻唑殺菌譜廣，對(duì)灰霉病菌具有很高的熏蒸抑制活性，而山東省灰霉病菌菌株對(duì)苯并噻唑的敏感性尚不明確，苯并噻唑?qū)颐共【囊种谱饔靡参催M(jìn)行系統(tǒng)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過比較苯并噻唑?qū)Χ嗑`、腐霉利、嘧霉胺、啶酰菌胺抗性和敏感灰霉菌株的抑制活性，觀察它們之間是否存在交互抗性，通過離體葉片接種試驗(yàn)以及對(duì)灰霉病菌致病力和菌絲形態(tài)的影響明確苯并噻唑防治灰霉病的作用方式，并通過與多菌靈、啶酰菌胺的混用效果探索其應(yīng)用途徑，以期為苯并噻唑的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2014—2016年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成。

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 2014—2016年從山東濟(jì)南、濰坊、萊蕪、泰安、濟(jì)寧、聊城和臨沂地區(qū)發(fā)病設(shè)施菜田隨機(jī)采集灰霉病果、病莖或病葉，裝入自封袋內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)單孢分離得到73個(gè)灰霉病菌菌株。采用區(qū)分劑量法判定抗性菌株，多菌靈（carbendazim）、腐霉利（procymidone）的區(qū)分劑量為1 mg·L-1，嘧霉胺（pyrimethanil）0.45 mg·L-1，啶酰菌胺（boscalid）5 mg·L-1[13-14]。

1.1.2 供試藥劑 揮發(fā)性化合物：99%苯并噻唑（北京百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司）；殺菌劑：98%多菌靈原藥，山東濰坊潤(rùn)豐化工股份有限公司；97%啶酰菌胺原藥，陜西美邦農(nóng)藥有限公司。50%啶酰菌胺WG，江陰蘇利化學(xué)股份有限公司。

多菌靈和啶酰菌胺原藥分別用0.1 mol·L-1的鹽酸溶液和甲醇溶解，配制成1.0×104mg·L-1的母液，于4℃避光保存?zhèn)溆?。用無菌水配成系列濃度，每個(gè)藥劑濃度與PDA按1﹕9的比例倒入培養(yǎng)基中，制備含藥平板。甲醇或鹽酸的體積分?jǐn)?shù)均＜0.25%，同樣體積的溶劑水溶液加入到培養(yǎng)基中作為空白對(duì)照。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，去離子水1 L；水瓊脂（water agar，WA）培養(yǎng)基：瓊脂20 g，葡萄糖20 g，去離子水1 L。

1.2 方法

1.2.1 苯并噻唑?qū)ι綎|省不同敏感水平灰霉病菌的抑制活性測(cè)定 苯并噻唑?qū)颐共【囊种苹钚圆捎妹芊獗P菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定[15]。將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)3 d后，在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，在直徑9 cm的培養(yǎng)皿皿底倒入PDA培養(yǎng)基，將菌餅接入培養(yǎng)基中央，用移液槍定量移取0、0.04、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μL苯并噻唑滴加到固定于另一皿底的濾紙片（方形，1 cm×1 cm）上，迅速兩底合扣（熏蒸體積為200 mL），形成0、0.2、0.5、1、2、4、8 μL·L-1的熏蒸濃度，用封口膜密封后倒置放于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，每處理4個(gè)重復(fù)。待空白對(duì)照菌落生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿的2/3時(shí)，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑并計(jì)算苯并噻唑?qū)颐共【z生長(zhǎng)抑制率。菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）∕（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）× 100。

1.2.2 對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)的抑制活性 采用孢子萌發(fā)法[16]。由于所有測(cè)試菌株對(duì)苯并噻唑敏感，因此隨機(jī)選取3個(gè)菌株測(cè)定苯并噻唑?qū)颐共【z生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和芽管伸長(zhǎng)的影響，對(duì)菌絲生長(zhǎng)的測(cè)定方法同1.2.1，熏蒸濃度設(shè)置為0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、6、8 μL·L-1?；颐共【暝赑DA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)10 d，用0.05%的吐溫80水溶液洗脫孢子并用兩層紗布過濾，在光學(xué)顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子懸浮液的濃度，將孢子懸浮液濃度配至1×105個(gè)/mL。100 μL孢子懸浮液均勻涂布于1%的水瓊脂培養(yǎng)基，定量苯并噻唑（0、0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6 μL）滴加到固定于另一皿底的濾紙片上形成系列熏蒸濃度（0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、6、8 μL·L-1），迅速兩底合扣，用密封膜封嚴(yán)，于25℃恒溫黑暗培養(yǎng)8 h后觀察孢子萌發(fā)情況，以芽管長(zhǎng)度超過孢子長(zhǎng)度的1/2為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)平板觀察200個(gè)孢子的萌發(fā)情況。每個(gè)平板測(cè)量50個(gè)萌發(fā)孢子的芽管長(zhǎng)度。每處理進(jìn)行6次重復(fù)。孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）∕對(duì)照孢子萌發(fā)率×100；芽管伸長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照芽管長(zhǎng)度-處理芽管長(zhǎng)度）∕對(duì)照芽管長(zhǎng)度×100。

1.2.3 苯并噻唑與多菌靈、啶酰菌胺的聯(lián)合毒力 隨機(jī)選取多菌靈敏感菌株（MY-3），啶酰菌胺敏感菌株（SH-9）為試驗(yàn)菌株，在PDA培養(yǎng)基上純化3 d，在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，分別接入含系列梯度濃度的多菌靈、啶酰菌胺含藥平板，其中多菌靈系列濃度為0、0.5、2、4、8 mg·L-1，啶酰菌胺系列濃度為0、0.1、1、5、20 mg·L-1。另一培養(yǎng)皿皿底加入0或0.1 μL苯并噻唑，使熏蒸濃度為0或0.5 μL·L-1，迅速倒扣在接有菌餅的含藥平板上，用密封膜封嚴(yán)，25℃培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)，每處理重復(fù)4次。3 d后用十字交叉法測(cè)量菌絲直徑，分別計(jì)算苯并噻唑和多菌靈、啶酰菌胺的單一使用和聯(lián)合使用對(duì)灰霉病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率。

1.2.4 苯并噻唑?qū)S瓜灰霉病的保護(hù)與治療作用測(cè)定 參照Kuang等[17]的方法，略做改進(jìn)。選取大小一致的同一葉齡健康黃瓜葉片（品種新泰密刺），用0.5%的NaClO溶液浸泡1 min，無菌蒸餾水沖洗3次后自然晾干，放置于鋪有濕潤(rùn)濾紙的直徑9 cm培養(yǎng)皿皿底。0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μL苯并噻唑滴加到固定在另一皿底的濾紙片上，熏蒸濃度為0、0.5、1、2、4、8 μL·L-1，300 mg·L-1的50%啶酰菌胺WG為對(duì)照藥劑，水為空白對(duì)照，每濃度重復(fù)6次，試驗(yàn)重復(fù)2次。

保護(hù)作用測(cè)定：苯并噻唑熏蒸處理黃瓜葉片24 h后，打開封口膜散失揮發(fā)物5 min，在黃瓜葉片正面的中心葉脈左右兩側(cè)接種5 mm的灰霉病菌菌餅（SH-9菌株），在培養(yǎng)箱（25℃；L﹕D = 12 h﹕12 h；相對(duì)濕度85%）培養(yǎng)3 d后用十字交叉法測(cè)量病斑直徑并計(jì)算防效。防效（%）=（對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-處理菌落增長(zhǎng)直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100。

治療作用測(cè)定：在黃瓜葉片正面的中心葉脈左右兩側(cè)接種5 mm的灰霉病菌菌餅（SH-9菌株），25℃生長(zhǎng)24 h后測(cè)量各菌落初始直徑（d0），苯并噻唑熏蒸處理24 h，散發(fā)揮發(fā)物繼續(xù)在培養(yǎng)箱（25℃；L﹕D = 12 h﹕12 h；相對(duì)濕度85%）培養(yǎng)3 d，用十字交叉法測(cè)量病斑直徑（d），并計(jì)算防效。病斑增長(zhǎng)直徑（mm）= d-d0；防效（%）=（對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑-處理菌落增長(zhǎng)直徑）/對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑×100。

1.2.5 苯并噻唑?qū)颐共【虏×Φ挠绊?參照Liu等[18]的離體葉片接種法。剪取生長(zhǎng)一致的黃瓜葉片，用0.5%的NaClO溶液消毒1 min，無菌蒸餾水沖洗3次后自然晾干，展平鋪展到墊有濕潤(rùn)濾紙的直徑9 cm培養(yǎng)皿中。采用密封盤法對(duì)預(yù)培養(yǎng)24 h的灰霉病菌（SH-9菌株）利用苯并噻唑（0、0.5、1、2、4、8 μL·L-1）熏蒸處理12、24、36、48 h，用直徑5 mm的打孔器分別在熏蒸處理后的灰霉菌落邊緣打取菌餅，接種于黃瓜葉片正面。在每片葉上接 2塊菌餅，每個(gè)處理接種6片葉。接種后置于培養(yǎng)箱（25℃；L﹕D = 12 h﹕12 h；相對(duì)濕度85%）培養(yǎng)。3 d后用十字交叉法測(cè)量病斑直徑大小，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.6 苯并噻唑?qū)颐共【z形態(tài)的影響 結(jié)合致病力試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)預(yù)培養(yǎng)24 h的灰霉病菌進(jìn)行4 μL·L-1苯并噻唑熏蒸處理36 h，以不受苯并噻唑處理的菌絲作對(duì)照，取邊緣菌絲進(jìn)行掃描電鏡形態(tài)觀察。按康振生[19]的方法進(jìn)行掃描電鏡樣品的加工。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用DPS 7.05軟件計(jì)算苯并噻唑的EC50、EC90及95%置信限，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行處理間差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 苯并噻唑?qū)Σ煌舾谐潭然颐共【囊种苹钚?/h3>

山東地區(qū)多菌靈、腐霉利、嘧霉胺、啶酰菌胺抗性和敏感灰霉病菌對(duì)苯并噻唑均比較敏感（表1）。73個(gè)灰霉病菌菌株的EC50范圍為0.38—1.08 μL·L-1，平均EC50為0.62 μL·L-1，EC90范圍為3.57—6.39 μL·L-1，平均EC90為4.45 μL·L-1（表2）。苯并噻唑?qū)颐共【z生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)均有顯著的抑制作用，而灰霉病菌菌絲比孢子對(duì)苯并噻唑更敏感（圖1）。2 μL·L-1苯并噻唑?qū)z的抑制率高達(dá)86.12%，對(duì)芽管伸長(zhǎng)的抑制率為55.15%，而對(duì)孢子萌發(fā)的抑制率僅有19.30%。苯并噻唑濃度的升高，對(duì)灰霉病菌的抑制率越高，同時(shí)，4 μL·L-1能夠完全抑制灰霉病菌孢子的萌發(fā)，8 μL·L-1完全抑制灰霉病菌菌絲的生長(zhǎng)。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤Data in the figure were mean±SE

2.2 苯并噻唑與多菌靈、啶酰菌胺的聯(lián)合毒力

0.5 μL·L-1苯并噻唑與低劑量多菌靈0.5 mg·L-1混用時(shí)，主要是苯并噻唑發(fā)揮抑菌作用；隨著多菌靈濃度的升高，兩者混用主要由多菌靈發(fā)揮抑菌效果，兩者混用無增效（圖2-A）。0.5 μL·L-1苯并噻唑與0.1 mg·L-1啶酰菌胺混用時(shí)主要是苯并噻唑發(fā)揮抑菌作用；0.5 μL·L-1苯并噻唑與1 mg·L-1啶酰菌胺防效相當(dāng)，隨著啶酰菌胺濃度的升高（1—20 mg·L-1），苯并噻唑與啶酰菌胺混用與兩單劑相比，抑菌率有顯著的增加（圖2-B）。

表1 山東省8種灰霉病菌菌株類型對(duì)苯并噻唑的敏感性

R：抗性菌株resistant isolates；S：敏感菌株sensitive isolates；Car=多菌靈Carbendazim；Prc=腐霉利Procymidone；Pyr=嘧霉胺Pyrimethanil；Bos=啶酰菌胺Boscalid

表2 山東省不同地區(qū)灰霉病菌對(duì)苯并噻唑的敏感性

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。柱上不同字母表示經(jīng)Duncan 氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P＜0.05水平差異顯著。下同

2.3 苯并噻唑?qū)S瓜灰霉病的保護(hù)與治療作用

苯并噻唑的治療效果比保護(hù)效果更強(qiáng)（表3），2 μL·L-1的治療效果為91.01%，顯著高于對(duì)照藥劑啶酰菌胺，4 μL·L-1的防效達(dá)到100%，能夠完全控制灰霉病的菌絲生長(zhǎng)。苯并噻唑的保護(hù)效果較弱，2 μL·L-1的防效僅為48.25%，最高劑量8 μL·L-1的防效為92.98%，而其他劑量處理防效均遠(yuǎn)低于對(duì)照藥劑啶酰菌胺300 mg·L-1。

2.4 苯并噻唑?qū)颐共【虏×Φ挠绊?/h3>

隨著熏蒸時(shí)間的延長(zhǎng)，苯并噻唑?qū)颐共【虏×Φ囊种谱饔酶黠@。苯并噻唑不同濃度熏蒸處理灰霉病菌12 h接種于黃瓜葉片，形成的病斑直徑與對(duì)照無顯著性差異。熏蒸時(shí)間延長(zhǎng)至24 h時(shí)，高劑量8 μL·L-1處理組病菌侵染形成的病斑直徑顯著低于對(duì)照組，僅為對(duì)照直徑的72%，說明此劑量下可以有效抑制灰霉病菌對(duì)黃瓜葉片的侵染。熏蒸時(shí)間達(dá)到36 h時(shí)，各濃度苯并噻唑不同程度地降低了所形成病斑的直徑，4和8 μL·L-1處理下，病斑直徑分別為對(duì)照的83%和59%。苯并噻唑熏蒸處理灰霉病菌48 h后，2、4和8 μL·L-1處理顯著降低灰霉病菌致病力的作用更顯著，病斑直徑分別為對(duì)照的89%、78%和54%（圖3）。

圖3 苯并噻唑?qū)颐共【虏×Φ挠绊?/p>

表3 苯并噻唑?qū)S瓜灰霉病的保護(hù)和治療作用

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。同列不同字母表示經(jīng) Duncan 氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在＜0.05水平差異顯著

Data in the table were mean±SE. Different letters in the same column indicated significant difference at＜0.05 level by Duncan’s multiple range test

2.5 苯并噻唑?qū)颐共【z形態(tài)的影響

對(duì)照菌絲形態(tài)完整，表面細(xì)滑，線條流暢， 生長(zhǎng)狀態(tài)良好（圖4-A—C）；4 μL·L-1苯并噻唑處理36 h后，菌絲破損，表面干癟（圖4-D），菌絲末端膨大，分支增多（圖4-E），表面有凹陷（圖4-F）。

A—C：對(duì)照菌絲Mycelia of untreated control；D—F：4 μL·L-1苯并噻唑處理36 h的菌絲Mycelia treated with 4 μL·L-1 benzothiazole for 36 h

3 討論

山東各地區(qū)灰霉病菌對(duì)常規(guī)殺菌劑已經(jīng)產(chǎn)生了不同程度的抗性，需要不斷開發(fā)新的防治藥劑。本研究表明，不論抗性還是敏感菌株均對(duì)苯并噻唑的敏感性一致，這也從側(cè)面證明苯并咪唑與常規(guī)殺菌劑多菌靈、腐霉利、嘧霉胺和啶酰菌胺等沒有交互抗性。苯并噻唑在不同濃度下對(duì)灰霉病菌均具有不同程度的抑制作用，且隨著處理濃度的升高，抑制活性增強(qiáng)。

生物防治與化學(xué)藥劑聯(lián)合防治已成為研究熱點(diǎn)之一。Maki等[20]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（）與氟酰胺（flutolanil）混用可大大提高單獨(dú)使用氟酰胺防治馬鈴薯猝倒病的效果；牛芳勝等[21]研究表明，哈茨木霉（）與啶酰菌胺聯(lián)合使用，增強(qiáng)了對(duì)番茄灰霉病菌的抑菌活性。本研究評(píng)價(jià)了苯并噻唑與兩種殺菌劑混用的有效性，其中苯并咪唑類的殺菌劑多菌靈是通過干擾有絲分裂中的紡錘體形成，影響細(xì)胞的分裂[22]，屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑的啶酰菌胺是作用于植物病原菌細(xì)胞內(nèi)的線粒體，結(jié)合呼吸鏈蛋白質(zhì)復(fù)合體Ⅱ，干擾呼吸作用，進(jìn)而阻礙能量代謝，造成菌體死亡[23]。測(cè)定結(jié)果表明，苯并噻唑與多菌靈混用無協(xié)同作用，兩者混用時(shí)哪種藥劑發(fā)揮主要抑菌作用與各組分在混用中使用的濃度和比例有關(guān)；苯并噻唑與啶酰菌胺混用有明顯的增效作用，其田間實(shí)際應(yīng)用方式、效果以及增效機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。

苯并噻唑能顯著降低灰霉病菌的致病力，受抑制程度與苯并噻唑濃度呈正相關(guān)。菌絲在藥物脅迫下生長(zhǎng)，藥物濃度越高，對(duì)菌絲的抑制率越強(qiáng)，達(dá)到致病力顯著減弱的時(shí)間越短。致病力結(jié)果表明，抑制率約90%的劑量4 μL·L-1開始顯著降低病菌致病力的時(shí)間為36 h。為了探究灰霉菌絲致病力減弱的原因，筆者從超微形態(tài)觀察苯并噻唑?qū)z的影響，發(fā)現(xiàn)苯并噻唑處理后的菌絲破損現(xiàn)象明顯，內(nèi)生物質(zhì)外漏造成菌絲干癟，這應(yīng)該是造成致病力下降的原因。

苯并噻唑作為一種微生物源揮發(fā)性化合物，是棒曲霉（）[24]、枯草芽孢桿菌[11]和擔(dān)子菌（ligninolytic Basidiomycetes）[25]的次生代謝產(chǎn)物。苯并噻唑的化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，與苯并咪唑類似，而它的作用機(jī)理仍不清楚。筆者實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，苯并噻唑能影響韭菜遲眼蕈蚊的取食量、解毒酶和消化酶活性[26]，干擾其能量代謝[27]。陳澄宇等[12]發(fā)現(xiàn)，苯并噻唑能影響韭菜遲眼蕈蚊的呼吸速率，熏蒸0.5—1 h能使幼蟲呼吸速率明顯升高，隨后降低至對(duì)照水平。Ginsberg等[28]認(rèn)為苯并噻唑是一種呼吸刺激劑。僅有的關(guān)于苯并噻唑作用機(jī)理的研究推測(cè)，苯并噻唑與能量代謝有關(guān)，而其具體作用機(jī)制仍待研究。

由于揮發(fā)性化合物具有殘留量低、安全性高、高效的特點(diǎn)[29]，從自然資源中尋找化學(xué)藥劑的替代化合物已成為當(dāng)前新藥劑研究的熱點(diǎn)。Arrebola等[4]研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)物能防治青霉等采后腐爛??；Fujioka等[30]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬醛能保護(hù)擬南芥免受炭疽病的危害；Kishimoto等[31]證實(shí)，1-辛烯-3-醇能誘導(dǎo)擬南芥抵御灰霉病的侵染。本研究發(fā)現(xiàn)，苯并噻唑?qū)S瓜灰霉病兼具保護(hù)和治療作用，同等濃度下治療效果高于保護(hù)效果，這歸因于灰霉病菌的菌絲比孢子對(duì)苯并噻唑更敏感。因此，苯并噻唑?qū)S瓜灰霉病具有很好的防治效果。作為一種揮發(fā)性化合物，苯并噻唑更適用于溫室大棚、倉(cāng)儲(chǔ)等密閉環(huán)境中灰霉病的防治，其使用方法和效果尚需進(jìn)一步評(píng)價(jià)。此外，苯并噻唑作用廣譜，對(duì)菌核病、韭菜遲眼蕈蚊、根結(jié)線蟲等均有效[8,11-12]，未來還有開發(fā)為土壤熏蒸劑使用的潛力。

4 結(jié)論

微生物源揮發(fā)性化合物苯并噻唑?qū)颐共【哂休^高的熏蒸活性，山東地區(qū)灰霉菌株對(duì)苯并噻唑的EC50平均值為0.62 μL·L-1，病菌不同生長(zhǎng)階段對(duì)此化合物的敏感性依次為菌絲生長(zhǎng)＞芽管伸長(zhǎng)＞孢子萌發(fā)。苯并噻唑?qū)颐共『婢弑Ｗo(hù)和治療作用，對(duì)菌絲形態(tài)具有破壞作用，在植物保護(hù)領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛力。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

The inhibition effect of microbial volatile compound benzothiazole on

CUI KaiDi1,3, HUANG XuePing1,3, HE LeiMing1,2, ZHAI YongBiao1, MU Wei1,2, LIU Feng1,2,3

(1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong;2Key Laboratory of Pesticide Toxicology & Application Technique, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong;3Shandong Provincial Key Laboratory for Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests, Shandong Agricultural University, Taian 271018, Shandong)

【】The objective of this study is to evaluate the application potential of microbial volatile compound benzothiazole on, and to provide a valuable information for further exploitation and utilization.【】The sensitivity of 73isolates in Shandong Province to benzothiazole was measured by mycelium growth rate of sealed dishes method. The sensitivity differences among different regions and phynotypes ofisolates (resistant and sensitive to carbendazim, procymidone, pyrimethanil or boscalid: CarR, CarS, PrcR, PrcS, PyrR, PyrS, BosR, BosS) were compared. The combination efficiencies onof benzothiazole with carbendazim or boscalid were determined. The protective and curative effect of benzothiazole against cucumber gray mold, and the effects of benzothiazole at different doses and fumigation times on the pathogenicity ofwere determined on detached cucumber leaves. The mycelial morphology oftreated by benzothiazole was observed with scanning electron microscope (SEM). 【】 All the testedisolates were sensitive to benzothiazole, range of EC50from 0.38 to 1.08 μL·L-1, with a mean EC50value at 0.62 μL·L-1. There was no sensitivity difference among different regions. All the phynotypes of isolates (CarR, CarS, PrcR, PrcS, PyrR, PyrS, BosR, BosS) were sensitive to benzothiazole, suggesting that there was no cross-resistance between these fungicides and benzothiazole. In the range of 0.1-3 μL·L-1of benzothiazole, mycelia were more sensitive than spores to benzothiazole. The inhibition rate of 2 μL·L-1benzothiazole for mycelial growth, germ tube elongation and spore germination was 86.12%, 55.15%, and 19.30%, respectively. It is suggested that the sensitivities of different growth stages ofto benzothiazole were different. There was no synergism when benzothiazole combined with carbendazim, and which active ingredient performed the main antifungal activity depended on the concentration and proportion of each compound in the mixture. The synergism of benzothiazole combined with boscalid was obvious, but the exact field practical application method, efficacy and mechanism of synergism remains to be further investigated. The result ofleaf test showed that benzothiazole had protective and curative effect against cucumber gray mold, and the curative effect was superior to the protective effect. The curative effect of 2 μL·L-1benzothiazole against cucumber gray mold was 91.01%, which was higher than the control fungicide boscalid at 300 mg·L-1(78.90%) and the protective effect (48.25%). Benzothiazole could significantly reduce the pathogenicity ofmycelia on detached cucumber leaves, and the inhibition level was positively correlated with the concentration of benzothiazole. The results of SEM images indicated that benzothiazole caused large alterations in mycelial morphology of, showing a wrinkled surface and anomalous branching of the terminal mycelia. 【】Benzothiazole has high toxicity toin different regions of Shandong Province, which indicates that benzothiazole could be applied as a fumigant for controlling gray mold.

volatile compounds; benzothiazole;; toxicity; sensitivity

10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.008

2017-05-02；接受日期：2017-06-21

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2016YFD0200500）

崔凱娣，E-mail：ckd921209@163.com。通信作者劉峰，Tel/Fax：0538-8242611；E-mail：fliu@sdau.edu.cn