樣品處理方法對皖南葛根和粉葛中總黃酮和葛根素含量的影響

常躍興，郭愛靈，陳鐸葆，鄧云，張榮波，姚斯琪

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樣品處理方法對皖南葛根和粉葛中總黃酮和葛根素含量的影響

常躍興，郭愛靈，陳鐸葆，鄧云，張榮波，姚斯琪

安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽淮南 232001

建立葛根和粉葛中總黃酮和葛根素含量測定方法，比較室溫超聲法、超聲加熱法和加熱回流法等樣品處理方法對葛根和粉葛中總黃酮和葛根素含量測定結(jié)果的影響?？傸S酮含量測定采用紫外分光光度法，在波長250 nm處測定吸光度；葛根素含量測定采用HPLC，固定相為十八烷基硅烷鍵合硅膠，流動相為甲醇-水（25∶75），檢測波長為250 nm，流速為1.0 mL/min。室溫超聲法、加熱回流法和超聲加熱法葛根中總黃酮含量分別為15.09%、14.48%、12.71%（＝3），葛根素含量分別為4.37%、4.09%、3.80%（＝3）；粉葛中總黃酮含量分別為2.09%、2.23%、2.17%（＝3），葛根素含量分別為0.50%、0.53%、0.52%（＝3）。室溫超聲法、超聲加熱法可替代加熱回流法分別用于葛根和粉葛中總黃酮和葛根素含量測定時供試液制備；皖南野生葛根和粉葛中葛根素含量均符合藥典標(biāo)準。

供試液制備；葛根；粉葛；總黃酮；葛根素；含量測定

葛屬植物資源分布較廣且蘊含量較大的是野葛和甘葛藤[1]，二者自2005年版《中華人民共和國藥典》開始分別以葛根和粉葛分開收載。二者所含異黃酮類成分是其主要有效成分[2]，而葛根素是其最主要的活性成分[3]。歷版藥典亦以葛根素含量作為質(zhì)量控制的標(biāo)準。現(xiàn)代研究表明，不同產(chǎn)地野生葛根和粉葛所含黃酮類成分和葛根素含量均有較大差異[4]，甚至產(chǎn)地為山西運城、大同和晉城的野葛所含葛根素含量最大者為4.48%，最小者僅為1.46%[5]。本研究采集安徽蕪湖野葛和甘葛藤，建立其總黃酮和葛根素含量測定方法，比較室溫超聲法、超聲加熱法和加熱回流法等樣品處理方法對其總黃酮和葛根素含量測定的影響。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent科技有限公司）；Diamonsil Plus C 18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，迪馬公司）；KQ-100 DE型超聲波清洗器（工作頻率為40 kHz，試驗過程中超聲功率均為100 W，昆山超聲儀器有限公司）；MS105DU型十萬分之一天平（梅特勒托利多國際貿(mào)易上海有限公司）；BSM220.4型分析天平（上海精卓電子科技有限公司）；DE-100 G型多功能小型粉碎機（浙江紅景天工貿(mào)有限公司）。

葛根和粉葛，采自安徽省蕪湖市蕪湖縣境內(nèi)山坡，趁鮮切成厚片或小塊，干燥備用，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定，分別為豆科植物野葛（Willd.）Ohwi和甘葛藤Benth.的干燥根；葛根素對照品（批號110752-201514，供含量測定用），中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純），美國Merk公司；水（超純水）；無水乙醇（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外分光光度法測定總黃酮含量

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取葛根素對照品16.7 mg，置于200 mL容量瓶中，加入30%乙醇適量，超聲助溶，定容至刻度，搖勻，即得濃度為83.5 μg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取適量備用葛根或粉葛厚片，采用粉碎機將其粉碎成全部過3號篩的細粉。分別精密稱取葛根0.1 g和粉葛0.8 g置于不同具塞錐形瓶中，各用50 mL移液管精密加入30%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，室溫超聲、加熱回流或超聲加熱（75 ℃±5 ℃）30 min，取出，放涼至室溫，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，得供試品溶液Ⅰ，備用。取200 μL供試品溶液Ⅰ，置于10 mL容量瓶中，加入30%乙醇定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液Ⅱ。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.1”項下葛根素對照品溶液500、700、900、1100、1300 μL，分別置于10 mL容量瓶中，30%乙醇定容至刻度，搖勻，即得系列不同濃度的葛根素對照品溶液，以30%乙醇為空白對照，于波長250 nm處測定吸光度。以葛根素濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度A為縱坐標(biāo)作標(biāo)準曲線，進行回歸分析，得回歸方程＝0.065＋0.002，＝0.999。結(jié)果表明葛根素對照品在4.175～10.855 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.1.4 精密度試驗 精密量取“2.1.1”項下葛根素對照品溶液500、900、1300 μL，分別置于10 mL容量瓶中，以30%乙醇定容至刻度，搖勻，即得低、中、高濃度的葛根素對照品溶液，以30%乙醇為空白對照，于波長250 nm處測定吸光度，重復(fù)測定6次，得低、中、高濃度葛根素對照品溶液吸光度的RSD分別為0.43%、0.31%、0.80%。結(jié)果表明，紫外分光光度法測定葛根素吸光度精密度良好。

2.1.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批葛根或粉葛供試品溶液Ⅱ，分別于0、2、4、8、16、24 h在波長250 nm處測定吸光度，結(jié)果葛根或粉葛供試品溶液Ⅱ吸光度的RSD分別為1.76%、1.34%，表明葛根或粉葛供試品溶液Ⅱ在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.1.6 重復(fù)性試驗 分別精密稱取同一批次6份葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，按“2.1.2”項下方法分別采用室溫超聲法和超聲加熱法制備供試品溶液Ⅰ和供試品溶液Ⅱ，取供試品溶液Ⅱ在250 nm波長處分別測定吸光度。根據(jù)吸光度計算葛根中總黃酮平均含量為15.10%，RSD＝2.47%；粉葛中總黃酮平均含量為2.18%，RSD＝2.34%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7 加樣回收率試驗 分別精密稱取已知總黃酮含量的葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，各3份，分別置于100 mL錐形瓶中，各精密加入一定濃度的葛根素對照品溶液50 mL，分別按“2.1.2”項下方法采用室溫超聲法和超聲加熱法制備供試品溶液Ⅱ，于250 nm波長處測定吸光度，計算加樣回收率，結(jié)果見表1?？梢?，葛根和粉葛中總黃酮含量測定準確度符合測定要求，該方法可用于本試驗。

2.1.8 樣品含量測定 分別精密稱定葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，各9份，分別按“2.1.2”項下室溫超聲、加熱回流或超聲加熱法制備供試品溶液Ⅰ和供試品溶液Ⅱ，取供試品溶液Ⅱ分別于250 nm波長處測定吸光度，并計算葛根和粉葛中總黃酮含量，結(jié)果見表2。

表1 葛根和粉葛中總黃酮加樣回收率試驗

表2 葛根和粉葛中總黃酮含量測定結(jié)果（%，n＝3）

2.1.9 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS19.0軟件對“2.1.8”項下數(shù)據(jù)進行兩兩均數(shù)比較。結(jié)果在葛根的總黃酮含量測定中，室溫超聲法與加熱回流法無顯著差異（＞0.05），而二者均與超聲加熱法有顯著差異（＜0.05）；在粉葛的總黃酮含量測定中，加熱回流法與超聲加熱法無顯著差異（＞0.05），而二者均與室溫超聲法有顯著差異（＜0.05）。

2.2 HPLC測定葛根素含量

2.2.1 色譜條件 流動相為甲醇-水（25∶75），檢測波長為250 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為室溫。色譜圖見圖1。按葛根素峰計算，理論塔板數(shù)不低于4000。

注：S1.野葛室溫超聲；S2.野葛加熱回流；S3.野葛超聲加熱； S4.粉葛室溫超聲；S5.粉葛加熱回流；S6.粉葛超聲加熱； 1.葛根素；B.空白；R.對照品

2.2.2 對照品溶液的制備 采用“2.1.1”項下濃度為83.5 μg/mL的葛根素對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 采用“2.1.2”項下制備的供試品溶液Ⅰ。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱定12.0 mg葛根素對照品，置于50 mL容量瓶，加30%乙醇適量，超聲助溶，繼續(xù)加30%乙醇至刻度，振搖混勻，作為葛根素含量測定線性及其范圍的母液。分別精密量取上述母液5、2、1 mL和500 μL，分別置于10 mL容量瓶，加30%乙醇至刻度，振搖混勻，連同母液一起作為葛根素含量測定線性及其范圍的系列濃度溶液。分別精密吸取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件進行含量測定，記錄葛根素峰面積值。以葛根素濃度為橫坐標(biāo)，葛根素峰面積為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準曲線，計算回歸方程。結(jié)果葛根素濃度在12～240 μg/mL范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為＝47.16＋5.322（＝0.999），滿足葛根素含量測定要求。

2.2.5 精密度試驗 分別精密吸取濃度為12、48、240 μg/mL的葛根素對照品溶液20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定，重復(fù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果3個濃度對應(yīng)峰面積RSD分別為0.84%、0.97%、1.41%，表明該儀器測定葛根素含量精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批葛根或粉葛供試品溶液Ⅰ，于制備后分別放置0、6、12、18、24、30 h，精密吸取20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，計算葛根素峰面積RSD分別為3.78%、4.04%，表明葛根和粉葛供試品溶液在30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取“2.1.6”項下制備的供試品溶液Ⅰ，進樣20 μL，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積。葛根中葛根素平均含量為4.38%，RSD＝2.13%；粉葛中葛根素平均含量為0.52%，RSD＝1.47%。結(jié)果表明葛根和粉葛供試品溶液制備方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取“2.1.8”項下制備的供試品溶液Ⅰ，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，計算加樣回收率，結(jié)果見表3。表明葛根和粉葛中葛根素含量測定準確度符合測定要求，該含量測定方法可用于本試驗。

2.2.9 樣品含量測定 分別精密稱定葛根粉末0.1 g和粉葛粉末0.8 g，各9份，分別按“2.1.2”項下室溫超聲、加熱回流或超聲加熱法制備供試品溶液Ⅰ，在上述色譜條件下，分別精密吸取上述葛根素對照品溶液與各供試品溶液20 μL，進樣測定峰面積積分值，計算葛根素含量，結(jié)果見表4。

表3 葛根和粉葛中葛根素加樣回收率試驗

表4 葛根和粉葛中葛根素含量測定結(jié)果（%，n＝3）

2.2.10 數(shù)據(jù)處理與分析 采用SPSS19.0軟件對“2.2.9”項下數(shù)據(jù)進行兩兩均數(shù)比較。結(jié)果在葛根的葛根素含量測定中，室溫超聲法、加熱回流法、超聲加熱法三者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）；在粉葛的葛根素含量測定中，加熱回流法與超聲加熱法無顯著差異（＞0.05），而二者均與室溫超聲法有顯著差異（＜0.05）。

3 討論

葛根素含量測定結(jié)果表明，本試驗所采葛根和粉葛均符合2015年版《中華人民共和國藥典》葛根中葛根素含量不得低于2.4%和粉葛中葛根素含量不得低于0.3%的要求，因此皖南野生葛根和粉葛均達到藥用要求，可對其藥用資源進行可持續(xù)性開發(fā)。

本研究葛根中總黃酮含量達15.08%，與文獻報道的葛根中總黃酮含量6.20%～15.87%[1]，以及山西葛根含量為12.53%[6]相差不大；而粉葛總黃酮含量2.17%，亦在文獻報道的含量0.24%～3.67%范圍內(nèi)。

綜合權(quán)衡“2.1.9”和“2.2.10”項下結(jié)果，葛根總黃酮和葛根素含量測定中供試品制備方法提示以室溫超聲提取法替代加熱回流提取法，不僅含量較高，而且節(jié)約能源，操作簡單；粉葛總黃酮和葛根素含量測定中，綜合考慮節(jié)約能源和操作簡單等因素，可用超聲加熱提取法替代加熱回流提取法。葛根和粉葛總黃酮和葛根素含量測定結(jié)果變化趨勢基本一致，僅在室溫超聲與加熱回流制備供試品溶液方法方面不一致，可能是由于總黃酮含量與葛根素含量差異較大引起的。

本研究中的總黃酮含量測定用葛根和粉葛供試品溶液制備是在葛根素含量測定用葛根和粉葛供試品溶液基礎(chǔ)上進行了稀釋，避免了供試品溶液制備的重復(fù)，節(jié)約了制備時間；同時采用超聲法處理樣品比用加熱回流法簡單，亦節(jié)約了時間。因此，本試驗所采用的葛根和粉葛中總黃酮和葛根素供試品溶液制備方法較為簡單，可為含葛根或粉葛制劑或復(fù)方中總黃酮和葛根素的含量測定提供借鑒。

[1] 陶娟,許慕農(nóng),路秋生,等.中國葛屬植物資源和利用情況[J].中國野生植物資源,2007,26(3)：38-41.

[2] 曹鐘靈,李建北,張東明.葛屬植物中異黃酮類化合物的研究進展[J].中藥材,2005,28(1)：67-71.

[3] 楚紀明,馬樹運,李海峰,等.葛根有效成分及其藥理作用研究進展[J].食品與藥品,2015,17(2)：142-146.

[4] 肖培根,李大鵬,黃世林.新編中藥志：第1卷[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2002：962-975.

[5] 張靜,郝建平,王峰,等.6種晉產(chǎn)野生葛根中葛根素、大豆苷和總黃酮含量比較[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2015,27(1)：99-102.

[6] 劉計權(quán),劉亞明,裴香萍.山西產(chǎn)葛根總黃酮及3種異黃酮含量的測定[J].中華中醫(yī)藥雜志,2012,27(2)：309-312.

Effects of Different Sample Preparation Methods on Total Flavonoids and Puerarin Content from Puerariae Lobatae Radix and Puerariae Thomsonii Radix in South Anhui Province

CHANG Yue-xing, GUO Ai-ling, CHEN Duo-bao, DENG Yun, ZHANG Rong-bo, YAO Si-qi

To establish UV spectrophotometry and HPLC methods for content determinations of total flavonoids and puerarin from Puerariae Lobatae Radix and Puerariae Thomsonii Radix; To compare the ultrasonic method at room temperature, conventional refluxing method and ultrasonic method at heating conditions at the aspect of content determinations.The content determinations of total flavonoids was determined by UV spectrophotometry at 250 nm; the content of puerarin was determined by HPLC with octadecylsilane-bonded silica gel as the stationary phase, a mixture of methanol and water (25:75) as the mobile phase, 256 nm as the detection wavelength, 1.0 mL/min as the flow rate.Contents of total flavonoids in Puerariae Lobatae Radix by ultrasonic method at room temperature, conventional refluxing method and ultrasonic method were15.09%, 14.48%, and 12.71% (=3), respectively. The contents of puerarin were 4.37%, 4.09%, and 3.80% (=3), respectively. Contents of total flavonoids in Puerariae Thomsonii Radix were 2.09%, 2.23%, and 2.17% (=3), respectively. The contents of puerarin were 0.50%, 0.53%, and 0.52% (=3), respectively.Ultrasonic method at room temperature can replace conventional refluxing method for content determinations of total flavonoids and puerarin from Puerariae Lobatae Radix, and ultrasonic method at heating conditions also can replace conventional refluxing method for content determinations of total flavonoids puerarin from Puerariae Thomsonii Radix. Puerarin contents from Puerariae Lobatae Radix and Puerariae Thomsonii Radix in South Anhui Province are all in line with the Pharmacopoeia standards.

sample preparation; Puerariae Lobatae Radix; Puerariae Thomsonii Radix; total flavonoids; puerarin; content determination

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.019

R284.1

A

1005-5304(2017)11-0078-04

（2017-03-30）

（2017-04-24；編輯：陳靜）

2015年安徽理工大學(xué)引進人才基金項目（11079）；安徽理工大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201610361317）