HPLC指紋圖譜結(jié)合主成分分析對不同產(chǎn)地頭頂一顆珠質(zhì)量的評價

陳潔，陳文茜，郭文鼎，雷滔，歐陽俊搖，趙暉，鄒海艷

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HPLC指紋圖譜結(jié)合主成分分析對不同產(chǎn)地頭頂一顆珠質(zhì)量的評價

陳潔1，2，陳文茜1，郭文鼎1，雷滔1，歐陽俊搖1，2，趙暉1，2，鄒海艷1，2

1.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069；2.中醫(yī)絡病研究北京市重點實驗室，北京 100069

通過HPLC指紋圖譜結(jié)合主成分分析（PCA）對不同產(chǎn)地頭頂一顆珠藥材的質(zhì)量進行評價，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。采用Hibar C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為203 nm，柱溫為30 ℃，利用相似度評價軟件和PCA對14批頭頂一顆珠藥材檢測結(jié)果進行分析比較。HPLC指紋圖譜的方法學考察符合相關(guān)要求，共標定了頭頂一顆珠藥材HPLC指紋圖譜的15個共有峰，14批藥材的相似度為0.389～0.979。PCA結(jié)果顯示前3個主成分的累積方差貢獻率為87.674%，S2樣品綜合得分最高（4.926）、質(zhì)量最好。所建立的HPLC指紋圖譜結(jié)合PCA可以客觀、有效地評價不同產(chǎn)地頭頂一顆珠藥材的質(zhì)量。

頭頂一顆珠；指紋圖譜；高效液相色譜法；主成分分析；相似度分析

頭頂一顆珠，又名芋兒七，為百合科延齡草屬植物延齡草Maxim.的干燥根和根莖，主要分布于我國陜、川、鄂、湘等地，是土家族、苗族等少數(shù)民族常用藥材。據(jù)《土家族藥物志》記載，頭頂一顆珠性平，味甘，有小毒，功能鎮(zhèn)靜止痛、散瘀療傷、活血調(diào)經(jīng)和止血[1]，是土家族四大神藥（文王一支筆、江邊一碗水、七葉一枝花、頭頂一顆珠）之一?，F(xiàn)代研究表明，頭頂一顆珠具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、促凝血、增強心臟功能、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗衰老等藥理活性，主要用于治療眩暈、頭痛、失眠、神經(jīng)衰弱、腦震蕩后遺癥、高血壓、跌打損傷、腰腿疼痛、外傷出血等癥[2]。頭頂一顆珠中的主要有效成分為甾體皂苷類化合物，包括重樓皂苷Ⅵ、Ⅶ及頭頂一顆珠皂苷等，此外，還含有倍半萜類、黃酮類等成分[3-4]。

指紋圖譜是中藥質(zhì)量控制的重要方法，其中含有大量信息，如何有效挖掘數(shù)據(jù)、合理解析和表達指紋特征是該技術(shù)應用的關(guān)鍵。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一種化繁為簡的多元統(tǒng)計方法，通過降維處理，根據(jù)貢獻率的大小，選擇少數(shù)幾個具有代表性的綜合指標（主成分）代替多個原始變量，可以最大限度地保留樣本的原始信息并對樣本做出整體性評價[5]。近年來，PCA與指紋圖譜技術(shù)相結(jié)合，已應用于清熱解毒注射液[6]、雷公藤[7]、板藍根[8-9]等中藥質(zhì)量評價。本試驗建立頭頂一顆珠藥材的HPLC指紋圖譜，并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價及PCA對不同產(chǎn)地的14批藥材進行綜合比較，旨在反映不同產(chǎn)地頭頂一顆珠藥材質(zhì)量的一致性情況，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Aglient1260高效液相色譜儀，美國安捷倫有限公司；BSA124S-CW型電子天平，奧多利斯科學儀器（北京）有限公司；KQ3200E型超聲波清洗儀器，昆山市超聲儀器有限責任公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司。

重樓皂苷Ⅵ對照品（批號MUST-14071904）、重樓皂Ⅶ對照品（批號MUST-13080302），成都曼思特生物科技有限公司中國科學院成都生物研究所，HPLC純度≥98%；偏諾皂苷元-3-O---吡喃鼠李糖基-(1→4)-[--吡喃鼠李糖基-(1→2)]---葡萄糖苷（PRRG）對照品，本實驗室自制，HPLC純度≥95%；甲醇為分析純（北京化工廠），乙腈為色譜純（Fisher Scientific），水為娃哈哈純凈水。

14批市售頭頂一顆珠藥材分別購自安徽亳州藥材市場、河北安國藥材市場、湖北恩施中藥材有限公司、保真堂生物科技有限公司，產(chǎn)地分別為東北1（S1）、東北2（S2）、西藏1（S3）、陜西（S4）、安徽（S5）、浙江（S6）、四川（S7）、湖北（S8）、云南大理（S9）、云南（S10）、吉林（S11）、西藏2（S12）、湖北神農(nóng)架（S13）、吉林長白山（S14），經(jīng)首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院李佳副教授鑒定，均為百合科延齡草屬植物延齡草Maxim.的干燥根和根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Hibar C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～10 min，5%～28%A；10～15 min，28%～29%A；15～25 min，29%～65%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

2.2 供試品溶液的制備

樣品粉碎，過40目篩，取藥材粉末0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇10 mL，精密稱定，超聲提取1 h（功率1200 W，頻率35 kHz），放冷，補足減失的質(zhì)量，提取液用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 混合對照品溶液的制備

分別取重樓皂苷Ⅶ、Ⅵ和PRRG對照品適量，加70%甲醇溶解并制成濃度分別為1.2、1.1、2.1 mg/mL的對照品溶液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按“2.1”項下色譜條件測定，以重樓皂苷Ⅵ色譜峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.07%，相對峰面積的RSD均小于2.0%，所得色譜圖的相似度分別為0.984、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999，RSD＝0.61%，表明儀器的精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣測定，以重樓皂苷Ⅵ色譜峰為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.05%，相對峰面積的RSD均小于3.25%，所得色譜圖的相似度分別為0.991、0.987、0.999、0.998、0.999、0.997、0.997，RSD＝0.45%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.3 重復性試驗 取同一批藥材，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，以重樓皂苷Ⅵ為參照，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結(jié)果各共有峰相對保留時間的RSD均小于0.09%，相對峰面積的RSD均小于1.98%，所得色譜圖的相似度分別為0.999、0.998、1.000、0.999、0.999、0.999，RSD＝0.06%，表明本方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

按上述色譜條件對14批不同產(chǎn)地的頭頂一顆珠藥材進行測定，所得HPLC指紋圖譜見圖1。利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.130723版）對14批頭頂一顆珠藥材的色譜圖進行處理，以S8藥材樣品作為參照，通過多點校正，取中位數(shù)法生成HPLC共有模式圖（見圖2）。通過比對，確定了15個共有特征峰，其中12號峰為重樓皂苷Ⅶ，13峰為PRRG，14號峰為重樓皂苷Ⅵ。由圖2可知，重樓皂苷Ⅵ色譜峰分離度好，峰面積最大，峰位適中，為所有供試品共有，因此選定14號峰為參比峰（S）。

2.6 相似度評價

對14批不同產(chǎn)地頭頂一顆珠樣品的指紋圖譜進行比較分析，結(jié)果15個共有峰相對保留時間RSD在0.01%～1.24%范圍內(nèi)，相對峰面積RSD在17.31%～212.23%之間。采用相似度軟件進行分析，其相似度結(jié)果在0.389～0.979之間（見表1），表明不同產(chǎn)地頭頂一顆珠的質(zhì)量存在較大差異。

圖1 14批不同產(chǎn)地頭頂一顆珠HPLC指紋圖譜

注：12.重樓皂苷Ⅶ；13.PRRG；14.重樓皂苷Ⅵ

表1 14批不同產(chǎn)地頭頂一顆珠相似度評價（r）

2.7 主成分分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對14批不同產(chǎn)地頭頂一顆珠藥材的HPLC指紋譜圖數(shù)據(jù)進行主成分分析。相關(guān)系數(shù)矩陣見表2。當＞0.8時，說明2個變量間存在高度正相關(guān)。可見，成分2和成分3、4、6間存在較高正相關(guān)，成分3與成分4、10間存在較高正相關(guān)，成分4與成分6、9、10、12、13、14、15間存在較高正相關(guān)，成分6和成分7、9、10、12、13、14之間存在較高正相關(guān)，成分8和成分9、10、12、13、14間存在較高正相關(guān)，成分9和成分10、12、13、14間存在較高正相關(guān)，成分10和成分12、13、14間存在較高正相關(guān)，成分12和成分13、14間存在較高正相關(guān)，成分13與成分14間存在較高正相關(guān)。

主成分特征值及貢獻率見表3，主成分矩陣見表4。取特征值＞1作為提取標準，獲得前3個主成分的累積方差貢獻率為87.674%（＞85%），由此確定選取前3個主成分作為評價標準，集中代表了頭頂一顆珠藥材中15個成分87.674%的信息量。根據(jù)表3、表4可知，主成分1的特征值為9.712，累積方差貢獻率為64.745%，成分2、3、4、6、7、8、9、10、12、13、14這11個成分在主成分1有較高的載荷，說明主成分1能反映這11種成分的信息；同理依次分析主成分2、3。以主成分為變量，結(jié)合表4數(shù)據(jù)得到主成分載荷圖（見圖3）?？梢姡嚯x原點較遠的點為主成分1、2中載荷較高的成分，說明這幾個成分在頭頂一顆珠藥材質(zhì)量評價中起決定性作用。

利用上述3個主成分對不同產(chǎn)地頭頂一顆珠藥材質(zhì)量進行評價，計算各批藥材中3個主成分的單獨得分和綜合得分，結(jié)果見表5。可見，14批樣品的綜合得分在4.926～-3.645之間，表明各批藥材質(zhì)量存在較大差異，其中S2樣品綜合得分最高（4.926）、質(zhì)量最好，而S5樣品的綜合得分最低（-3.645）、質(zhì)量較差。3個主成分中，主成分1、2、3分別在8、4、2批藥材的綜合得分中占有較高的權(quán)重，主成分1所代表的11種成分與頭頂一顆珠藥材的質(zhì)量存在較高的相關(guān)性。

表2 15個成分相關(guān)系數(shù)矩陣（r）

表3 主成分初始特征值及貢獻率

表4 主成分矩陣

圖3 主成分載荷圖

表5 各主成分得分及綜合得分

3 討論

目前對頭頂一顆珠藥材的質(zhì)量評價方法主要有含量測定和指紋圖譜方法[10-11]。本研究建立了頭頂一顆珠藥材的HPLC指紋圖譜，方法學考察表明，此法可用于評價不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量的一致性。重樓皂苷Ⅵ是頭頂一顆珠的主要化學成分，較其他皂苷的含量高，因此選擇重樓皂苷Ⅵ作為參比峰。各產(chǎn)地藥材圖譜中的共有峰相對保留時間基本一致，但相對峰面積差異較大，反映了不同產(chǎn)地頭頂一顆珠的有效成分含量存在明顯差異。對14批不同產(chǎn)地藥材的相似度分析表明，S1與對照圖譜的相似度最高，而S6與其他產(chǎn)地樣品存在較大差異。通過對共有峰主成分的標定與分析得到不同產(chǎn)地頭頂一顆珠的綜合得分，結(jié)果顯示，S2綜合得分最高、質(zhì)量最好，S5得分最低。相似度分析與PCA結(jié)果存在明顯差異，主要原因在于相似度分析是對所有色譜峰進行對比分析，而PCA是將15個共有峰變量轉(zhuǎn)換為3個主要變量進行比對。相似度分析能更直觀地顯示樣品與對照圖譜存在的差異或其一致性，而PCA新生成的主成分具有代表性、獨立性和全面性，對這幾個主成分進行綜合分析對于評價藥材的質(zhì)量具有一定的合理性和客觀性。

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Evaluation of Quality Coherence ofMaxim. from Different Producing Areas Based on HPLC Fingerprint and PCA

CHEN Jie1,2, CHEN Wen-xi1, GUO Wen-ding1, LEI Tao1, OUYANG Jun-yao1,2, ZHAO Hui1,2, ZOU Hai-yan1,2

To evaluate the quality coherence ofMaxim. from different producing areas by HPLC fingerprint and PCA; To provide a method for quality control.Samples were separated by Hibar C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) with acetonitrile-water as gradient mobile phase at the flow rate of 1.0 mL/min. The wavelength was 203 nm and the temperature was 30 ℃. Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System and PCA were used to analyze the data.The results of method validation of HPLC fingerprint met technical standards. 15 common peaks was verified and the similarities of 14 batches ofMaxim. from different producing areas were among 0.389–0.979. 3 principal components with the characteristic root cumulative contribution rate reaching 87.674% were screened out by PCA results. The composite score of S2 was the highest (4.926), and the quality was the best.The application of HPLC combined with PCA can objectively and effectively evaluate the quality difference ofMaxim. from different producing areas.

Maxim.; fingerprint; HPLC; principal component analysis; similarity analysis

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.014

R284.1

A

1005-5304(2017)11-0058-05

（2017-04-10）

（2017-07-02；編輯：陳靜）

北京市教育委員會科技發(fā)展計劃面上項目（KM201510025011）；北京市屬高等學校青年拔尖人才培育計劃（CIT&TCD201404175）

鄒海艷，E-mail：bwzhy@sina.com