不同溫度艾灸對高脂血癥大鼠血脂及背根神經(jīng)節(jié)瞬時感受器電位香草酸受體1 mRNA表達(dá)的影響

王桂英，王耀帥，高建蕓，蘇方方，陳若暘

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不同溫度艾灸對高脂血癥大鼠血脂及背根神經(jīng)節(jié)瞬時感受器電位香草酸受體1 mRNA表達(dá)的影響

王桂英1，王耀帥2，高建蕓1，蘇方方3，陳若暘1

1.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇南京 210009； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210023； 3.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院研究生院，江蘇南京 210009

觀察不同溫度艾灸熱刺激對高脂血癥大鼠血脂及背根神經(jīng)節(jié)瞬時感受器電位香草酸受體1（TRPV1）mRNA表達(dá)的影響，驗(yàn)證艾灸調(diào)脂療效與激活TRPV1相關(guān)。采用高脂飼料喂養(yǎng)制作高脂血癥大鼠模型。將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、38 ℃艾灸組和45 ℃艾灸組，每組15只。38 ℃艾灸組和45 ℃艾灸組均取“神闕”和雙側(cè)“足三里”，每穴艾灸10 min/次，隔日1次，連續(xù)4周。干預(yù)結(jié)束后取血，氧化酶法檢測血清膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇含量；取背根神經(jīng)節(jié)組織，實(shí)時熒光定量PCR檢測TRPV1 mRNA表達(dá)。與模型組比較，艾灸組血脂指標(biāo)均得到不同程度的調(diào)整，45 ℃艾灸組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01），且45 ℃艾灸組與38 ℃艾灸組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；45 ℃艾灸組較其他3組背根神經(jīng)節(jié)TRPV1 mRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。艾灸調(diào)脂療效與艾灸激活TRPV1相關(guān)。

灸溫；瞬時感受器電位香草酸受體1；血脂；大鼠

艾灸臨床療效有針刺治療所不及的優(yōu)勢?！鹅`樞·官能》云：“針?biāo)粸?，灸之所宜?！眳菬ㄤ频萚1]認(rèn)為，以灸法臨床有效的病癥為載體，開展基于臨床灸法作用機(jī)理研究，闡明艾灸作用特點(diǎn)及機(jī)理，有利于灸法研究的新發(fā)展。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，不同溫度艾灸熱刺激對急性高脂血癥模型小鼠膽固醇調(diào)整有差異[2]，為了研究艾灸調(diào)整其他血脂組分的普遍意義及與瞬時感受器電位香草酸受體1（TRPV1）相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)仍以臨床灸法的有效病種高脂血癥為載體，選用慢性高脂血癥模型大鼠，以不同溫度（38 ℃和45 ℃）作為實(shí)驗(yàn)的干預(yù)條件，觀察不同溫度艾灸對高脂血癥大鼠血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的影響及艾灸后大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPV1 mRNA表達(dá)的差異，以期為艾灸的效應(yīng)機(jī)制與TRPV1通道蛋白的普遍相關(guān)性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

SPF級健康雄性SD大鼠60只，4周齡，體質(zhì)量（100±20）g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物許可證號SCXK（滬）2013-0016。飼養(yǎng)于東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院清潔級實(shí)驗(yàn)動物中心，溫度24～26 ℃，相對濕度45%～55%，光照12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。高脂飼料（酪蛋白、蔗糖、玉米淀粉等），北京華阜康生物科技股份有限公司。

1.2 儀器

直徑7 mm動物用清艾灸條（南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司），溫度測量儀（HC-04型，杭州洪昌科技有限公司），熒光定量PCR循環(huán)儀（中山達(dá)安基因股份有限公司，DA7600），核酸電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6B），手術(shù)顯微光鏡（上海醫(yī)光儀器有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模及分組

參考文獻(xiàn)[3]方法，采用高脂飼料喂養(yǎng)，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行造模，自由進(jìn)食高脂飼料，喂養(yǎng)8周，次日晨空腹抽血，檢測血脂4項(xiàng)，判定造模成功與否。實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、38 ℃艾灸組、45 ℃艾灸組，每組15只。

2.2 控溫預(yù)實(shí)驗(yàn)

保持室溫26 ℃，將SD大鼠穴位區(qū)1 cm×2 cm鼠毛剃除，暴露局部皮膚，酒精棉球消毒。用自制固定袋仰臥位固定大鼠，待大鼠安靜后進(jìn)行艾灸，將溫度測量儀探頭置于施灸穴位皮膚表面以檢測實(shí)時溫度，將艾條吹至紅火狀態(tài)，靠近穴位皮膚，當(dāng)溫度檢測達(dá)到理想溫度后稍抬高艾條，繼續(xù)施灸，當(dāng)溫度下降時降低艾條，控溫過程中及時彈艾灰、吹艾條，持續(xù)穩(wěn)定控制溫度，上下波動不超過1 ℃，測量艾條與艾灸穴位皮膚的垂直距離。預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果：38 ℃艾灸組施灸溫度控制在（38±1）℃，艾條距離穴位皮膚（35±5）mm；45 ℃艾灸組施灸溫度控制在（45±1）℃，艾條距離穴位皮膚（10±2）mm。

2.3 干預(yù)方法

成模后當(dāng)日進(jìn)行干預(yù)，保持室溫26 ℃，將SD大鼠穴位區(qū)1 cm×2 cm鼠毛剃除，暴露局部皮膚，酒精消毒。用自制固定袋仰臥位固定大鼠，待大鼠安靜后進(jìn)行艾灸。采用控溫預(yù)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行不同溫度施灸，將溫度控制儀探頭置于施灸穴位皮膚表面以檢測實(shí)時溫度，通過調(diào)節(jié)艾條與穴位皮膚的距離，吹艾火、彈艾灰頻率控制溫度。38 ℃艾灸組施灸溫度控制在（38±1）℃，45 ℃艾灸組施灸溫度控制在（45±1）℃。2組均施灸“神闕”“足三里”（雙側(cè)），每穴每次10 min，隔日治療1次，連續(xù)治療4周。正常組只做抓取固定，隔日1次。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 血脂 治療結(jié)束后，所有實(shí)驗(yàn)大鼠迅速眼眶取血，3500 r/min離心10 min，取上清液置于0.5 mL EP管中，氧化酶法檢測血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

2.4.2 瞬時感受器電位香草酸受體1 mRNA表達(dá) 所有實(shí)驗(yàn)大鼠迅速放血處死后，即刻沿脊柱剪開背部皮膚，在冰浴上分離脊柱，沿脊髓腹側(cè)面剪開椎管，剪斷并剝離神經(jīng)纖維，在手術(shù)顯微光鏡下使用顯微鑷從錐孔中取出腰段背根神經(jīng)節(jié)，清除殘余神經(jīng)纖維，將背根神經(jīng)節(jié)放入凍存管，液氮保存。先進(jìn)行RNA提取，再測定其純度和濃度，質(zhì)量測定后，進(jìn)行cDNA第一鏈合成，反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，再行RT-qPCR實(shí)驗(yàn)，每個樣本基因設(shè)3個復(fù)孔，反應(yīng)體系：2×Real time PCR Master Mix（SYBR Green）10 μL，模板（cDNA稀釋10倍）1 μL，引物Mix（F/R各為10 μmol/L）2 μL，DEPC水7 μL，20 μL。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 不同溫度艾灸熱刺激對模型大鼠血脂指標(biāo)的影響

與正常組比較，模型組血清TC、TG、LDL-C、HDL-C變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，艾灸組血脂各項(xiàng)指標(biāo)均有調(diào)整，但僅45 ℃艾灸組血脂各項(xiàng)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01），且45 ℃艾灸組與38 ℃艾灸組各項(xiàng)血脂指標(biāo)比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血脂水平比較（±s，mmol/L）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，▲＜0.05，▲▲＜0.01；與38 ℃艾灸組比較，**＜0.01

4.2 不同溫度艾灸熱刺激對模型大鼠背根神經(jīng)節(jié)瞬時感受器電位香草酸受體1 mRNA表達(dá)的影響

各組TRPV1 mRNA相對表達(dá)量兩兩比較，45 ℃艾灸組與其他3組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），見圖1。

注：與45 ℃艾灸組比較，△△P＜0.01

5 討論

高脂血癥的基本病機(jī)，清代醫(yī)家張志聰注解《內(nèi)經(jīng)》時較完整的敘述為：中焦之氣蒸津液化其精微，發(fā)泄于腠理，淖澤注于骨，補(bǔ)益髓腦，潤澤皮膚，是津液注于三百六十五節(jié)而滲灌于皮膚肌腠者也。溢于外則皮肉膏肥，余于內(nèi)則膏脂豐滿。高脂血癥的治療，西醫(yī)主要以調(diào)脂藥物為主，針灸治療高脂血癥療效肯定。劉志誠[4]認(rèn)為，針灸調(diào)脂機(jī)制在于調(diào)整與脂質(zhì)代謝相關(guān)的多種酶的功能，增強(qiáng)其活性，使血脂各項(xiàng)水平被很快代謝，促進(jìn)肝腸循環(huán)，而降低血脂含量。本課題組前期臨床研究已經(jīng)證實(shí)，溫灸對高脂血癥患者有良好的調(diào)脂作用，且艾灸溫度是影響艾灸調(diào)脂療效的決定性因素之一，不同灸溫調(diào)脂療效有差異[5-6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，45 ℃艾灸組干預(yù)TC、TG、LDL-C、HDL-C效應(yīng)明顯優(yōu)于38 ℃艾灸組，同樣表明溫度是影響灸法療效的重要因素。

關(guān)于灸法的作用機(jī)制研究，《靈樞·刺節(jié)真邪》有“火氣已通，血脈乃行”，《外臺秘要》有“火氣不行，不能除病也”。古代醫(yī)家認(rèn)為艾灸療效的實(shí)現(xiàn)以“火氣已通”為標(biāo)志，“火氣已通”必須要有一定強(qiáng)度的溫?zé)岽碳ぁＭ醣ⅲ骸盎鸢瑹?，謂之灸焫。”強(qiáng)調(diào)燒灼是艾灸的關(guān)鍵技術(shù)。有學(xué)者指出，艾火的刺激造就了灸法疏通氣血的效應(yīng)特征，溫?zé)岽碳な前牡闹饕碳?，是艾灸效?yīng)產(chǎn)生的主要影響因素，也是艾灸溫通作用機(jī)制的基礎(chǔ)[7]。

近年來很多針灸實(shí)驗(yàn)研究也關(guān)注施灸溫度與效應(yīng)的關(guān)系，認(rèn)為不同施灸溫度產(chǎn)生的效應(yīng)不一樣。李亮等[8]發(fā)現(xiàn)，溫度達(dá)46 ℃以上，熱刺激面積與大鼠延髓背側(cè)網(wǎng)狀亞核神經(jīng)元的放電活動呈線性相關(guān)。Wang Y SH等[9]研究發(fā)現(xiàn)，46 ℃艾灸熱刺激比38 ℃艾灸熱刺激對大鼠心血管功能的影響更有意義。周攀等[10]研究發(fā)現(xiàn)，施灸溫度不同，抗炎效果也有差異。

艾灸療法是通過對穴位局部皮膚的溫?zé)岽碳ぐl(fā)揮治療作用的，現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)軀體及皮膚組織中分布有感受不同溫度范圍的蛋白受體TRP。TRP亞家族成員之一TRPV1又被稱為辣椒素受體，是熱控離子通道，它能調(diào)節(jié)小直徑的神經(jīng)元對適度熱刺激反應(yīng)，43 ℃熱刺激能直接激活TRPV1，它可能是熱痛感受器的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。還有研究發(fā)現(xiàn)TRPV1通道在小鼠的熱刺激感受中可能起主要作用[11]。

本實(shí)驗(yàn)研究不同溫度艾灸的效應(yīng)及與TRPV1的相關(guān)性，設(shè)定2組溫度要分別高于和低于TRPV1的激活溫度43 ℃，且具有實(shí)驗(yàn)可行性。課題組前期研究表明，溫、熱、灼、痛4種不同灸感對應(yīng)的溫度范圍有別，“溫”的溫度范圍大概在32.8～35.8 ℃，“熱”的溫度范圍大概在36.8～39.9 ℃，“灼”的溫度范圍大概在40.9～43.5 ℃，“痛”的溫度≥44.5 ℃。高于45 ℃大部分人表現(xiàn)為難以忍受的灸痛。溫度感受個體差異很大，38 ℃低于43 ℃，接近于體溫，人體感覺舒適；45 ℃高于43 ℃，艾灸時有明顯灼熱痛感，但能忍受[12]。因此，我們選用這2種溫度作為干預(yù)條件。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，45 ℃艾灸組較38 ℃艾灸組背根神經(jīng)節(jié)組織TRPV1 mRNA表達(dá)明顯升高，這與調(diào)脂結(jié)果相一致。說明TRPV1是艾灸效應(yīng)的重要的分子靶點(diǎn)，艾灸調(diào)脂效應(yīng)啟動機(jī)制與激活TRPV1相關(guān)，至于激活TRPV1后的相關(guān)生物化學(xué)反應(yīng)，及與TRP家族其他成員尤其是TRPV3的聯(lián)系，尚不明確，亟待深入研究。

艾灸主要是溫?zé)岽碳?，患者有灼熱感。艾灸對機(jī)體的有效刺激應(yīng)該具有一定的溫度閾值范圍，即適宜的艾灸溫?zé)岽碳?，艾灸臨床適宜的溫度可能是高于TRPV1熱刺激溫度43 ℃，且患者能夠承受的溫度，至于怎樣的溫度合適，是否有個體和病種及穴位差異，還需進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。

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Effects of Moxibustion at Different Temperatures on Blood Lipids and TRPV1 mRNA in Dorsal Root Ganglion with Hyperlipidemia Rats

WANG Gui-ying1, WANG Yao-shuai2, GAO Jian-yun1, SU Fang-fang3, CHEN Ruo-yang1

To compare the effects of moxibustion at different temperatures on blood lipid and TRPV1 in dorsal root ganglion with hyperlipidemia rats; To verify the correlation between efficacy of adjusting fat of moxibustion with activating of TRPV1.The rat model of hyperlipidemia was made by high fat diet. 60 SD mice were randomly divided into four groups: control group, model control group, the 38 ℃ moxibustion group and the 45 ℃ moxibustion group, with 15 mice in each group. Acupoints Shenque and Zusanli were chosen under moxibustion for 10 minutes each time, once another day, for 4 weeks, in the 38 ℃ moxibustion group and the 45 ℃ moxibustion group. Blood was taken after intervention, and blood TC, TG, LDL-C and HDL-C of the mice were detected by oxidase method; the dorsal root ganglion was taken to detect the expression of TRPV1 mRNA by real-time fluorescence quantitative PCR.Compared with model group, blood lipid indexes in moxibustion groups had different changes, with statistical significance compared with 45 ℃ moxibustion group (<0.05,<0.01), and there was statistical significance between 38 ℃ moxibustion group and 45 ℃ moxibustion group (<0.01); there was statistical significance in TRPV1 mRNA of dorsal root ganglion among 45 ℃ moxibustion group and other three groups (<0.01).The correlation between efficacy of adjusting fat of moxibustion with activating of TRPV1 has been confirmed.

moxibustion temperature; TRPV1; blood lipid; rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.11.011

R245

A

1005-5304(2017)11-0044-04

（2017-01-31）

（2017-03-21；編輯：華強(qiáng)）

國家自然科學(xué)基金（81603695、81503648）