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    粒度對(duì)固態(tài)發(fā)酵豆粕產(chǎn)肽的影響研究

    2014-01-21 08:24:50管軍軍李世豪韓丙倩程云龍
    飼料工業(yè) 2014年17期
    關(guān)鍵詞:溶性空隙豆粕

    ■管軍軍 李世豪 韓丙倩 程云龍

    (河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,河南鄭州450001)

    固態(tài)發(fā)酵豆粕,是利用固態(tài)發(fā)酵手段,將豆粕這種植物源蛋白與微生態(tài)技術(shù)相結(jié)合,提升豆粕的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,改善豆粕適口性的技術(shù)。固態(tài)發(fā)酵豆粕是目前研究的熱點(diǎn),隨著發(fā)酵技術(shù)的進(jìn)步,發(fā)酵豆粕的品質(zhì)也不斷提高,不過(guò)發(fā)酵過(guò)程中依然有一些問(wèn)題亟待解決。目前對(duì)于發(fā)酵豆粕的研究主要集中在優(yōu)化菌種配比,發(fā)酵條件如發(fā)酵溫度,pH值,發(fā)酵時(shí)間等,但研究豆粕粒度對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響的較少[1]。

    固態(tài)發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)粒徑對(duì)發(fā)酵前中后期都有巨大影響,目前對(duì)其研究較少是因?yàn)椴煌陌l(fā)酵基質(zhì)形態(tài)差別較大,其結(jié)果不具有普適性。不過(guò)對(duì)于豆粕來(lái)說(shuō),由于生產(chǎn)加工手段的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化,豆粕粒度基本保持在一個(gè)可控的范圍內(nèi)[2],因此研究不同豆粕粒度對(duì)于發(fā)酵結(jié)果的影響具有一定的意義。

    豆粕粒徑對(duì)固態(tài)發(fā)酵的影響主要體現(xiàn)在兩點(diǎn),豆粕間隙含氧量及菌體與基質(zhì)接觸面積。由于固態(tài)發(fā)酵的通風(fēng)散熱相對(duì)液態(tài)發(fā)酵困難,因此,發(fā)酵基質(zhì)間隙氧含量對(duì)于發(fā)酵結(jié)果影響很大;同樣菌體與基質(zhì)接觸面積大,則對(duì)基質(zhì)的降解更加充分,發(fā)酵效率更高[3]。本試驗(yàn)旨在得出豆粕發(fā)酵的最佳粒度,為固態(tài)發(fā)酵豆粕技術(shù)的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。

    1 試驗(yàn)與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    豆粕:粗蛋白含量46%,酸溶性小肽含量1.22%(河南陽(yáng)光油脂集團(tuán));枯草芽孢桿菌BS-GA15(潤(rùn)盈生物工程[上海]有限公司);小分子蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品(Marker)(生工生物工程[上海]有限公司);其他試驗(yàn)藥品均通過(guò)鄭州新豐化驗(yàn)器材有限公司購(gòu)買。

    1.2 主要儀器設(shè)備

    XSB-88型頂擊式振動(dòng)機(jī),篩搖次數(shù)221次/min,振擊次數(shù)147次/min;4~100目分樣篩;SF-400電子秤;SPX-250B智能型生化培養(yǎng)箱;JP-100A-2高速多功能粉碎機(jī);TGL-16B臺(tái)式離心機(jī);TDL-5-A臺(tái)式離心機(jī);JY600C電泳儀;722N可見(jiàn)分光光度計(jì);DHG-9070B智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

    1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.3.1 豆粕粒徑分布的測(cè)定

    根據(jù)振動(dòng)機(jī)裝填量及對(duì)豆粕粒度的初步判斷選擇4、8、12、16、20、40、60、80、100目孔徑的篩子對(duì)豆粕篩分。為排除取樣誤差,按照四分法,取樣5次,篩子按照孔徑由大到小順序依次向下疊摞。將所取樣品依次加入4目篩中,放入振動(dòng)機(jī)中振動(dòng)10 min,取下篩子,分別稱量各個(gè)篩子中豆粕質(zhì)量,計(jì)算平均值,按照質(zhì)量比例確定不同粒徑豆粕在總體中所占比例。

    1.3.2 豆粕空隙率的測(cè)定及比表面積

    參照GB/T 5518-2008糧食、油料相對(duì)密度的測(cè)定中的量筒法,在室溫(22±5)℃下,向量筒中加入20%乙醇10 ml,然后放入樣品約5 g(精確至0.01 g),稍加搖動(dòng),逐出氣泡,待液面平穩(wěn)后,立即讀出液面上升體積(V1),稱量相同質(zhì)量豆粕,放入量筒中讀出體積(V2)。則空隙率=(V2-V1)/V2。其比表面積根據(jù)豆粕直徑大小計(jì)算得到。

    1.3.3 發(fā)酵試驗(yàn)

    1.3.3.1 培養(yǎng)基及發(fā)酵

    發(fā)酵選用菌種為枯草芽孢桿菌,在發(fā)酵過(guò)程中,隨著菌體的繁殖,能夠產(chǎn)生大量蛋白酶[4],促進(jìn)小肽的生成。為了使菌種更好地適應(yīng)固態(tài)發(fā)酵環(huán)境,種子液培養(yǎng)基用優(yōu)化的豆粕培養(yǎng)基:100目以下豆粕40 g,葡萄糖20 g,蒸餾水1 L;接種量按照質(zhì)量體積比9∶1接種,即每100 g發(fā)酵基質(zhì),接種10 ml對(duì)數(shù)期種子液;料水比6∶4;發(fā)酵前,先將種子液混入所需體積水中,搖勻后拌入豆粕中,攪拌均勻后覆蓋8層無(wú)菌紗布進(jìn)行發(fā)酵。

    發(fā)酵所用的豆粕是具有代表性的4~8目,16~20目,20~40目,80目以下4種粒徑的豆粕,原始豆粕作為對(duì)照組,每組設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn);發(fā)酵溫度32℃,每12 h取一次樣,共取5次,共計(jì)發(fā)酵時(shí)間60 h。樣品在50℃下烘干8 h,之后粉碎篩選60目以下樣品,測(cè)定其酸溶性小肽的含量,并以其含量的高低判斷發(fā)酵結(jié)果的優(yōu)劣。

    1.3.3.2 酸溶性小肽測(cè)定

    酸溶性小肽是豆粕中大分子蛋白質(zhì)降解后的產(chǎn)物,研究表明小肽比蛋白質(zhì)、氨基酸更容易吸收,因此酸溶性小肽含量的高低能夠反映發(fā)酵結(jié)果的優(yōu)劣[5]。本試驗(yàn)采用雙縮脲法測(cè)定酸溶性小肽含量。具體方法:稱取1 g豆粕樣品,定容于50 ml 15%三氯乙酸溶液中,搖勻后靜置5 min,提取其中的酸溶性蛋白,然后過(guò)濾取濾液;準(zhǔn)確取1 ml濾液于試管中,加入5 ml 0.1 g/ml NaCl溶液,使溶液呈堿性,搖勻后加入1 ml 0.01 g/ml CuSO4溶液并搖勻,反應(yīng)30 min后將反應(yīng)液在4 000 r/min條件下離心5 min。取上清液在540 nm下測(cè)定吸光度。用同樣的方法,測(cè)定一系列已知濃度的牛血清蛋白溶液,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算各樣品中小肽含量。

    1.3.3.3 發(fā)酵過(guò)程中豆粕體積變化

    豆粕加水后,體積膨脹,發(fā)酵開(kāi)始后,由于水分的蒸發(fā)等因素,豆粕的體積又會(huì)收縮,縮小的體積與發(fā)酵前(加水后)體積的比值記作豆粕體積收縮率(Vs)。Vs在每次取樣前通過(guò)測(cè)定發(fā)酵豆粕界面下降高度計(jì)算得到。這個(gè)數(shù)值能反映發(fā)酵狀態(tài)下豆粕顆粒間氧含量的變化。

    1.3.4 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)利用SAS 9.0軟件進(jìn)行分析。

    2 結(jié)果和討論

    2.1 豆粕粒度分布

    按照上述試驗(yàn)方法,對(duì)豆粕進(jìn)行篩分,豆粕全部通過(guò)4目篩,以相鄰篩子孔徑值為區(qū)間,對(duì)豆粕粒徑進(jìn)行劃分。不同粒徑豆粕在總樣品的含量比值見(jiàn)圖1。

    圖1 不同粒徑豆粕在總樣品中含量

    從圖1可以看到,豆粕中各粒徑分布呈現(xiàn)中間高,兩邊低的趨勢(shì);16~20目,20~40目的豆粕最多,各占22%,共占所有豆粕的44%,接近一半;8~60目豆粕共占總樣品的86%;說(shuō)明在一定粒徑范圍內(nèi)分布比較集中。發(fā)酵試驗(yàn)選擇4~8目豆粕(其粒徑最大),16~20目豆粕,20~40目豆粕(含量最多),以及粒徑最小的80目以下豆粕,原始豆粕為對(duì)照組,依次將其編號(hào)為A、B、C、D、E。

    2.2 豆粕空隙率

    參照GB/T 5518-2008所測(cè)得各粒徑空隙率如圖2所示。

    圖2 各粒徑豆粕空隙率

    從圖2可以看出,空隙率的變化為先降低后升高,其中最低點(diǎn)為20~40目的豆粕。影響豆粕空隙率的因素有豆粕粒徑大小及豆粕顆粒形狀。大粒徑豆粕,容易構(gòu)成大的顆粒間空隙,因此4~40目的豆粕,粒徑越大,空隙率越大;但是40目以下粒徑的豆粕,自身表面有更多的突起,使得堆積狀態(tài)下豆粕顯得更膨松,也就是空隙率更大。顯微鏡下觀察不同粒徑豆粕顆粒,如圖3所示,豆粕顆粒表面是凹凸不平的,并且有許多刺狀或耳裝突起。這些突起使得豆粕堆積期間不能完全整齊排列,形成豆粕間空隙??障堵适求w現(xiàn)發(fā)酵初期基質(zhì)間氧含量的重要指標(biāo),氧含量越高,好氧菌的繁殖越快,能夠縮短發(fā)酵時(shí)間。

    2.3 不同粒徑豆粕的比表面積

    豆粕的比表面積會(huì)影響細(xì)菌與豆粕的接觸面積,發(fā)酵過(guò)程中,細(xì)菌與豆粕的接觸面積越大,豆粕被分解的速率越大。A、B、C、D、E 5種粒徑的豆粕比表面積基本與直徑成反比。直徑越大,比表面積越小,因此比表面積A<E<B<C<D。

    2.4 發(fā)酵過(guò)程中體積收縮率的測(cè)定

    將樣品A、B、C、D、E按照料水比6∶4加水接種后,在發(fā)酵過(guò)程中,由于水分的蒸發(fā),微生物的降解,豆粕表面的突起逐漸變小,變平,豆粕顆粒之間距離變小,豆粕總體積降低。發(fā)酵所用的各粒徑豆粕的體積變化如圖4所示。

    豆粕體積收縮率表示發(fā)酵過(guò)程中基質(zhì)間隙的減小,這表示豆粕間溶氧的減小,從圖4可以看到,粒徑越大的豆粕,體積收縮越小。這是因?yàn)榱酱蟮亩蛊?,邊緣突起更加?jiān)固,經(jīng)發(fā)酵后還能保持一定的硬度,能夠保持空隙的形成。而粒徑小的豆粕,經(jīng)過(guò)水的浸泡,微生物的侵蝕,硬度降低,凸起的邊緣提供的摩擦力小于豆粕自身的重力,因此豆粕整體體積收縮。

    圖3 不同粒徑豆粕顯微觀察

    圖4 發(fā)酵過(guò)程中豆粕體積收縮率

    2.5 發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果

    對(duì)發(fā)酵過(guò)程中取出的樣品進(jìn)行測(cè)定,其酸溶性小肽含量見(jiàn)表1。

    表1 發(fā)酵過(guò)程中不同粒徑豆粕產(chǎn)酸溶性小肽含量(%)

    對(duì)24 h各個(gè)樣品,以及80目以下試驗(yàn)組各個(gè)樣品處理后,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,觀察豆粕中蛋白分解為酸溶性小肽的情況,如圖5所示。

    圖5 各粒度試驗(yàn)組在24 h的發(fā)酵樣品電泳圖

    圖5中,1、2、3、4、5對(duì)應(yīng)A、B、C、D、E五種粒度,M為Marker條帶。由圖5可以看出80目以下粒徑試驗(yàn)組在24 h時(shí),大分子蛋白降解最多,與表1中該取樣點(diǎn)有最優(yōu)試驗(yàn)結(jié)果相符合。

    對(duì)同一時(shí)間段的結(jié)果進(jìn)行多重比較,發(fā)酵12 h及24 h,80目以下粒徑豆粕發(fā)酵結(jié)果較其他粒徑極顯著,發(fā)酵結(jié)果最好,而4~8目豆粕酸溶性小肽含量最低;發(fā)酵36 h以后,各粒徑豆粕發(fā)酵結(jié)果差異不顯著;由此可知,豆粕粒徑不同對(duì)于發(fā)酵結(jié)果的影響作用在36 h之前,36 h之后,粒徑因素對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響不顯著。

    由表1可知,發(fā)酵時(shí)間12 h,粒徑最小的豆粕肽含量最高,這與其最大的空隙率成正相關(guān)。但20~40目試驗(yàn)組的肽含量比4~8目及16~20目試驗(yàn)組高,這是因?yàn)?0~40目試驗(yàn)組豆粕比表面積更大,微生物與豆粕接觸面積大,對(duì)豆粕利用效率更高。

    整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中,酸溶性小肽含量最高值為7.66%,對(duì)應(yīng)樣品為80目以下豆粕,發(fā)酵24 h。可以看出空隙率高,比表面積大對(duì)于前期菌種的繁殖起到了積極的作用。

    不過(guò)在36 h以后,除了80目以下試驗(yàn)組酸溶性小肽含量開(kāi)始降低外,其余試驗(yàn)組小肽含量仍呈上升狀態(tài)。結(jié)合發(fā)酵過(guò)程中豆粕體積的收縮率,可以發(fā)現(xiàn),80目以下豆粕在各個(gè)時(shí)間段體積收縮最多,豆粕間隙越來(lái)越小,36 h時(shí)不能滿足細(xì)菌的繼續(xù)生長(zhǎng),細(xì)菌進(jìn)入衰退期,反而消耗小肽。而且80目以下豆粕含量只有3%,如果用這個(gè)粒度發(fā)酵則需要對(duì)豆粕進(jìn)行粉碎處理,需要消耗巨大能量,綜合比較,選取含量較多的20~40目豆粕進(jìn)行發(fā)酵較為合適。

    3 結(jié)論

    豆粕中不同粒徑的豆粕含量分布呈現(xiàn)中間高,兩邊低的趨勢(shì),并且16~40目的豆粕占到44%的比例。

    豆粕的空隙率呈現(xiàn)兩邊高,中間低的趨勢(shì),最低點(diǎn)出現(xiàn)在20~40目豆粕處,40目以下的豆粕空隙率普遍比40目以上豆粕大。

    較大的豆粕空隙率與比表面積都能在一定程度上提升發(fā)酵結(jié)果,但是在它們最大的時(shí)候,豆粕粒徑卻是最小的,在發(fā)酵過(guò)程中,體積收縮率最大,不利于長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵。

    最佳發(fā)酵條件為粒徑80目以下豆粕,發(fā)酵24 h,但考慮到80目以下豆粕含量只占3%,因此可以考慮含量最大的粒徑20~40目豆粕發(fā)酵。

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