HPLC-FLD測定水中聯(lián)苯胺的方法研究

張秀藍，郭 婧，任立軍，朱超飛，楊文龍，劉金林，吳忠祥，董 亮，杜 兵

國家環(huán)境分析測試中心,國家環(huán)境保護二英污染控制重點實驗室,北京 100029

HPLC-FLD測定水中聯(lián)苯胺的方法研究

張秀藍，郭 婧，任立軍，朱超飛，楊文龍，劉金林，吳忠祥，董 亮，杜 兵

探討了利用液相色譜分離,熒光檢測器測定地表水中聯(lián)苯胺的可行性。前處理方法對比驗證了液液萃取法和固相萃取法。水樣在堿性條件下(pH=11～12)進行提取,當提取體積為1.0 L時,液液萃取液相色譜熒光法檢測,方法檢出限為1.4 ng/L,定量下限為5.5 ng/L；固相萃取液相色譜熒光法檢測，方法檢出限為0.9 ng/L,定量下限為3.6 ng/L。分別對地表水、生活廢水、工業(yè)廢水3種不同水體進行基體加標試驗，加標濃度為10.0、40.0、80.0 ng/L。結(jié)果顯示, 對于3種不同基體和不同加標濃度的水樣, 兩種方法均有較好的準確性和重現(xiàn)性,方法回收率為80%～120%, 相對標準偏差均小于20%, 滿足《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 3838—2002)中對聯(lián)苯胺的監(jiān)測需求。

水體; 固相萃取法; 液液萃取法; 液相色譜分離；熒光測定; 聯(lián)苯胺

Abstract:Due to the limiting value of benzidine in water, high performance liquid chromatography with fluorescence detector (HPLC-FLD) was employed to try to meet the monitoring demand. For the pretreatment, two classic methods—both liquid-liquid extraction and solid-phase extraction, were verified and compared. Under the condition of basic (pH=11-12), benzidine was extracted by methylene chloride from 1 L water, and detected by HPLC-FLD, the method detection limit (MDL) was 1.4 ng/L, and the quantitative limit was (QL) 5.5 ng/L; With the same instrument conditions, the MDL and QL were 0.9 and 3.6 ng/L for solid phase extraction method. In order to test the accuracy and precision of these two methods, three kinds of matrix spiking were proceeding. While, the water types were surface water, wastewater and industrial wastewater, and the standard were added 10.0, 40.0 and 80.0 ng/L, respectively. According to the results, for both methods had good accuracy and reproducibility, recoveries were between 80%-120%, and relative standard deviations were less than 20%. It’s confirmed that HPLC-FLD was an effective way to monitor benzidine in water.

Keywords:water;solid phase extraction;liquid-liquid extraction;liquid chromatographyseparation;fluorescence detection;benzidine

聯(lián)苯胺(圖1)是4,4′-二氨基聯(lián)苯的俗稱, 國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)將其列屬于第一類致癌物質(zhì)。我國對聯(lián)苯胺的水環(huán)境濃度要求嚴苛，《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 3838—2002)規(guī)定地表水中聯(lián)苯胺限值為0.000 2 mg/L[1]。檢測方法參考《水和廢水標準檢驗法》(第15版)[2], 氣相色譜法, 最低檢出限為0.000 2 mg/L。聯(lián)苯胺的檢測方法還包括：分光光度法[3], 檢出范圍在0～4.0 mg/L; 液相色譜法[4], 檢出限為0.14 ng/mL(即0.14 μg/L); 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[5], 檢出限為0.09 μg/L。上述方法中僅有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法可滿足我國對聯(lián)苯胺的要求。雖然，國內(nèi)外已建立或正在建立關(guān)于苯胺類的標準方法，但均未涉及聯(lián)苯胺的檢測[6-8]

常規(guī)GC-FID法，前處理復雜，選擇性差，檢出限與限值要求一致[1-2]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法試驗成本高且設(shè)備昂貴，在日常推廣應(yīng)用中有一定的困難。本文對比驗證了液液萃取法和固相萃取法在分析聯(lián)苯胺的可行性。檢測手段使用超高效液相色譜法分離, 熒光檢測器檢測, 驗證其滿足地表水監(jiān)測需求的可行性。聯(lián)苯胺是二元弱堿, 基于其理化性質(zhì), 固相萃取法對比了親水親脂性固相萃取柱(PEP)和弱陽離子交換柱(PWCX)的差異。

圖1 聯(lián)苯胺Fig.1 Benzidine

1 實驗部分

1.1儀器和試劑

高效液相色譜儀, 配有二極管陣列和熒光檢測器, Agilent 1260;色譜柱：ZORBAX C18柱

2.1 mm×100 mm×3.5 μm。

PEP(200 mg, 6 cc)和PWCX(150 mg, 6 cc)固相萃取小柱購自天津。

實驗用水為Milli-Q 水(Millipore, Bedford, MA, USA);乙腈(CH3CN,色譜純) 和甲醇(CH3OH, 色譜純); 氨水(NH3·H2O, 25%, 色譜純), 美國; 乙酸(CH3COOH, 優(yōu)級純), 乙酸銨(CH3COONH4, 優(yōu)級純), 氫氧化鈉(NaOH, 優(yōu)級純)和氯化鈉(NaCl, 優(yōu)級純)均購自北京化工廠。

聯(lián)苯胺(美國), 純度98%。

1.2實驗流程

結(jié)合聯(lián)苯胺的親水性和弱堿性, 研究對比了液液萃取和兩種固相萃取柱的富集效果, 預(yù)處理過程如圖2所示。聯(lián)苯胺為弱堿性化合物, 為提高萃取效率, 需在堿性條件下進行提取或富集; 有研究表明, 在堿性條件下富集, 能夠避免酚類化合物的干擾[9]。

注：PEP為親水親脂性填料的固相萃取; PWCX為弱陽離子交換填料的固相萃取; LLE為液液萃取。全文同。圖2 水樣中聯(lián)苯胺萃取流程Fig.2 The flow chart of extract benzidine from water

液液萃?。簻蚀_量取1.0 L水樣,放于分液漏斗中，加入30 g NaCl, 用1 mol/L NaOH溶液將樣品pH調(diào)節(jié)至11～12, 再用30 mL二氯甲烷分3次提取其中的聯(lián)苯胺, 合并后的提取液經(jīng)濃縮后轉(zhuǎn)換溶劑為乙腈, 并定容為1 mL。

PEP固相萃?。篜EP是親水親脂性的吸附填料, 適用于水溶性較強的有機物質(zhì)富集, 使用前依次用甲醇(6 mL)和高純水(6 mL)清洗。水樣通過PEP柱前，用1 mol/L NaOH溶液將樣品pH調(diào)節(jié)至11, 再以10 mL/min流速通過小柱, 然后用5 mL 10%甲醇水溶液清洗小柱，棄掉流出部分, 充分干燥小柱后, 用6 mL甲醇洗脫得到目標物。洗脫液經(jīng)濃縮后轉(zhuǎn)換溶劑為乙腈, 并定容為1 mL。

PWCX固相萃?。篜WCX是親水親脂性的吸附填料, 由于含有[COOH]基團, 適用于弱堿性物質(zhì)的富集。使用PWCX柱富集水樣時, 水樣保持中性，并以10 mL/min流速通過小柱，然后用6 mL 2%甲酸溶液將聯(lián)苯胺固定在柱體, 再使用6 mL純甲醇強力清洗小柱，以去除其他化合物干擾, 最后使用6 mL 2%氨水甲醇洗脫得到目標物。洗脫液經(jīng)濃縮后轉(zhuǎn)換溶劑為乙腈, 并定容為1 mL。

1.3儀器條件

色譜條件：色譜柱為ZORBAX C18柱 2.1 mm×100 mm×3.5 μm, 柱溫為30 ℃, 流速1.00 mL/min, 進樣量5.0 μL, 流動相A為甲醇, B為pH=4.5 醋酸銨-醋酸緩沖溶液, 梯度洗脫。 洗脫條件：60% B相起始并保持4 min, 然后在第8 min B相降低為50%, 第12 min B相降低至10%并保留3 min, 在第16 min回到起始狀態(tài)平衡4 min。熒光檢測器的激發(fā)/發(fā)射波長為290 nm/410 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1提取方法比較

按照圖2所示的萃取流程, 進行空白加標實驗, 選擇最佳的萃取方式。每種方法分析樣品包含全程序空白1個,空白加標3個, 其中空白加標樣品中, 加標量為50 ng。3種萃取方法的空白樣品中均無聯(lián)苯胺檢出, 加標回收率如表1所示。結(jié)果證實, PWCX柱不適用于聯(lián)苯胺的提取, PEP和液液萃取(LLE)的回收率都可達到80%以上, 有較好的回收效果。對比實驗流程, PEP萃取法使用的溶劑較少, 對環(huán)境的危害較少[10]; 另外, 在測定實際樣品時, 液液萃取常伴有乳化效應(yīng), 造成前處理過程繁瑣[11], 因此研究建議采用PEP固相萃取法提取水中的聯(lián)苯胺。

表1 3種萃取方式的空白加標回收率Table 1 Recoveries of benzidine in blank spikingsamples for three extraction methods %

2.2液液萃取優(yōu)化

2.2.1 萃取溶劑的選擇

本實驗對比了二氯甲烷、正己烷、甲基叔丁基醚、乙酸乙酯4種溶劑對水體中聯(lián)苯胺的萃取效率。實驗方法：準確量取1.0 L高純水, 加入聯(lián)苯胺40.0 ng, 再加入30 g NaCl, 調(diào)節(jié)pH為11, 然后分別使用二氯甲烷、正己烷、甲基叔丁基醚和乙酸乙酯各60 mL×3次對水樣進行萃取, 萃取液濃縮后轉(zhuǎn)換溶劑為乙腈, 定容至1.0 mL, 上機測定. 對比測定結(jié)果發(fā)現(xiàn), 正己烷和甲基叔丁基醚對聯(lián)苯胺的萃取效率較低, 均不足50%, 乙酸乙酯和二氯甲烷的萃取效率都可以達到90%以上。由于二氯甲烷沸點較低, 易于揮發(fā)和轉(zhuǎn)換溶劑, 因此選擇二氯甲烷為液液萃取的萃取溶劑。需要指出的是，液液萃取提取水中目標物后，溶劑轉(zhuǎn)換為甲醇或乙腈等流動相使用的溶劑體系是必要的環(huán)節(jié)[12-13]. 為了減少溶劑效應(yīng)，也有方法會將樣品定容為水和甲醇/乙腈的混合溶液[14]。

2.2.2 調(diào)整pH

由圖1可知, 聯(lián)苯胺為二元弱堿, 為提高提取效率, 需要將水樣調(diào)整為堿性。研究對比了pH分別為9～10、11～12、13～14時, 二氯甲烷對空白加標后水體中聯(lián)苯胺的提取效率, 其提取效率依次為69.2、85.5、75.8, 說明pH=11～12時, 二氯甲烷對水體中聯(lián)苯胺有較好的提取效果。

2.2.3 樣品濃縮

在加標回收實驗中發(fā)現(xiàn), 聯(lián)苯胺的回收率不穩(wěn)定, 有時甚至低于50%。通過逐步驗證發(fā)現(xiàn), 濃縮過程是聯(lián)苯胺損失的最可能環(huán)節(jié), 試驗結(jié)果顯示在樣品濃縮過程中, 若溶劑量揮發(fā)至近干時, 聯(lián)苯胺將損失近一半; 若溶劑剩余量小于0.3 mL時, 聯(lián)苯胺的回收率可達到70%左右; 若溶劑剩余量大于等于0.5 mL時, 聯(lián)苯胺的回收率可達到80%。因此, 在樣品分析時需嚴格控制濃縮過程, 溶劑量不得少于0.5 mL。

2.3PEP固相萃取法優(yōu)化

針對于聯(lián)苯胺的弱堿特性, 實驗對比驗證了中性水樣和pH值為11～12的加標回收率。 結(jié)果表明, 當樣品為中性時, PEP的富集效率不足30%; 但將水樣調(diào)整為堿性時, PEP富集效率可以達到80%以上。說明堿性條件 (pH=11～12)是PEP富集水體中聯(lián)苯胺的必要條件。

2.4液相色譜條件確定

研究只針對聯(lián)苯胺進行分析, 液相色譜條件較為簡單, 使用ZORBAX C18柱 2.1 mm×100 mm×3.5 μm為分析柱, 流動相選擇甲醇(A)40%和10 mmol/L乙酸銨(B)60%, 當流速為1.0 mL/min時, 在3.5 min時得到目標物(圖3、圖4)。為減少柱殘留, 每次樣品運行完畢需將樣品在高有機相(≥90% A)運行不少于3 min, 且在分析下一個樣品前需將儀器流動相充分平衡。

圖3為聯(lián)苯胺激發(fā)波長和發(fā)射波長。從圖3可知，最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為290、410 nm。圖4為最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長條件下得到的熒光色譜圖。濃度分別為0.5、5 ng/mL。在最佳液相條件下，建立標準曲線，選擇標準溶液濃度依次為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL，繪制的標準曲線線性R2=0.999 9，p<0.001。

圖3 聯(lián)苯胺激發(fā)波長和發(fā)射波長Fig.3 The excitation wavelength and emission wavelength of benzidine

圖4 聯(lián)苯胺的熒光色譜圖Fig.4 The fluorescence chromatogram of benzidine

2.5方法性能指標

2.5.1 方法檢出限和測定下限

參照圖2分析樣品, 對空白加標水樣進行7次平行測定, 加標量為5 ng/L, 根據(jù)《環(huán)境監(jiān)測 分析方法標準制修訂導則》(HJ 168—2010)[15], 計算方法的檢出限和測定下限, 測定結(jié)果見表2。PEP法的平均值為4.06 ng/L, 檢出限為0.9 ng/L, 定量下限為3.6 ng/L; LLE法的平均值為4.57 ng/L,檢出限為1.4 ng/L, 定量下限為5.5 ng/L。兩種方法均滿足《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 3838—2002)中聯(lián)苯胺的監(jiān)測需求(0.000 2 mg/L)[1]。其中, PEP法的標準偏差低于LLE法, LLE法富集后, 萃取液體及較大，在進行濃縮和溶劑轉(zhuǎn)換時可能會造成樣品損失或者污染。

表2 PEP和LLE的方法檢出限及定量下限Table 2 The detection limits and quantitation limits of PEP method and LLE method

2.5.2 方法準確度和精密度

為檢驗方法準確度和精密度, 選擇了3種水體：地表水、污水 (污水處理廠入水, 以生活污水為主)和某印染企業(yè)廢水進行測定。但在3種水體中均未檢測到聯(lián)苯胺, 因此以基體加標來判別方法的準確度和精密度。

根據(jù)方法檢出限、儀器的線性范圍(5～100 ng/mL), 以及各種水體的特點, 地表水、污水處理廠入水和企業(yè)廢水的加標量依次為10.0、40.0、80.0 ng/L, 每組樣品平行測定6次。PEP、LLE的方法準確度和精密度如表3所示。

表3 PEP、LLE的方法準確度和精密度Table 3 The precision and accuracy of PEP method and LLE method

由表3可知, PEP固相萃取法測定地表水、生活污水、企業(yè)廢水3種不同濃度基體加標的回收率依次為86.8%、80.4%、92.1%, 相對標準偏差小于5%; 液液萃取法測定地表水、生活污水、企業(yè)廢水3種不同濃度基體加標的回收率依次為106%、98.2%、99.0%, 相對標準偏差小于20%。對比上述兩種方法, PEP固相萃取法的回收率低于液液萃取法, 但是具有較好的重現(xiàn)性。這說明液液萃取的富集效率高于PEP固相萃取法; 但是, 液液萃取時乳化現(xiàn)象及濃縮時溶劑轉(zhuǎn)化將會使結(jié)果重現(xiàn)性降低。

3 結(jié)論

利用液液萃取法和固相萃取法提取水中的聯(lián)苯胺,這兩種方法的精密度和準確度均較高，提取液經(jīng)過液相色譜分離, 熒光法測定，液液萃取法的方法檢出限為1.4 ng/L,定量下限為5.5 ng/L; PEP固相萃取法的方法檢出限為0.9 ng/L，定量下限為3.6 ng/L，兩種前處理方法均能夠滿足地表水監(jiān)測需要。

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ResearchonDeterminationofBenzidinebyHPLC-FLD

ZHANG Xiulan, GUO Jing, REN Lijun, ZHU Chaofei, YANG Wenlong, LIU Jinlin, WU Zhongxiang, DONG Liang, DU Bing

State Environmental Protection Key Laboratory of Dioxin Pollution Control, National Research Center for Environment analysis & Measurement，Beijing 100029， China

X832

A

1002-6002(2017)03- 0160- 05

10.19316/j.issn.1002-6002.2017.03.24

2016-05-14;

2016-10-24

重大儀器專項“新型高速、高靈敏度、高通量色譜分析儀器的開發(fā)與應(yīng)用”(2012YQ14000804)；環(huán)保重大公益“地下水系統(tǒng)中新型污染物監(jiān)測技術(shù)與源解析研究”(201309001)

張秀藍(1983-)，女，山西長治人，博士，副研究員。