胚胎干細(xì)胞自我更新與誘導(dǎo)分化

李向東，王秀麗

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470952)；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014023003，2014023018)

李向東( 1968-)，男，教授。E-mail: 997993099@qq.com

王秀麗，教授，研究方向：組織工程與再生醫(yī)學(xué)。E-mail: panpan1210@dicp.ac.cn

專家述評(píng)

10.11724/jdmu.2017.05.01

胚胎干細(xì)胞自我更新與誘導(dǎo)分化

李向東1，王秀麗2

(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

本文在簡(jiǎn)述胚胎干細(xì)胞生物學(xué)性狀的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)綜述胚胎干細(xì)胞自我更新和誘導(dǎo)分化研究的相關(guān)進(jìn)展，其中包括由外源性細(xì)胞因子(LIF因子)和內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子(Oct-4, Nanog)共同參與的自我更新調(diào)控機(jī)制；通過(guò)條件培養(yǎng)基和基因轉(zhuǎn)染的方法定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化以及微環(huán)境對(duì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響及調(diào)控，最后提出干細(xì)胞研究面臨的挑戰(zhàn)?？蔀榻窈蟾杉?xì)胞的基礎(chǔ)科研及應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供必要的理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

胚胎干細(xì)胞；擬胚體；自我更新；分化；微環(huán)境；組織工程

生命科學(xué)是20世紀(jì)末和21世紀(jì)初自然科學(xué)中發(fā)展得最為迅猛的學(xué)科。干細(xì)胞的研究與應(yīng)用則成為其中最令人矚目的領(lǐng)域之一。近年來(lái)，伴隨生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的日益成熟，加之相關(guān)學(xué)科的理想結(jié)合與滲透，使得胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞以及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的研究持續(xù)取得突破性進(jìn)展，同時(shí)其應(yīng)用領(lǐng)域也得以不斷拓寬和深入，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。有關(guān)干細(xì)胞的定義、分類以及生物學(xué)特性的綜述已有諸多報(bào)道，本文將在簡(jiǎn)述胚胎干細(xì)胞生物學(xué)性狀的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)綜述胚胎干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀，并提出該研究領(lǐng)域所面臨的挑戰(zhàn)，以期對(duì)今后干細(xì)胞的基礎(chǔ)科研及應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供一定的理論指導(dǎo)。

1 干細(xì)胞的生物學(xué)性狀

干細(xì)胞是來(lái)自于胚胎、胎兒或成體內(nèi)，在特定的條件下具有一定的自我更新與增殖分化能力的一類細(xì)胞[1]。這些細(xì)胞不但能夠產(chǎn)生表現(xiàn)型與基因型與自身完全相同的子細(xì)胞，而且能產(chǎn)生組成機(jī)體組織、器官的已特化的細(xì)胞 (圖1)。

圖1 干細(xì)胞分裂示意圖Fig 1 The Schematic diagram of stem cell’s dividing pattern

依干細(xì)胞的發(fā)生學(xué)來(lái)源可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)和成體干細(xì)胞(adult stem cell, ASC)兩大類。與ASC比較，ESC具有獨(dú)特的生物學(xué)特征：(1)發(fā)育的全能性，在一定條件下具有向內(nèi)、中、外三胚層細(xì)胞分化的能力，在理論上可以誘導(dǎo)分化為機(jī)體內(nèi)所有類型的細(xì)胞；(2)種系傳遞能力，能夠形成嵌合體動(dòng)物；(3)易于進(jìn)行基因修飾，ESC技術(shù)和基因打靶技術(shù)相結(jié)合，如基因敲除(gene knock-out)和基因轉(zhuǎn)染(transfection)已成為研究基因功能的重要手段。

正是基于ESC自身所特有的發(fā)育全能性，決定了干細(xì)胞生物學(xué)與干細(xì)胞組織工程學(xué)的研究方興未艾，并且在發(fā)育生物學(xué)模型、細(xì)胞替代治療和基因治療的載體以及藥物研發(fā)等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用潛能[2]。

2 胚胎干細(xì)胞研究現(xiàn)狀

在干細(xì)胞的研究與應(yīng)用中，ESC一直是引人關(guān)注的熱點(diǎn)[3-4]。但若要真正實(shí)現(xiàn)ESC的應(yīng)用價(jià)值，明確其自我更新及多向分化的調(diào)控機(jī)制、實(shí)現(xiàn)其高效定向分化才是問(wèn)題的關(guān)鍵。故這里重點(diǎn)針對(duì)上述兩個(gè)方面的問(wèn)題對(duì)ESC的研究現(xiàn)狀加以綜述。

2.1 ESC自我更新的研究

ESC的自我更新是一個(gè)極其復(fù)雜的調(diào)控過(guò)程，其中包括外源性細(xì)胞因子和內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子的共同參與。

2.1.1 細(xì)胞因子刺激的自我更新：用僅添加血清的培養(yǎng)基進(jìn)行單一培養(yǎng)，既不能獲得ESC，也不能維持ESC的生長(zhǎng)。但通過(guò)與滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)或使用添加有白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)的培養(yǎng)基便可以維持ESC的自我更新。現(xiàn)已明確LIF的基因結(jié)構(gòu)，蛋白表達(dá)以及其發(fā)揮生物學(xué)作用的具體分子途徑[5]。LIF蛋白主要由180個(gè)氨基酸組成，分子內(nèi)部二硫鍵對(duì)于維持LIF分子的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性起重要作用[6]。該蛋白主要是通過(guò)與LIF受體(LIF receptor, LIFR)相結(jié)合促進(jìn)LIFR發(fā)生二聚體化后，并經(jīng)由以下信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖[7]：(1)JAK激酶介導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄子STAT3發(fā)生酪氨酸磷酸化后激活的途徑；(2)在接頭分子SHP2和Gab1的參與下激活Ras-Erk絲裂原活化蛋白激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

此外，在維持ESC多能性的研究中也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在與LIF基因缺失的成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，ESC并未完全分化，而僅是表現(xiàn)為堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, AP)陽(yáng)性集落數(shù)目的減少，即ESC仍部分保留有未分化的潛能[8]。由此說(shuō)明，在ESC實(shí)現(xiàn)其自我更新的過(guò)程中尚有其他的非LIF途徑共同參與，而所謂“非LIF途徑”就是指由各種干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子所參與的過(guò)程。LIF調(diào)控ESC實(shí)現(xiàn)自我更新的信號(hào)傳遞路徑見(jiàn)圖2。

圖2 LIF調(diào)控ESC實(shí)現(xiàn)自我更新的信號(hào)傳遞路徑Fig 2 The signal pathway of ES cells self-renewing regulated by LIF

2.1.2 干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同維持自我更新：Oct-3/4是目前被公認(rèn)的與ESC多向分化潛能相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一。Oct-3/4屬于POU(Pit-Oct-Une)家族，通過(guò)結(jié)合位于啟動(dòng)子活增強(qiáng)子區(qū)域8堿基位點(diǎn)ATGCAAAT來(lái)調(diào)控靶基因的表達(dá)，與胚胎發(fā)育中的多向分化潛能密切相關(guān)[9]。小鼠胚胎表達(dá)Oct-4始于4～8細(xì)胞期的細(xì)胞核部位，且在整個(gè)桑椹胚期均可檢測(cè)到。至囊胚(胚泡)期，Oct-4蛋白集中高水平表達(dá)于ICM，而在滋養(yǎng)外胚層卻迅速下降。Oct-4在維持干細(xì)胞潛能中所扮演的角色是通過(guò)對(duì)內(nèi)源基因進(jìn)行靶向干擾而加以明確的。該因子不但參與多潛能細(xì)胞的最初形成，而且還在維持著干細(xì)胞自我更新的狀態(tài)[10]。

與Oct-4比較，Nanog代表了一個(gè)不同的同源結(jié)構(gòu)域蛋白。Nanog的表達(dá)先是在桑椹胚期；而高水平的Nanog mRNA則持續(xù)存在于囊胚早期[11-12]。有趣的是，在胚胎植入前Nanog的表達(dá)卻開(kāi)始下降。這個(gè)動(dòng)態(tài)的表達(dá)譜表明：在胚胎發(fā)育的過(guò)程中若避免多潛能ESC的非控性增殖，Nanog的下調(diào)是至關(guān)重要的。為了證實(shí)Nanog是不依賴于細(xì)胞因子(LIF)而參與維持ESC的自我更新，研究者將Nanog基因整合至ESC，在LIFR拮抗劑的情況下，該修飾細(xì)胞在體外傳代2次以后，仍保留有自我更新的能力。而未經(jīng)處理的對(duì)照組則完全分化。接下來(lái)切除修飾細(xì)胞Nanog基因，則對(duì)LIF的依賴性再度恢復(fù)。而將這些Nanog表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行胚泡注射時(shí)，發(fā)現(xiàn)這些供體細(xì)胞能夠參與嵌合體內(nèi)各組織器官的發(fā)育形成。上述工作有力證明了在ESC實(shí)現(xiàn)自我更新的非LIF依賴性的調(diào)控途徑中，Nanog 分子是不可忽視的[13]。

有關(guān)Oct-4與Nanog之間的相互關(guān)系，迄今尚未形成較為全面的認(rèn)識(shí)。但有研究表明，Oct-4表達(dá)可能利于Nanog蛋白的動(dòng)態(tài)表達(dá)及定量調(diào)節(jié)，即二者之間可能存在一定的協(xié)同作用，從而促進(jìn)ESC實(shí)現(xiàn)自我更新[14]。

2.1.3 其它外源性因子調(diào)控ESC自我更新：已經(jīng)證明在ESC體外傳代培養(yǎng)的過(guò)程中，若添加BMP4、BMP2、GDF6替代血清成分，ESC仍可以進(jìn)行自我更新。但BMP/GDF發(fā)揮其作用必須依賴于LIF的激活[15-16]。在單獨(dú)含有BMP的條件下，ESC將向非神經(jīng)細(xì)胞方向分化。但若與LIF聯(lián)合作用，即便是滋缺失養(yǎng)層細(xì)胞和血清組分的情況下也能夠維持ESC的自我更新。BMP這種抑制分化的效應(yīng)似乎是與其誘導(dǎo)Id家族成員的表達(dá)有關(guān)。Id成員均為負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控修飾因子，能夠參與ESC分化抑制的調(diào)節(jié)，也成為BMP/GDP信號(hào)參與ESC自我更新的關(guān)鍵路徑。此外，也有相關(guān)證據(jù)表明，Wnt通路能夠短期維持小鼠和人ESC的多向分化潛能[17-18]。但尚未明確Wnt信號(hào)的特異性激活是否將有利于ESC多向分化潛能的維持，而在多次克隆傳代培養(yǎng)過(guò)程中，上述效應(yīng)是否依然發(fā)生。

綜上，ESC的自我更新是多因素、多環(huán)節(jié)、多徑路所共同調(diào)節(jié)的過(guò)程。但目前我們所認(rèn)知的部分還很有限，只有在信號(hào)傳導(dǎo)方面開(kāi)展更多的工作才有可能揭示ESC自我更新的奧秘，才能為ESC誘導(dǎo)分化的研究提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)，促進(jìn)高效、定向分化的實(shí)現(xiàn)。

2.2 干細(xì)胞分化的研究

除上述對(duì)ESC自我更新的調(diào)控的研究，干細(xì)胞領(lǐng)域內(nèi)另一個(gè)備受關(guān)注的熱點(diǎn)便是干細(xì)胞的分化。 目前對(duì)干細(xì)胞發(fā)育調(diào)控的研究不斷深入，已有越來(lái)越多類型的分化細(xì)胞被誘導(dǎo)、鑒定出來(lái)。以下分別從ESC定向分化及調(diào)控的進(jìn)展方面加以介紹。

2.2.1 ESC定向誘導(dǎo)分化的研究：“擬胚體(embryoid bodies, EBs)形成法”是目前研究ESC體外分化的常規(guī)方法(圖3)。但該方法只能產(chǎn)生含有多種分化的組織細(xì)胞的混合體，而不能形成單一的細(xì)胞克隆。為了獲取一定數(shù)量的ES源細(xì)胞，基于前期的研究基礎(chǔ)，人們開(kāi)始嘗試其他可以實(shí)現(xiàn)ES細(xì)胞定向分化的誘導(dǎo)途徑。

圖3 懸滴法制備擬胚體示意圖Fig 3 Forming of embryoid bodies (EBs) with hanging drops method

(1)通過(guò)設(shè)置培養(yǎng)條件，添加條件培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)定向的細(xì)胞分化。有人將小鼠ESC置于含堿性成纖維生長(zhǎng)因子(FGF-2)的培養(yǎng)基中增殖，后加入血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)，在二者的混合培養(yǎng)基內(nèi)，得到了表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)前體標(biāo)志分子的多能祖細(xì)胞。當(dāng)去除FGF-2和PDGF后，這些細(xì)胞最終只向著少突神經(jīng)膠質(zhì)或星形膠質(zhì)細(xì)胞分化。Vogel G[19]將人ESC培養(yǎng)至EBs后，分離出部分分化的EBs在bFGF的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，最終獲得96%表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志的細(xì)胞。此外，若將ESC置于TISFn的條件培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行階段培養(yǎng)，然后在含多種生長(zhǎng)因子的N2無(wú)血清培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)即可獲得表達(dá)insulin和其他胰腺內(nèi)分泌激素的類胰島細(xì)胞[20]。以上均證明，條件培養(yǎng)基在ESC的定向誘導(dǎo)中占有不可或缺的重要地位。

(2)利用特定細(xì)胞表面標(biāo)志或加入系列特異性的標(biāo)志基因，通過(guò)熒光激活的細(xì)胞分選法(fluorescent activated cell screening, FACS)或篩選性培養(yǎng)基選出特定類型的細(xì)胞，進(jìn)行再培養(yǎng)，產(chǎn)生特定的分化細(xì)胞[21-22]。

通常對(duì)造血前體細(xì)胞的篩選都是通過(guò)FACS進(jìn)行的，因?yàn)橄鄬?duì)于其他類型的前體細(xì)胞，該細(xì)胞的表面標(biāo)志比較明確，均可商品化購(gòu)買，最終獲得的細(xì)胞純度可以達(dá)到99%。而對(duì)基因修飾后ESC進(jìn)行篩選分化的操作則多集中在心肌細(xì)胞的研究領(lǐng)域，這可能要?dú)w結(jié)為心肌誘導(dǎo)分化方面的相關(guān)研究開(kāi)展得最早，進(jìn)展得也最為深入[23]。研究者通過(guò)構(gòu)建具有α-MHC或MLC-2v啟動(dòng)子的篩選質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)分化、篩選可獲得高純度的、可表達(dá)MHC，α-肌動(dòng)蛋白(α-actin)及中等纖維結(jié)蛋白(desmin)等特征蛋白的ES源心肌細(xì)胞[24-25]。上述研究為獲取一定數(shù)量的靶細(xì)胞提供了理想的實(shí)驗(yàn)手段，也使得ESC源細(xì)胞的臨床應(yīng)用漸趨于現(xiàn)實(shí)可行。

ESC所特有的生物學(xué)潛能決定了其在干細(xì)胞研究中的主導(dǎo)地位。但這并非意味著ESC可以涵蓋甚至是替代ASC在細(xì)胞治療中所發(fā)揮的作用。近年來(lái)在干細(xì)胞替代治療中，ASC以及誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞以其來(lái)源廣泛、類型多樣以及非免疫原性等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)備受研究者的關(guān)注，顯示出前所未被認(rèn)知的應(yīng)用潛能，但在這里不加贅述。

2.2.2 胚胎干細(xì)胞分化的調(diào)控：ESC本身所具有的分化潛能的多樣性，反映了干細(xì)胞分化發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜性。目前對(duì)其調(diào)控機(jī)制的研究還非常有限，可分為內(nèi)源性和外源性調(diào)控兩個(gè)方面，二者相輔相成，不可分割。其中，內(nèi)源性調(diào)控主要涉及干細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白、結(jié)構(gòu)因子、轉(zhuǎn)錄因子等，可影響干細(xì)胞非對(duì)稱性有絲分裂及細(xì)胞因子的分泌等，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)干細(xì)胞分化發(fā)育的調(diào)控[26-27]。有關(guān)干細(xì)胞分化的外源性調(diào)控，近年來(lái)也越來(lái)越受到關(guān)注。所有參與調(diào)控的外源性因素共同組成了干細(xì)胞的微環(huán)境。2000年，Watt和Hogan[28]聯(lián)合在《Science》發(fā)表《走出伊甸園：干細(xì)胞與微環(huán)境》的文章，首次強(qiáng)調(diào)了微環(huán)境在干細(xì)胞分化調(diào)控所發(fā)揮的重要作用。對(duì)此本綜述將做重點(diǎn)闡述。

微環(huán)境(microenvironment)，或者稱為“壁龕(niche)”概念的首次提出是基于造血干細(xì)胞(HSC)分化的研究中[29]，但現(xiàn)在已經(jīng)外延至包括所有控制干細(xì)胞命運(yùn)—自我更新、分化或凋亡的外源性信號(hào)，可能存在于干細(xì)胞之間，干細(xì)胞與基質(zhì)間，以及干細(xì)胞與遠(yuǎn)端非直接接觸的理化因素之間[30]。目前研究者將其分為以下幾個(gè)方面：

(1)分泌因子。大量的分泌因子參與了干細(xì)胞命運(yùn)的調(diào)控過(guò)程，其中具有代表性的是：TGFβs和Wnts家族[31]。TGFβ信號(hào)蛋白家族成員能夠促進(jìn)神經(jīng)嵴干細(xì)胞的分化發(fā)育；在那些通過(guò)非對(duì)稱性分裂來(lái)實(shí)現(xiàn)其自我更新的組織中，Wnts能夠通過(guò)α-catenin路徑來(lái)激活干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)組織更新。此外，在卵裂球的非對(duì)稱性分類中Wnt信號(hào)則能夠控制紡錘體的定向性，并促進(jìn)內(nèi)胚層的發(fā)育。

(2)膜蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞間作用。除了分泌因子，細(xì)胞彼此間的直接接觸也是微環(huán)境中調(diào)控干細(xì)胞命運(yùn)的重要因素[32]。細(xì)胞間接觸的信息主要通過(guò)跨膜蛋白分子進(jìn)行傳遞，如在果蠅體內(nèi)，膜蛋白受體Notch及其配體Delta在Numb蛋白的參與下共同影響神經(jīng)干細(xì)胞的分裂，過(guò)程中Notch的活性受到抑制，從而使由Notch介導(dǎo)的細(xì)胞間相互作用產(chǎn)生偏向性，最終導(dǎo)致非對(duì)稱性分裂的發(fā)生。需指出的是，雖然β-catenin是細(xì)胞粘附連接的結(jié)構(gòu)成分，但目前對(duì)其在干細(xì)胞的調(diào)控中的具體作用卻無(wú)相應(yīng)報(bào)道。

(3)整合素和細(xì)胞外基質(zhì)。細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變會(huì)影響干細(xì)胞的分化。其中研究得較為廣泛的就是整合素(integrins)[33]。整合素能維持干細(xì)胞存在于組織內(nèi)的相應(yīng)位置，若其表達(dá)喪失就會(huì)導(dǎo)致干細(xì)胞選擇分化或凋亡途徑以脫離干細(xì)胞的微環(huán)境。整合素也可以發(fā)揮傳遞信號(hào)的作用，當(dāng)干細(xì)胞的微環(huán)境發(fā)生改變?nèi)缡艿綋p傷時(shí)，胞外某些信息可通過(guò)整合素α5β1，αvβ5，及αvβ6等傳遞給干細(xì)胞，以觸發(fā)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)。這一過(guò)程不僅可以改變干細(xì)胞的分裂方式，而且還能夠激活干細(xì)胞的多潛能性，使干細(xì)胞產(chǎn)生一種或多種定向祖細(xì)胞，以適應(yīng)組織修復(fù)的需要。另外，這些胞外基質(zhì)還能隔絕和調(diào)節(jié)那些存在于干細(xì)胞微環(huán)境內(nèi)的分泌因子的局部濃度，間接調(diào)控干細(xì)胞的分化發(fā)育[33]。

綜上，微環(huán)境因素在調(diào)控干細(xì)胞的命運(yùn)方面的確擔(dān)當(dāng)著非常重要的角色，不僅維持著干細(xì)胞的自我更新，而且也在控制著干細(xì)胞的分化定向。當(dāng)然其功能的發(fā)揮并不脫離于干細(xì)胞的內(nèi)源性調(diào)控因素，而是通過(guò)直接或間接的激化內(nèi)源性途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

近年來(lái)伴隨組織工程與再生醫(yī)學(xué)新技術(shù)的不斷發(fā)展，三維培養(yǎng)(three dimensional culture, 3D culture)技術(shù)因其在體外模擬構(gòu)建復(fù)雜微環(huán)境方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)也被逐漸應(yīng)用至干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化研究領(lǐng)域。 本團(tuán)隊(duì)在前期工作中就曾先后成功建立基于APA微膠囊和膠原3D水凝膠的ESC培養(yǎng)體系，前者能夠影響ESC的增殖分化的調(diào)控[34]，后者則能夠高效誘導(dǎo)ESC定向分化為具有理想表型和功能的類胰島素分泌細(xì)胞[35]。其中，對(duì)比平面誘導(dǎo)體系，經(jīng)膠原3D培養(yǎng)誘導(dǎo)體系所獲得的靶細(xì)胞對(duì)高糖水平的應(yīng)答能力顯著提高。此外，新近基于3D生物材料支架體系定向誘導(dǎo)ESC分化為不同胚層來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等研究也均有成功報(bào)道[36]。這些均為“微環(huán)境調(diào)控ESC命運(yùn)”這一論點(diǎn)提供了有力論據(jù)。微環(huán)境不但提供了大量的信號(hào)分子，而且也調(diào)控者干細(xì)胞本身對(duì)分化信號(hào)分子的選擇性應(yīng)答，由此使干細(xì)胞內(nèi)源調(diào)控基因的再程序化，最終實(shí)現(xiàn)高效定向誘導(dǎo)分化[37]。

3 干細(xì)胞研究面臨的挑戰(zhàn)

雖然干細(xì)胞在基礎(chǔ)科學(xué)與臨床應(yīng)用研究中都顯示出理想的應(yīng)用前景，但必須明確的是，干細(xì)胞作為一個(gè)嶄新的應(yīng)用元素，仍存在著一些不可回避的問(wèn)題[38]。

首先，如何維持干細(xì)胞體外擴(kuò)增時(shí)不發(fā)生分化？ESC和ASC在體內(nèi)外均具有自我分化的潛能，極易分化為其它細(xì)胞。雖然體外抑制干細(xì)胞分化方面已取得重大進(jìn)展，但對(duì)其培養(yǎng)條件仍需優(yōu)化，以在擴(kuò)增中最大限度的維持干細(xì)胞多向分化的潛能。

其次，如何定向誘導(dǎo)干細(xì)胞分化？干細(xì)胞研究的主要瓶頸問(wèn)題之一就是要闡明ESC發(fā)育的調(diào)控機(jī)制，實(shí)現(xiàn)其定向誘導(dǎo)分化。另外，若使ESC真正應(yīng)用于細(xì)胞替代治療，還需解決移植細(xì)胞的發(fā)育類型及其數(shù)量的問(wèn)題。如在肝細(xì)胞替代治療中，可以分離并移植那些相對(duì)發(fā)育成熟且仍保留有一定的增殖和再生潛能的細(xì)胞[39]；而對(duì)血液系統(tǒng)的持續(xù)性替代治療則要求移植相對(duì)幼稚的造血干細(xì)胞[40]。那么究竟如何選取特定發(fā)育階段的細(xì)胞進(jìn)行移植——這當(dāng)然也很大程度上取決于人們對(duì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的認(rèn)知。遺憾的是，人類在該方面的知識(shí)積累還很欠缺，獲得一定量靶細(xì)胞的最優(yōu)化條件尚待建立。

最后，干細(xì)胞的分離純化技術(shù)尚不夠完善。ESC分化的體系決定了其分化產(chǎn)物的混雜性。 但受限于前體細(xì)胞標(biāo)識(shí)的非確定性，很難對(duì)目的細(xì)胞進(jìn)行高效的分離與純化，這不但減低了移植細(xì)胞的數(shù)量，而且也存在致瘤的危險(xiǎn)[41-42]。此外，干細(xì)胞治療中供/受體的免疫排斥的問(wèn)題也不容忽視[43]。建立各種HLA表型的ESC庫(kù)、對(duì)ESC進(jìn)行基因修飾以降低其免疫原性可能是解決免疫排斥問(wèn)題的理想方案[44-45]。更重要的是，近年來(lái)有關(guān)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞和細(xì)胞重編程的突破性研究也可能為干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化研究提供新的技術(shù)策略。 以上對(duì)ESC研究中所面臨的問(wèn)題做出了系統(tǒng)的陳述，但就本質(zhì)而言，貫穿所有問(wèn)題的核心只有兩個(gè)，即是闡明干細(xì)胞維持自我更新、譜系發(fā)育的機(jī)制；實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞定向分化。而事實(shí)上，這也正是當(dāng)前干細(xì)胞研究所圍繞的關(guān)鍵核心。相信伴隨生命科學(xué)技術(shù)的日趨完善與成熟，研究者會(huì)逐漸揭開(kāi)“干細(xì)胞”的神秘面紗，鋪設(shè)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化應(yīng)用的橋梁，從而最終真正將干細(xì)胞成功應(yīng)用于的臨床。

[1] Alison MR, Poulsom R, Forbes S, et al. Introduction to stem cells[J]. J Pathol, 2002, 197(4): 419-423.

[2] Lanza R and Rosenthal N. The stem cell challenge[J]. Sci Am, 2004, 290(6):92-99.

[3] Fijnvandraat AC, van Ginneken AC, Schumacher CA, et al. Cardiomyocytes purified from differentiated embryonic stem cells exhibit characteristics of early chamber myocardium[J]. J Mol Cell Cardiol, 2003, 35: 1461-1472.

[4] Kawasaki H, Suemori H, Mizuseki K, et al. Generation of dopaminergic neurons and pigmented epithelia from primate ES cells by stromal cell-derived inducing activity[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99: 1580-1585.

[5] Heinrich PC, Behrmann I, Haan S, et al. Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation[J]. Biochem J, 2003, 374(1): 1-20.

[6] Yoshida K, Chambers I, Nichols J, et al. Maintenance of the pluripotential phenotype of embryonic stem cells through direct activation of gp130 signaling pathways[J]. Mech Dev, 1994, 45(2):163-171.

[7] Niwa H, Burdon T, Chambers I, et al. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3[J]. Genes Dev, 1998, 12(13): 2048-2060.

[8] Molofsky AV, Pardal R, Morrison SJ. Diverse mechanisms regulate stem cell self-renewal[J]. Curr Opin Cell Biol, 2004, 16(6): 700-707.

[9] Niwa H, Miyazaki J, Smith AG. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells[J]. Nat Genet, 2000, 24(4): 372-376.

[10] Pesce M, Scholer HR. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development[J]. Stem Cells, 2001, 19(4): 271-278.

[11] Chambers I, Colby D, Robertson M, et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells[J]. Cell, 2003, 113(5): 643-655.

[12] Mitsui K, Tokuzawa Y, Itoh H, et al. The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells[J]. Cell, 2003, 113(5): 631-642.

[13] Hart AH, Hartley L, Ibrahim M, et al. Identification, cloning and expression analysis of the pluripotency promoting Nanog genes in mouse and human[J]. Dev Dyn, 2004, 230(1): 187-198.

[14] Niwa H, Masui S, Chambers I, et al. Phenotypic complementation establishes requirements for specific POU domain and generic transactivation function of Oct-3/4 in embryonic stem cells[J]. Mol Cell Biol, 2002, 22(5): 1526-1536.

[15] Ying QL, Stavridis M, Griffiths D, et al. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precuisors in adherent monoculture[J]. Nat Biotechnol,2003, 21(2): 183-186.

[16] Ying QL, Nichols J, Chambers I, et al. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3[J]. Cell, 2003, 115(3): 281-292.

[17] Batille E, Henderson JT, Beghtel H, et al. β-catenin and TCF mediate cell positoning in the intestinal epithelium by controlling the expression of EphB/ephrinB[J]. Cell, 2002, 111(2): 251-263.

[18] Van de Wetering M, Sancho E, Verweij C, et al. The β-catenin/TCF-4 complex imposes a crypt progenitor phenotype on colorectal cancer cells[J]. Cell, 2002, 111(2): 241-250.

[19] Vogel G. The hottest stem cells are also the toughest[J]. Science, 2001, 292(5516): 429.

[20] Martin F. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice[J]. Diabetes, 2000, 49(2): 157-162.

[21] Leon-Quinto T, Jones J, Skoudy A, et al. In vitro directed differentiation of mouse embryonic stem cells into insulin-producing cells[J]. Diabetologia, 2004, 47(8): 1442-1451.

[22] Blyszczuk P, Czyz J, Kania G, et al. Expression of Pax4 in embryonic stem cells promotes differentiation of nestin-positive progenitor and insulinproducing cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100: 998-1003.

[23] Xu C, Police S, Rao N, et al. Characterization and enrichment of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cell[J]. Circ Res, 2002, 91(6):501-508.

[24] Müller M, Fleischmann BK, Selbert S. Selection of ventricular-like cardiomyocytes from ES cells in vitro[J]. FASEB J, 2000, 14(15): 2540-2548.

[25] Mummery CL, Zhang J, Ng ES, et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview[J]. Circulat Res, 2012, 111(3):344-358.

[26] Betschinger J, Mechtler K, Knoblich JA. The Par complex directs asymmetric cell division by phosphorylating the cytoskeletal protein Lgl[J]. Nature, 2003, 422(6929): 326-330.

[27] Chen DH, McKearin D. Dpp signaling silences bam transcription directly to establish asymmetric division of germline stem cells[J]. Curr Biol, 2003, 13: 1786-1791.

[28] Watt FM, Hogan BLM. Out of eden: Stem cells and their niches[J]. Science, 2000, 287(5457): 1427-1430.

[29] Calvi LM, Adams GB, Weibrecht KW, et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoitic stem cell niche[J]. Nature, 2003, 425(6960): 841-846.

[30] Fuchs E, Tumbar T, Guasch G. Socializing with the neighbors: Stem cells and their niche[J]. Cell, 2004, 116(6): 769-778.

[31] Peifer M. Signal transduction. Neither straight nor narrow[J]. Nature, 1999, 400(6741): 213-215.

[32] Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch signaling: cell fate control and signal integration in development[J]. Science, 1999, 284(5415): 770-776.

[33] Jensen UB, Lowell S, Watt FM, et al. Extracellular-matrix tethering regulates stem-cell fate[J]. Nat Mate, 2012, 11(7):642-649.

[34] Wang X, Wang W, Ma J, et al. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells in APA microcapsule: A model for studying the interaction between stem cells and their niche[J]. Biotechnol Prog, 2010, 22(3):791-800.

[35] Wang X, Ye K. Three-dimensional differentiation of embryonic stem cells into islet-like insulin-producing clusters[J]. Tissue Eng Part A, 2009, 15(8):1941-1952.

[36] Iii RLG, Hannan NRF, Bort R, et al. Maturation of Induced Pluripotent Stem Cell Derived Hepatocytes by 3D-Culture[J]. Plos One, 2013, 9(1):e86372.

[37] Tumbar T, Guasch G, Greco V, et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin[J]. Science, 2004, 303(5656): 359-363.

[38] Bongso A, Richards M. History and perspective of stem cell research[J]. Best Prac Res Clin Obste Gynaecol, 2004, 18(6): 827-842.

[39] Russo FP, Parola M. Stem and progenitor cells in liver regeneration and repair[J]. Cytotherapy, 2011, 13(2):135-144.

[40] Clements WK, Traver D. Signalling pathways that control vertebrate haematopoietic stem cell specification[J]. Nat Rev Immunol, 2013, 13(5):336-348.

[41] Kim JH, Auerbach JM, Rodriguez-Gomez JA, et al. Dopamine neurons derived from embryonic stem cells function in an animal model of Parkinson’s disease[J]. Nature, 2002, 418(6893): 50-56.

[42] Yamanaka S. Strategies and New Developments in the Generation of Patient-Specific Pluripotent Stem Cells[J]. Cell Stem Cell, 2007, 1(1):39-49.

[43] Zwaka TP, Thomson JA. Homologous recombination in human embryonic stem cells[J]. Nat Biotechnol, 2003, 21(3): 319-321.

[44] Hochedlinger K, Jaenisch R. Nuclear transplantation, embryonic stem cells, and the potential for cell therapy[J]. N Engl J Med, 2003, 349(3): 275-286.

[45] Rideout WM, Hochedlinger K, Kyba M, et al. Correction of a genetic defect by nuclear transplantation and combined cell and gene therapy[J]. Cell, 2002, 109(1): 17-27.

Self-renewalanddifferentiationofembryonicstemcells

LI Xiangdong1, WANG Xiuli2

(1.DepartmentofCardiovascularDiseases，theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027，China; 2.DepartmentofHistologyandEmbryology,CollegeofBasicMedicalSciences,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

This review will briefly introduce the biological characteristics of embryonic stem cells (ESCs) followed by the focuses on the mechanisms of self-renewing and the strategies of lineage-specified differentiation of ESCs in recent years. In particular, mechanisms of regulating the self-renewing of ESCs including the participation of both cytokine and transcriptional were discussed. Conditioned medium and gene transfection were also reviewed for the induced differentiation of ESCs in vitro. Most importantly, the indispensable role played by the stem cell microenvironment in regulating the fate of ESCs and the challenges that being faced by the stem cell-based therapy have also been discussed in this mini-review. It is expected that it would not only enlighten the basic research of stem cells but also promote its transformed application in clinical therapy.

embryonic stem cells (ESCs)；embryoid bodies (EBs)；self-renewing；differentiation；microenvironment；tissue engineering

R318

A

1671-7295(2017)05-0417-06

李向東，王秀麗.胚胎干細(xì)胞自我更新與誘導(dǎo)分化[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,39(5)：417-422，432.

2017-08-19；

2017-10-05)