基于生理學(xué)參數(shù)的低糖酵母發(fā)酵過程優(yōu)化

程奔++李嘯++許超群++黃聰++李建華++鄭念++李勇++談亞麗++匡金寶

摘 要：以低糖酵母發(fā)酵過程為研究對(duì)象，對(duì)發(fā)酵過程中的生理參數(shù)呼吸商（RQ）、二氧化碳釋放速率（CER）和氧氣吸收速率（OUR）等參數(shù)變化進(jìn)行了檢測(cè)和分析。以RQ值作為主要在線指導(dǎo)參數(shù)，通過耦合RQ優(yōu)化發(fā)酵過程中的碳源流加速率，使得低糖酵母干物質(zhì)總量由1 125 g提高到了1 650 g。通過這種優(yōu)化控制生理參數(shù)RQ的方法實(shí)現(xiàn)了低糖酵母發(fā)酵過程的優(yōu)化，有效提高了低糖酵母的發(fā)酵產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：低糖酵母；活力；呼吸商（RQ）；二氧化碳釋放速率（CER）；氧氣吸收速率（OUR）

中圖分類號(hào)：S963.32+7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.10.005

Optimization of Lean Dough Yeast Fermentation based on Physiological Parameters

CHENG Ben1， LI Xiao1，2， XU Chaoqun2， HUANG Cong2， LI Jianhua2， ZHENG Nian2， LI Yong2，TAN Yali2， KUANG Jinbao2

（1. College of Biological and Pharmaccutical， China Three Gorges University， Yichang， Hubei 443003， China； 2. Angel Yeast Limited Company， Yichang， Hubei 443003， China； 3. Angel Yeast Yili Limited Company， Yili， Xinjiang 835000， China）

Abstract： This paper was focused on the study of lean dough yeast fermentation， and the relationship of the parameters such as respitatory quotient （RQ）， carbon dioxide evolution rate （CER） and oxygen uptake rate （OUR） were detected and analyzed in the course of fermentation. RQ was utilized as the main online guidance parameter， the total dry matter increased from 1 125 g to 1 650 g through optimizing the adding rate of carbon source coupled with RQ. Therefore， through analyzing and optimizing RQ value， the fermentation yield of lean dough yeast was improved effectively.

Key words： lean dough yeast； fermentative activity； respitatory quotient （RQ）； carbon dioxide evolution rate （CER）； oxygen uptake rate （OUR）

在酵母菌的高密度發(fā)酵過程中，為了獲得較高的生物量，需要投入大量的基質(zhì)用于菌體生長和產(chǎn)物合成。由于低糖酵母存在Crabtree效應(yīng)，當(dāng)培養(yǎng)基中的糖濃度高于一定值時(shí)葡萄糖會(huì)溢流代謝生成乙醇，影響酵母菌的得率[1]。

補(bǔ)料分批發(fā)酵又可稱為流加發(fā)酵（Fed-Batch fermention），是一種介于分批發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵之間的特殊培養(yǎng)模式[2]，它是在分批發(fā)酵過程中連續(xù)或間歇地向發(fā)酵罐中流加一種或幾種限制性底物，直到發(fā)酵結(jié)束后才放出培養(yǎng)液的一種操作方式。流加培養(yǎng)的方式可分為恒速流加、指數(shù)流加和反饋流加等。因?yàn)榱骷影l(fā)酵可以有效延長細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期和穩(wěn)定期的維持時(shí)間，并且增加生物量和代謝產(chǎn)物的積累，所以發(fā)酵工業(yè)中大多采用這種發(fā)酵方式進(jìn)行生產(chǎn)[3]。

發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展研究表明，停留在以反應(yīng)器尺度參數(shù)（ pH值、溶氧、底物濃度、溫度、轉(zhuǎn)速、通氣量等） 調(diào)控上的優(yōu)化及放大工藝研究存在很大的技術(shù)局限性。在微生物發(fā)酵過程中，從微觀代謝的角度了解細(xì)胞內(nèi)部代謝物質(zhì)流情況，并對(duì)整個(gè)發(fā)酵過程進(jìn)行有效及時(shí)的工藝調(diào)控是非常重要的。通過工藝的調(diào)整來維持發(fā)酵過程中合適的RQ值，就能夠很好地控制發(fā)酵過程中微觀代謝途徑通量的變化，促進(jìn)產(chǎn)物的產(chǎn)率和底物轉(zhuǎn)化率的提高，最大限度地減少副產(chǎn)物的積累，提高發(fā)酵水平[4]。

本研究課題的試驗(yàn)是在安琪酵母有限公司完成的，是在公司提供的原始流加方案基礎(chǔ)上進(jìn)行的優(yōu)化試驗(yàn)。發(fā)酵罐總體積50 L，有效利用體積為60%左右。為得到較高生物量的酵母菌體，采用流加方式，流加碳源、氮源和磷源。發(fā)酵過程中控制酒精含量，一般控制在0%～0.5%（v/v）左右，通過調(diào)節(jié)風(fēng)量和流加量來控制酒精含量，使酵母有較高的得率。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

（1）菌種。低糖酵母，由安琪酵母股份有限公司菌種室提供。

（2）試劑。重鉻酸鉀，濃硫酸，碘化鉀，可溶性淀粉，氫氧化鈉，硫代硫酸鈉，無水乙醇，95%乙醇，六水合氯化鎂，氯化鋅。以上試劑均為分析純AR，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司。

（3）主要儀器與設(shè)備。ZHWY-211D腳踏開門型大容量全溫度恒溫?fù)u床，上海智城生物科技有限公司；FUS-50L（A）型新概念發(fā)酵罐，上海國強(qiáng)生化工程裝備有限公司；PAS7000型生物尾氣分析儀，重慶哈特曼科技有限公司；TDL-60B型飛鴿牌系列離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠制造；pH計(jì)，梅特勒-托利多集團(tuán)；臥式滅菌鍋，上海醫(yī)用核子公司。endprint

（4）培養(yǎng)基。一級(jí)、二級(jí)種子培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基，1% 酵母抽提物（FM888），2%蛋白胨（FM318），2%葡萄糖（glucose）。50 L發(fā)酵罐培養(yǎng)基：底水18 L。流加培養(yǎng)基：糖蜜140 Brix 糖蜜（即 100 mL 含糖 28 g）約為 10 L 左右；氨水約為 720 mL；磷酸二氫氨為68 g，將磷源溶于600 mL 水中；氯化鎂20 g氯化鋅5 g溶于600 mL水中。除氨水外，其余均在115 ℃條件下滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

（1）一級(jí)種子液制備。取一支制備好的甘油管，接入裝有200 mL YPD培養(yǎng)液的500 mL三角瓶中，28 ℃、180 r·min-1下36 h。

（2）二級(jí)種子液制備。將一級(jí)種子液全部接入裝有1 000 mL YPD培養(yǎng)基的2 L搖瓶中，28 ℃、180 r·min-1下36 h。

（3）50 L罐發(fā)酵試驗(yàn)。將培養(yǎng)好的二級(jí)種子接入到發(fā)酵罐中。發(fā)酵罐總體積50 L，有效利用體積約為60%，因發(fā)酵過程中泡沫較多，設(shè)計(jì)發(fā)酵體積為30 L，為了得到較高的生物量，采用流加方式（流加程序見表1）。發(fā)酵罐中只有底水，碳源、氮磷源都是流加進(jìn)去。發(fā)酵過程中通過控制轉(zhuǎn)速、風(fēng)量和碳源的流加速度，來控制酒精含量。同時(shí)，可通過酒精的含量來反饋調(diào)節(jié)碳源的流加速度。

（4）馬丁試驗(yàn)檢測(cè)發(fā)酵液中酒精含量?？瞻自囼?yàn)：準(zhǔn)確移取0.05 mol·L-1酸性重鉻酸鉀溶液10.0 mL于球形接收器中，用10 mL量筒取10.0 mL、0.06 g·L-1氫氧化鈉溶液倒入隔離管中，連接好儀器，加熱蒸餾，以沸騰起記時(shí)，蒸餾5 min，停止蒸餾。用少量蒸餾水沖洗連接管口，取下接收器，迅速冷卻至室溫，倒入250 mL三角瓶中，用約100 mL水分3次沖洗接收器，沖洗液一并倒入三角瓶中，加2 mL碘化鉀溶液及1 mL淀粉指示液，用硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至綠色即為終點(diǎn)。

試樣中乙醇含量按下式計(jì)算：

X=■

式中：X為試樣中乙醇的百分含量，%；C為硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol·L-1；V1為空白試驗(yàn)消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mL；V2為試樣消耗硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的量，mL；V3為吸取試樣的體積，mL；0.0146∶1.00 mL 硫代硫酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 1.0 mol·L-1）相當(dāng)于乙醇的量；N為稀釋倍數(shù)。

（5）發(fā)酵糖、氮磷源流加量計(jì)算。糖流加量：發(fā)酵液總體積30 L，設(shè)定酵母細(xì)胞生物量220 g·L-1 （含25%干物質(zhì)），則折合成干酵母1 650 g，按照糖對(duì)酵母轉(zhuǎn)化率60%計(jì)算則需要糖2 750 g，折合成40 Brix糖蜜（即100 mL含糖28 g）約為10 L左右；配置濃度為28%的葡萄糖溶液10 L作為另外方案的碳源。氮流加量：設(shè)定干酵母含蛋白質(zhì)48% （工業(yè)發(fā)酵平均值），則需要N 126.72氮元素。試驗(yàn)中，氮元素主要由氨水（氮元素含量為0.175 g·mL-1 ）提供，需要氨水約為720 mL。磷流加量：設(shè)定干酵母含五氧化二磷2.5%，則需要五氧化二磷41.25 g，折合磷酸二氫氨為68 g，將磷源溶于680 mL水中。糖蜜、磷源、流加瓶、硅膠管均以115 ℃，30 min滅菌處理。

（6）流加發(fā)酵程序。原始流加方案，對(duì)流加發(fā)酵程序設(shè)定值如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始方案發(fā)酵過程的溶氧分析

碳源是構(gòu)成酵母細(xì)胞碳架及能量的來源，碳源的流加速度直接影響細(xì)胞的增值速度。因?yàn)閯傞_始發(fā)酵罐中只有底水，所以在種子接入后，開始按照上表的流加程序流加碳、氮、磷源。發(fā)酵液中如果酒精含量過高，就會(huì)一直生長酵母，同時(shí)降低碳源轉(zhuǎn)化率，因此，控制發(fā)酵過程中酒精含量極為重要。由于克雷布效應(yīng)的存在，即使這時(shí)發(fā)酵液中氧氣充足，當(dāng)碳源添加過快時(shí)，也會(huì)產(chǎn)生乙醇。因此，在發(fā)酵過程中需要每個(gè)小時(shí)都檢測(cè)酒精含量。當(dāng)糖蜜作流加碳源時(shí)，取5次試驗(yàn)的平均值，低糖酵母細(xì)胞生長情況如圖1所示?？梢詮膱D1中看到，利用糖蜜進(jìn)行低糖酵母發(fā)酵，其生理參數(shù)的變化，包括溶解氧Dissolved oxygen （DO）；氧吸收速率Oxygen uptake rate （OUR）；二氧化碳釋放速率Carbon dioxide evolution rate （CER）；作出糖蜜、氨水流加速率以及pH變化。為了避免葡萄糖的巴斯德效應(yīng)（氧抑制作用）和Crabtree效應(yīng)（葡萄糖對(duì)氧化呼吸鏈的抑制作用[5]）對(duì)細(xì)胞生長的影響以及減少副產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)生，選擇合理的糖蜜流加策略成為低糖酵母高密度發(fā)酵的關(guān)鍵，因此，試驗(yàn)采用了基于實(shí)時(shí)參數(shù)呼吸商（Respiratory quotient， RQ）和酒精濃度調(diào)控的糖蜜補(bǔ)料策略。

從圖1中還可以看到，溶氧在發(fā)酵初期下降并不迅速，從5 h開始大幅度降低。隨著不斷進(jìn)行糖蜜的流加發(fā)酵，發(fā)酵罐中的溶解氧逐漸降低，直到14 h基本為0。前期溶氧下降很慢，濕重增加很少，酵母生長緩慢。主要原因可能是碳源、氮源補(bǔ)充不足，或者是接種量、種齡等造成的延遲期過長。5 h后溶氧大幅度降低，這是因?yàn)榻湍咐锰荚催M(jìn)行代謝作用，需要大量消耗氧氣。這說明5 h后酵母代謝旺盛，濕重較之前有所上升。在整個(gè)發(fā)酵過程中，溶氧不斷下降，只到發(fā)酵結(jié)束降為0，說明在此次發(fā)酵過程中，酵母一直處于代謝加強(qiáng)的過程，耗氧量不斷增大。

2.2 原始方案發(fā)酵過程生物量的變化分析

在發(fā)酵初期，生物量增長緩慢，細(xì)胞處于延遲期，合成新的酶系以適應(yīng)環(huán)境[6]。在5 h以后酵母開始快速增長，生物量急劇上升，可以看到在0～9 h，酒精濃度處于極低的水平，說明在發(fā)酵過程中，溶氧充足，同時(shí)因?yàn)闊o氧呼吸所生成的酒精含量極少，因此未能造成酒精的積累。在第9 h后，糖蜜流加速率繼續(xù)增加，乙醇濃度升高，酵母仍快速生長，說明此時(shí)的酒精濃度并未抑制酵母的生長。乙醇濃度在增大后逐漸降低為0。此時(shí)，雖然碳源流加量有所增加，但是乙醇濃度仍在降低。乙醇產(chǎn)生量很少，說明在碳源控制上避免了Crabtree效應(yīng)以及酵母的無氧呼吸作用。理論上，RQ值為1時(shí)，TCA通路被完全打開，葡萄糖經(jīng)TCA通路完全轉(zhuǎn)化為水和二氧化碳[7]。而當(dāng)?shù)吞墙湍咐靡掖歼M(jìn)行有氧代謝時(shí)，RQ為0.67，當(dāng)RQ值低于1時(shí)，也說明此時(shí)酵母在利用乙醇作為碳源進(jìn)行代謝，說明了碳源不充足。endprint

發(fā)酵過程的重要生理參數(shù)OUR和CER很好地描述了酵母細(xì)胞的生長狀況[8]。在發(fā)酵初期，酵母生長處于延遲期，呼吸作用較弱，因此OUR與CER均較低，隨后兩個(gè)值逐漸增大，說明酵母的有氧呼吸不斷增強(qiáng)，同時(shí)生物量不斷積累。可以發(fā)現(xiàn)，OUR、CER在糖蜜流加過程中保持著同步的增減，RQ在8 h前維持在0.8～0.9的范圍內(nèi)，可以看出酵母生長較為緩慢，隨后RQ范圍維持在0.9～1.0的范圍，酵母濕重快速增長。

發(fā)酵過程通過pH值控制來調(diào)整發(fā)酵液中C/N比例。按照程序設(shè)定，pH值在發(fā)酵過程中呈逐漸上升，利用流加氨水來作為氮源[9]。可以看到在第4小時(shí)，pH值出現(xiàn)短暫的下降然后上升，此時(shí)的氨水流加速率基本恒定，說明了代謝過程有部分酸的積累，包括丙酮酸在內(nèi)的各種有機(jī)酸在大量積累[10]，同時(shí)結(jié)合濕重變化情況可以看到，酵母濕質(zhì)量在5 h后開始大量積累，產(chǎn)生大量代謝中間物。在11 h后流加氨水速率恒定，pH值出現(xiàn)先上升后恒定，說明了流加氨水的量在11 h并未被完全利用，有多余的NH4+離子可以保持pH值的上升，最后隨著氨水流加停止，pH值迅速下降，這是因?yàn)榻湍复x生成的中間代謝物以及糖蜜等酸性物質(zhì)的積累。

在原始方案中，最終發(fā)酵14 h，放罐體積約為30 L，最終濕質(zhì)量為150 g·L-1，干物質(zhì)含量約為25%，因此干物質(zhì)總量約為1 125 g。

2.3 優(yōu)化方案發(fā)酵過程的溶氧分析

通過上述分析，對(duì)流加方案中每個(gè)小時(shí)糖蜜流加速率進(jìn)行調(diào)節(jié)，采用上述方法進(jìn)行分析，多次試驗(yàn)后得到優(yōu)化方案，利用優(yōu)化方案也就是表2的方案進(jìn)行流加發(fā)酵，取5次試驗(yàn)的平均值，做出低糖酵母的濕質(zhì)量增長、酒精、CER、OUR、DO、RQ變化圖（圖2），并對(duì)其進(jìn)行分析。

在發(fā)酵初始過程可以明顯看到溶氧急劇下降，攝氧率增加，這是由于菌體開始代謝的結(jié)果[11]，如圖2所示。隨著不斷地進(jìn)行糖蜜的流加發(fā)酵，發(fā)酵罐中的溶解氧逐漸降低，直到6 h基本為0，這是由于酵母進(jìn)入快速生長，大量進(jìn)行有氧呼吸，因此發(fā)酵液中溶解氧快速降低到零。在6～14 h，溶解氧一直維持在0的狀態(tài)，說明菌體的呼吸能力一直維持較強(qiáng)狀態(tài)。

2.4 優(yōu)化方案發(fā)酵過程生物量的變化分析

在發(fā)酵初期，生物量增長緩慢，細(xì)胞處于延遲期，合成新的酶系以適應(yīng)環(huán)境。在3 h后酵母開始快速增長，生物量急劇上升，可以看到在0～3 h，酒精濃度在逐漸降低，說明初始種子液中含有部分酒精，在發(fā)酵初期被酵母作為碳源進(jìn)行利用。隨后糖蜜流加速率加快，乙醇濃度升高，酵母仍快速生長，說明此時(shí)的酒精濃度并未抑制酵母的生長。在8 h以后出現(xiàn)酒精濃度逐漸下降的情況，同時(shí)出現(xiàn)酵母的比生長速率降低，最大可能是碳源供應(yīng)量不足導(dǎo)致的。隨著碳源流加量的不斷加大，酵母的濕質(zhì)量不斷增加，到第13 h達(dá)到最大值隨后出現(xiàn)下降，此時(shí)主要是由于糖蜜流加量的減少以及停止流加氨水所致。對(duì)于利用糖蜜進(jìn)行低糖酵母發(fā)酵，可以看到，在指數(shù)生長期，酵母生長迅速，當(dāng)然這種迅速的生長依賴于對(duì)氧的大量消耗。在發(fā)酵過程中控制RQ在0.9～1.1的范圍內(nèi)，可以使得酒精含量在0.2%以下，全程并未出現(xiàn)酒精抑制酵母生長的現(xiàn)象，同時(shí)在發(fā)酵中也并未出現(xiàn)克雷布效應(yīng)。

在發(fā)酵初期，酵母生長處于延遲期，呼吸作用較弱，因此OUR與CER均較低。隨后兩個(gè)值逐漸增大，說明酵母的有氧呼吸不斷增強(qiáng)。同時(shí)，生物量不斷積累，可以發(fā)現(xiàn)，OUR、CER在糖蜜流加過程中保持著同步的增減，RQ在整個(gè)對(duì)數(shù)生長期基本維持在0.9～1.1的范圍，這也間接說明了在這個(gè)時(shí)期，酵母大量利用糖蜜中的可發(fā)酵性糖來進(jìn)行有氧呼吸，因?yàn)槔闷咸烟峭耆M(jìn)行有氧呼吸時(shí)RQ值為1。

發(fā)酵過程通過pH值控制來調(diào)整發(fā)酵液中C/N比例。按照程序設(shè)定，pH值在發(fā)酵過程中呈逐漸上升，利用流加氨水來作為氮源。在3 h前，氨水流加量較小，隨著酵母的快速生長，氨水補(bǔ)加速率明顯增加，NH4+濃度的增大會(huì)激活磷酸果糖激酶的活性、過量的丙酮酸積累、各種有機(jī)酸的產(chǎn)生，因此，氨水不斷加入可以彌補(bǔ)pH值的降低。在7 h后，葡萄糖流加速率減緩，氨水補(bǔ)加速率恒定，生成有機(jī)酸的速率減緩，因此，溶液的pH值緩慢上升[12]。在13 h后，停止補(bǔ)加氨水，可以看到發(fā)酵液中pH值快速降低，說明酵母仍在代謝產(chǎn)生有機(jī)酸，但是由于氨水的停止加入，使得酵母生長速率降低，同時(shí)由于發(fā)酵液體積的增大，造成了最終發(fā)酵液中酵母濕質(zhì)量的降低。

在優(yōu)化后方案中，最終發(fā)酵14 h，放罐體積約為30 L，最終濕質(zhì)量為220 g·L-1，干物質(zhì)含量約為25%，因此干物質(zhì)總量約為1 650 g。

3 結(jié) 論

本試驗(yàn)研究了對(duì)數(shù)期發(fā)酵過程中重要的生理學(xué)參數(shù)變化特征，其中RQ值的大小與發(fā)酵過程中酒精的含量高低具有高度相關(guān)性，這說明RQ值的變化代表了代謝途徑的變化。發(fā)酵過程中糖蜜的流加量需要充足才能維持低糖酵母快速持續(xù)的增長。菌體在發(fā)酵過程中十分耗氧，并且菌體的生理學(xué)參數(shù)OUR與濕質(zhì)量增長狀況保持了良好的一致性。以糖蜜為碳源，控制RQ水平在0.9～1.1的范圍內(nèi)，可以控制全程酒精濃度在較低范圍，并且最終酵母濕質(zhì)量達(dá)到較高水平，發(fā)酵14 h后，濕質(zhì)量可以達(dá)到220 g·L-1，折算成干物質(zhì)總量為1 650 g，比原始方案提高了525 g。

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