犬新孢子蟲(chóng)免疫相關(guān)蛋白篩選及其生物信息學(xué)分析

楊升++宮鵬濤++李建華++呂強(qiáng)++楊舉++李赫++張西臣

摘 要：利用新孢子蟲(chóng)感染小鼠血清對(duì)新孢子蟲(chóng)cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行SEREX篩選，獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序后進(jìn)行Blast分析，并利用生物學(xué)軟件對(duì)其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，經(jīng)篩選共獲得了4個(gè)陽(yáng)性克隆序列，分別為新孢子蟲(chóng)表面抗原SAG1，兩個(gè)假定蛋白（XM_003882171.1）和（XM_003882600.1），以及一個(gè)未命名蛋白（XM_003885351.1）。研究共獲得了4個(gè)新孢子蟲(chóng)免疫相關(guān)蛋白，為新孢子蟲(chóng)診斷及其疫苗研究等研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：犬新孢子蟲(chóng)；cDNA表達(dá)文庫(kù)；免疫相關(guān)蛋白；篩選

中圖分類號(hào)：R382.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.10.001

Screening on Immune Associated Protein of Neospora caninum and Its Analysis of Biological Information

YANG Sheng1，2， GONG Pengtao1， LI Jianhua1， LYU Qiang1，YANG Ju1 ， LI He1， ZHANG Xichen1

（1.College of Veterinary Medicine，Jilin University， Changchun， Jilin 130062， China； 2. College of Animal Science and Veterinary Medicine， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract：By SEREX， the cDNA expression library of Neospora caninum were screened using mice serum infected with Neospora caninum. The positive clones were sequenced and analyzed by the biology software. The results showed that four positive clones sequence were obtained which were one surface antigen SAG1 of N.caninum， two putative protein （XM_003882171.1） and （XM_003882600.1）， and an unnamed protein（XM_003885351.1） respectively. Four immune associated proteins were successfully obtained， which lay the foundation for the diagnosis and vaccine of Neospora caninum.

Key words： Neospora caninum；cDNA expression library；immune associated protein；screening

犬新孢子蟲(chóng)（Neospora caninum）是一種新發(fā)現(xiàn)的胞內(nèi)寄生性原蟲(chóng)，最早由Bjerkas于1984年在患腦膜炎和肌炎的幼犬體中發(fā)現(xiàn)，并由Dubey于1988年根據(jù)其形態(tài)特征命名為犬新孢子蟲(chóng)。目前，新孢子蟲(chóng)呈世界性分布，在中國(guó)劉群等于2007年在流產(chǎn)胎牛腦組織中發(fā)現(xiàn)了新孢子蟲(chóng)，證實(shí)了我國(guó)也存在新孢子蟲(chóng)的感染[1]。新孢子蟲(chóng)可感染犬、牛等多種動(dòng)物，寄生于宿主體內(nèi)可導(dǎo)致孕畜流產(chǎn)或產(chǎn)死胎以及新生幼畜運(yùn)動(dòng)神經(jīng)障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失。

新孢子蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞的粘附/侵入是其發(fā)病機(jī)制中一個(gè)重要的過(guò)程。首先，微線蛋白介導(dǎo)新孢子蟲(chóng)胞外膜緊密附著在其宿主細(xì)胞細(xì)胞膜上[2]，與細(xì)胞膜上受體結(jié)合并形成可移動(dòng)的連接區(qū)域[3]。經(jīng)棒狀體蛋白對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行修飾后[4-5]，宿主細(xì)胞膜內(nèi)陷并形成納蟲(chóng)泡，并在細(xì)胞骨架驅(qū)動(dòng)下向速殖子末端靠攏，直至其完全進(jìn)入空泡中。之后致密顆粒蛋白修飾納蟲(chóng)空泡，該修飾過(guò)程在空泡內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)的形成中起重要作用，并且不易被溶酶體所裂解。在納蟲(chóng)空泡內(nèi)，新孢子蟲(chóng)約2～3 d即可繁殖5～6代，待在宿主細(xì)胞裂解后，速殖子可侵入新的宿主細(xì)胞并完成下一輪的侵入過(guò)程[5-6]。然而，新孢子蟲(chóng)的粘附/侵入過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，仍需要進(jìn)一步研究。新孢子蟲(chóng)免疫相關(guān)蛋白屬于粘附/侵入相關(guān)的蛋白，在新孢子蟲(chóng)感染宿主過(guò)程中起重要作用，由其制備的疫苗可抑制新孢子蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞的侵入，并對(duì)新孢子蟲(chóng)病起保護(hù)效果。

cDNA表達(dá)文庫(kù)是獲得免疫相關(guān)蛋白簡(jiǎn)單有效的工具。目前，關(guān)于新孢子蟲(chóng)表達(dá)文庫(kù)的研究較多，張侯雙等[7]利用抗弓形蟲(chóng)血清從新孢子蟲(chóng)速殖子cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選出一交叉抗原AMA1，利用其制備的多抗可抑制新孢子蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)對(duì)宿主細(xì)胞的侵入。并且，他還獲得了核糖體磷蛋白PO，它可作為新孢子蟲(chóng)和弓形蟲(chóng)的候選疫苗抗原[8]。Atkinson等[9]利用抗新孢子蟲(chóng)血清從cDNA表達(dá)文庫(kù)中篩選獲得了GRA1和NcP20，免疫小鼠后可刺激機(jī)體產(chǎn)生IgG抗體。此外，從表達(dá)文庫(kù)中獲得的新孢子蟲(chóng)免疫相關(guān)蛋白還有NcMIC3[10]，GRA2[11]，二硫鍵異構(gòu)酶蛋白（PDI），熱應(yīng)激蛋白70（HSP70）和核糖體蛋白（RP1）[12]以及GRA7[13]，這些蛋白抗原的獲得為新孢子蟲(chóng)的免疫保護(hù)機(jī)制和新孢子蟲(chóng)診斷及疫苗的研究提供了原材料。

本研究利用鼠抗犬新孢子蟲(chóng)的免疫血清對(duì)新孢子蟲(chóng)速殖子文庫(kù)進(jìn)行了SEREX法篩選，以期獲得新孢子蟲(chóng)免疫相關(guān)抗原蛋白基因，為新孢子蟲(chóng)病診斷和疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。endprint

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 主要試劑 新孢子蟲(chóng)速殖子cDNA表達(dá)文庫(kù)為筆者所在實(shí)驗(yàn)室所構(gòu)建， E.coli XL-blue大腸桿菌購(gòu)自Clontech公司，2×PCR 預(yù)混料購(gòu)自天跟公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購(gòu)自武漢博士德生物公司，硝酸纖維素膜（NC 膜）購(gòu)自Pall公司，IPTG購(gòu)自Promege公司。

1.1.2 引物合成 用于篩選文庫(kù)的引物由上海生工合成，序列為：上游引物，5'-CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT-3'；下游引物，5'-ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGC-3'。

1.2 方 法

1.2.1 抗新孢子蟲(chóng)血清的準(zhǔn)備 將新孢子蟲(chóng)（2×105）接種BALB/c小鼠，50 d后收集免疫血清；將大腸桿菌XL1-Blue擴(kuò)大培養(yǎng)并收集XL1-Blue菌，反復(fù)凍融數(shù)次后超聲破碎，收集上清液（12 000 g，20 min），將上清液用封閉液稀釋（1∶10）后與小鼠免疫血清（2∶1）混合，室溫下共同溫育4 h以去除交叉反應(yīng)性抗體，所得孵育血清即為所需的一抗血清。

1.2.2 新孢子蟲(chóng)速殖子cDNA表達(dá)文庫(kù)的篩選 文庫(kù)的篩選參考候洪烈篩選方法[14]，步驟如下。首先，在平皿中鋪噬菌體文庫(kù)，放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)λ噬菌體至噬菌斑長(zhǎng)至針尖大??；然后將硝酸纖維素膜編號(hào)后浸泡在10 mmol·L-1的IPTG中10 min，取出并用濾紙吸去水珠后覆蓋在平皿中的噬菌斑表面并做好標(biāo)記，濾膜一旦與平板接觸后，切勿再移動(dòng)。37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h，小心用平頭鑷子剝離濾膜。將剝離濾膜后的平板保存在4 ℃冰箱中備用。

將硝酸纖維素膜用10%胎牛血清封閉2 h；清洗后用制備的一抗（1∶500稀釋）4 ℃孵育過(guò)夜；清洗后用羊抗鼠IgG二抗孵育（1∶2 000）2 h，清洗后DAB顯色；挑取與硝酸纖維素膜顯色相對(duì)應(yīng)的平皿上陽(yáng)性噬菌斑進(jìn)行復(fù)篩以去除假陽(yáng)性的噬菌體，之后挑去陽(yáng)性噬菌斑于噬菌體緩沖液中，4 ℃過(guò)夜備用。

1.2.3 基因的序列測(cè)定與分析 （1）PCR鑒定。取50 μL挑取的噬菌斑緩沖液，100 ℃煮10 min，12 000 g離心10 min，取上清（即噬菌體基因組模板）。利用PCR預(yù)混料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系為PCR Mix 25 μL、上游引物 1 μL、下游引物1 μL、基因組模板1 μL、ddH2O 22 μL，程序?yàn)?4 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、61 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，取PCR產(chǎn)物6 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送上海生工測(cè)序。（2）序列分析。將測(cè)序后得到的序列登陸NCBI BLAST進(jìn)行核酸同源性比較并利用ExPASy（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）和InterProScan（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）進(jìn)行氨基酸序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫篩選

利用免疫血清對(duì)新孢子蟲(chóng)速殖子cDNA表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行篩選后，共得到4個(gè)陽(yáng)性克隆序列，分別命名為NC-A、NC-B、NC-C和NC-D，圖1為免疫血清對(duì)文庫(kù)復(fù)篩結(jié)果。

2.2 Blast比對(duì)及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

NC-A測(cè)序后經(jīng)Blast分析，其核酸序列分別與新孢子蟲(chóng)表面抗原SAG1（gb|AF141960.1|）同源性為100%，ExPASy（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）和InterProscan （http：//www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）生物學(xué)軟件分析結(jié)果表明，SAG1序列全長(zhǎng)820 bp，編碼273個(gè)氨基酸aa，蛋白分子量為29 kDa，等電點(diǎn)為6.74，含有8個(gè)表面抗原結(jié)構(gòu)域和2個(gè)SAG結(jié)構(gòu)域（圖2），因此，屬于表面抗原類蛋白。

NC-B核酸序列經(jīng)比對(duì)與假定蛋白（XM_003882171.1）同源性為99%，ExPASy和InterProscan 生物學(xué)軟件分析結(jié)果表明，該蛋白（XM_003882171.1）序列全長(zhǎng)1 563 bp，編碼462個(gè)氨基酸，蛋白分子量為52 kDa，等電點(diǎn)為8.87，含有一個(gè)多聚（ADP-Ribose）水解酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PARG-cat結(jié)構(gòu)域（圖3），推測(cè)其屬于水解酶類蛋白。

NC-C核酸序列經(jīng)比對(duì)與假定蛋白（XM_003882600.1）同源性為100%，ExPASy和InterProscan 生物學(xué)軟件分析結(jié)果表明，該假定蛋白序列全長(zhǎng)750 bp，編碼249個(gè)氨基酸，蛋白分子量為29 kDa，等電點(diǎn)為10.30，含有DUF1777結(jié)構(gòu)域和一個(gè)PTHR31077結(jié)構(gòu)域（圖4），其功能未知。

NC-D核算序列經(jīng)比對(duì)與新孢子蟲(chóng)未命名蛋白（XM_003885351.1）同源性為100%，并且與弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白（XM_002364659.1）同源性為85%，ExPASy和InterProscan 生物學(xué)軟件分析結(jié)果表明，該未命名蛋白（XM_003885351.1）序列全長(zhǎng)2 838 bp，編碼945個(gè)氨基酸，蛋白分子量為108 kDa，等電點(diǎn)為8.14，含有一個(gè)lipase結(jié)構(gòu)域1個(gè)PTHR14463結(jié)構(gòu)域（圖5），推測(cè)其屬于棒狀體類蛋白。這些免疫相關(guān)蛋白的獲得為新孢子蟲(chóng)免疫保護(hù)機(jī)制和新孢子蟲(chóng)疫苗抗原的研究奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論與討論

新孢子蟲(chóng)病分布范圍廣，危害嚴(yán)重，然而目前并沒(méi)有有效的疫苗可以預(yù)防新孢子蟲(chóng)病。保護(hù)性抗原是研究寄生蟲(chóng)疫苗的一種重要原材料，但由于目前對(duì)新孢子蟲(chóng)侵入機(jī)體的機(jī)制不是很了解，所獲得的新孢子蟲(chóng)保護(hù)性抗原相對(duì)較少。對(duì)于新孢子蟲(chóng)抗原，目前研究較多的有表面抗原 NcSAG1 和NcSRS2[15]，致密顆?？乖?NcGRA2， NcGRA6[16]，NcGRA7[17] 以及NcMAG1[18] ， 微線蛋白NcMIC1 和 NcMIC3 [19-20] ， 棒狀體蛋白NcROP2 [21]，頂膜抗原 NcAMA1[22]、親環(huán)蛋白 [23] 、核糖體蛋白 NcP0 [24] 和熱應(yīng)激蛋白NcsHSP33 [17] ，這些抗原對(duì)于新孢子蟲(chóng)診斷及疫苗的研究起到了重要作用，然而仍缺乏理想的診斷抗原和有效的新孢子蟲(chóng)疫苗抗原。endprint

cDNA 文庫(kù)免疫學(xué)篩選是目前獲得免疫相關(guān)抗原簡(jiǎn)單有效的方法。該方法已廣泛應(yīng)用在柔嫩艾美爾球蟲(chóng)[25]、毒害艾美耳球蟲(chóng)[26]、旋毛蟲(chóng)[27]、日本血吸蟲(chóng)[28]和華支睪吸蟲(chóng)[29]等寄生蟲(chóng)相關(guān)抗原的研究中。SEREX技術(shù)是Sahin等建立的cDNA 表達(dá)文庫(kù)血清學(xué)篩選方法，通過(guò)抗原抗體特異性結(jié)合原理獲得抗原，已被廣泛用于各種寄生蟲(chóng)抗原的鑒定。本研究利用SEREX技術(shù)對(duì)新孢子蟲(chóng)cDNA 表達(dá)文庫(kù)進(jìn)行免疫學(xué)篩選，同時(shí)采取了將血清與大腸桿菌裂解液共同孵育的方法，從而有效地避免出現(xiàn)假陽(yáng)性的出現(xiàn)[14]。通過(guò)對(duì)新孢子蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的篩選，獲得了新孢子蟲(chóng)新孢子蟲(chóng)表面抗原SAG1，兩個(gè)假定蛋白（XM_003882171.1）和（XM_003882600.1），以及一個(gè)未命名蛋白（XM_003885351.1），同源性為100%（該序列同時(shí)與弓形蟲(chóng)棒狀體蛋白（XM_002364659.1）同源性為85%）。這些免疫相關(guān)蛋白為今后新孢子蟲(chóng)診斷及其疫苗研究等研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]ZHANG W， DENG C， LIU Q， et al. First identification of Neospora caninum， infection in aborted bovine foetuses in China[J]. Veterinary parasitology， 2007， 149（1/2）：72.

[2]CARRUTHERS V B， SIBLEY L D. Sequential protein secretion from three distinct organelles of Toxoplasma gondii accompanies invasion of human fibroblasts[J]. European journal of cell biology， 1997， 73（2）：114-23.

[3]HEMPHILL A， GOTTSTEIN B， KAUFMANN H. Adhesion and invasion of bovine endothelial cells by Neospora caninum [J]. Parasitology， 1996，112：183-187.

[4]武曉燕，黃曉紅.新孢子蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)，2010，22（9）：873-877.

[5]BUXTON D， MCALLISTER M M， DUBEY J P. The comparative pathogenesis of neosporosis [J]. Trends parasitology， 2002，18（12）：546-52.

[6]呂強(qiáng).犬新孢子蟲(chóng)宿主細(xì)胞結(jié)合蛋白篩選及其免疫原性分析[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2013.

[7]ZHANG H S， COMPAORE M K， LEE E G， et al. Apical membrane antigen 1 is a cross-reactive antigen between Neospora caninum and Toxoplasma gondii， and the anti-NcAMA1 antibody inhibits host cell invasion by both parasites [J]. Molecular and biochemical parasitology， 2007（151）：205-212.

[8]ZHANG H， LEE E G， LIAO M， et al. Identification of ribosomal phosphoprotein P0 of Neospora caninum as a potential common vaccine candidate for the control of both neosporosis and toxoplasmosis [J]. Molecular and biochemical parasitology， 2007，153（2）：141-148.

[9]ATKINSON R A， RYCE C， MILLER C M， et al. Isolation of Neospora caninum genes detected during a chronic murine infection[J]. International journal for parasitology， 2001， 31（1）：67-71.

[10]SONDA S， FUCHS N B， HEMPHILL A. Molecular characterization of a novel microneme antigen in Neospora caninum[J]. Molecular and biochemical parasitology， 2000， 108（1）：39-51.

[11]ELLIS J T， RYCE C， ATKINSON R， et al. Isolation， characterization and expression of a GRA2 homologue from Neospora caninum [J]. Parasitology， 2000，120 （ Pt 4）：383-390.

[12]LIAO M， XUAN X， HUANG X， et al. Identification and characterization of cross-reactive antigens from Neospora caninum and Toxoplasma gondii[J]. Parasitology， 2005，130（Pt 5）：481-488.endprint

[13]ALVAREZ-GARCA G， PITARCH A， ZABALLOS A， et al. The NcGRA7 gene encodes the immunodominant 17 KDaa antigen of Neospora caninum [J]. Parasitology， 2007，134（Pt 1）：41-50.

[14]侯洪烈.犬惡絲蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及免疫相關(guān)蛋白的研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2011.

[15]CANNAS A， NAGULESWARAN A， MLLER N， et al.Vaccination of mice against experimental N. caninum infection using NcSAG1-and NcSRS2-based recombinant antigens and DNA-vaccines[J]. Parasitology，2003，126：303-312.

[16]RAMAMOORTHY S， LINDSAY D S， SCHURIG G G， et al. Vaccination with gamma-irradiated Neospora caninum tachyzoites protects mice against acute challenge with N. caninum[J]. Journal of eukaryotic microbiology， 2010， 53（2）：151-156.

[17]LIDDELL S， PARKER C， VINYARD B， et al. Immunization of mice with plasmid DNA coding for NcGRA7 or NcsHSP33 confers partial protection against vertical transmission of Neospora caninum[J]. Journal of parasitology， 2003， 89（3）：496-500.

[18]DEBACHE K， GUIONAUD C， ALAEDDINE F， et al. Intraperitoneal and intranasal vaccination of mice with three distinct recombinant Neospora caninum antigens results in differential effects with regard to protection against experimental challenge with Neospora caninum tachyzoites[J]. Parasitology，2010（137）：229-240.

[19]ALAEDDINE F， KELLER N， LEEPIN A， et al. Reduced infection and protection from clinical signs of cerebral neosporosis in C57BL/6 mice vaccinated with recombinant microneme antigen NcMIC1[J]. Journal of parasitology， 2005， 91（3）：657-65.

[20]CANNAS A， NAGULESWARAN A， MLLER N， et al. Reduced cerebral infection of Neospora caninum-infected mice after vaccination with recombinant microneme protein NCMIC3 and ribi adjuvant[J]. Journal of parasitology， 2003， 89（1）：44-50.

[21]MONNEY T， RǜTTI D， SCHORER M， et al. RecNcMIC3-1-R is a microneme- and rhoptry-based chimeric antigen that protects against acute neosporosis and limits cerebral parasite load in the mouse model for Neospora caninum infection[J]. Vaccine，2003，29：6967-6975.

[22]ZHANG H， COMPAORE M K， LEE E G， et al. Apical membrane antigen 1 is a cross-reactive antigen between Neospora caninum and Toxoplasma gondii， and the anti-NcAMA1 antibody inhibits host cell invasion by both parasites[J]. Molecular and biochemical parasitology， 2007， 151（2）：205-212.

[23]TUO W， ZHAO Y， ZHU D， et al. Immunization of female BALB/c mice with Neospora cyclophilin and/or NcSRS2 elicits specific antibody response and prevents against challenge infection by Neospora caninum[J]. Vaccine， 2011（29）：2392-2399.

[24]ZHANG H， LEE E G， LIAO M， et al. Identification of ribosomal phosphoprotein P0 of Neospora caninum as a potential common vaccine candidate for the control of both neosporosis and toxoplasmosis[J]. Molecular and biochemical parasitology， 2007， 153（2）：141-148.

[25]翟軍軍.柔嫩艾美耳球蟲(chóng)楊凌株 cDNA 文庫(kù)的免疫學(xué)篩選及其主要抗原基因的克隆與表達(dá)[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011.

[26]卞慶松.毒害艾美球蟲(chóng)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和基因篩選[D].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2008.

[27]張亞蘭， 付寶權(quán)，劉明遠(yuǎn)，等. 旋毛蟲(chóng)3 日齡成蟲(chóng)cDNA 文庫(kù)的免疫篩選[C]//中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜寄生蟲(chóng)學(xué)分會(huì)第五次代衰大會(huì)皿第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（線蟲(chóng)部分）.北京：中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)，2004：297-300.

[28]馮笑川，吳宜琴，陳淑貞，等. 日本血吸蟲(chóng)cDNA 庫(kù)免疫篩選及部分克隆鑒定[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），1993（2）：166.

[29]張小玲.華支睪吸蟲(chóng)囊蚴cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與免疫學(xué)篩選[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2010.endprint