HPLC同時(shí)測(cè)定鴨跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素的含量

曹 旭， 史培培， 童圣靈， 梁鵬飛， 蔡 芳， 胡 楊

(1.江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司， 江蘇 鎮(zhèn)江 212009； 2.鎮(zhèn)江華康大藥房連鎖有限公司， 江蘇 揚(yáng)中 212200)

HPLC同時(shí)測(cè)定鴨跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素的含量

曹 旭1， 史培培2， 童圣靈1， 梁鵬飛1， 蔡 芳1， 胡 楊1

(1.江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司， 江蘇 鎮(zhèn)江 212009； 2.鎮(zhèn)江華康大藥房連鎖有限公司， 江蘇 揚(yáng)中 212200)

采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定鴨跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素的含量。色譜條件為：色譜柱為Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)柱，以甲醇(A)-體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水(B)梯度洗脫：0～17 min，22% A～42% A；17～28 min，42% A～56% A；28～40 min，56% A～90% A，檢測(cè)波長(zhǎng)為350 nm，流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃?？Х人?、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素分別在2.16～86.4 mg/L、6.445～257.8 mg/L和3.293～131.7 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,平均回收率分別為98.36%，99.42%和98.00%。該方法準(zhǔn)確、可靠、重復(fù)性好，可用于鴨跖草提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制。

鴨跖草提取物； 咖啡酸； 槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷； 異葒草素； 高效液相色譜法

鴨跖草為鴨跖草科植物鴨跖草(CommelinacommunisL.)的干燥莖葉部分，藥性甘、淡、寒，歸肺、胃、小腸經(jīng)，具清熱瀉火、解毒、利水消腫之功效，常用于感冒發(fā)熱、熱病煩渴、咽喉腫痛、水腫尿少、熱淋澀痛、癰腫疔毒的治療[1-2]。鴨跖草始載于《本草拾遺》，現(xiàn)代藥理研究表明，鴨跖草具有抗炎、降血糖、降血脂及抗氧化等藥理作用[3-5]。近年有學(xué)者對(duì)鴨跖草的化學(xué)成分進(jìn)行了研究[6-7]。在前期研究工作中采用HPLC-MS初步鑒定本試驗(yàn)中鴨跖草提取物的主要成分為咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素，而尚未對(duì)鴨跖草中此3種成分測(cè)定研究，故本研究采用高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)對(duì)鴨跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素的含量進(jìn)行測(cè)定，為鴨跖草的新藥開(kāi)發(fā)及功能性保健產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

LC-20A和SPD-20AT檢測(cè)器(島津株式會(huì)社)；N2000雙通道色譜站(浙江大學(xué)智能信息工程研究所)；Buchi旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；微量移液器(北京大龍儀器公司)；超聲清洗機(jī)(上海易凈超聲波儀器)。

1.2 材 料

咖啡酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110885-200102)；槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷對(duì)照品(上海源葉，純度≥98%，批號(hào)：140528)；異葒草素對(duì)照品(上海純優(yōu)，純度≥97%，批號(hào)：P0152)；鴨跖草提取物(自制，批號(hào)：20160903，20160924，20161011)；色譜純甲醇(美國(guó)Tedia)；純化水(自制)，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相組成：甲醇(A)-體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水(B);梯度洗脫：0～17 min，22% A～42% A；17～28 min，42% A～56% A；28～40 min，56% A～90% A；流速：1 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：350 nm。

2.2 鴨跖草提取物的制備

稱取鴨跖草適量，粉碎，過(guò)40目篩，加10倍量水，100 ℃回流提取2次，抽濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.15，加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇使含醇量達(dá)50%，醇沉靜置12 h，離心去沉淀，上清減壓濃縮除去乙醇，過(guò)HPD826大孔吸附樹(shù)脂，依次用水及體積分?jǐn)?shù)30%乙醇洗滌2個(gè)柱體積(BV)以除去水溶性雜質(zhì)及部分醇溶性雜質(zhì)，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇洗脫5 BV，收集洗脫液，回收乙醇并真空干燥，干燥后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，并過(guò)80目篩，備用。

2.3 溶液制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的配制

精密稱取咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素對(duì)照品適量于量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成含咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素濃度分別為86.4、257.8、131.7 mg/L的混合對(duì)照品溶液儲(chǔ)備液。分別吸取上述儲(chǔ)備液5、2.5、1、0.5、0.25 mL于5個(gè)10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素濃度分別為2.16、4.32、8.64、21.6、43.2、86.4 mg/L，6.445、12.89、25.78、64.45、128.9、257.8 mg/L和3.293、6.585、13.17、32.93、65.85、131.7 mg/L的系列混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備

取鴨跖草提取物100 mg，精密稱定，置入10 mL量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后備用。

2.4 方法專屬性

按2.1色譜條件進(jìn)樣分析，得到對(duì)照品和鴨跖草提取物的HPLC色譜圖，見(jiàn)圖1。在該色譜條件下，咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素的分離度良好。

2.5 線性關(guān)系考察

取咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素濃度分別為86.4、43.2、21.6、8.64、4.32、2.16 mg/L，257.8、128.9、64.45、25.78、12.89、6.445 mg/L和131.7、65.85、32.93、13.17、6.585、3.293 mg/L的系列對(duì)照品溶液，按2.1色譜條件測(cè)定峰面積，并以峰面積(A)對(duì)對(duì)照品溶液濃度(C)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素分別在2.16～86.4 mg/L、6.445～257.8 mg/L和3.293～131.7 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，三者的回歸方程分別為A=15 563C-2273.5(r=0.9998)，A=22 649C-2571.3(r=0.9998)，A=36 951C-17 225(r=0.9997)。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取含咖啡酸8.64 mg/L、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷25.78 mg/L和異葒草素13.17 mg/L的對(duì)照品溶液20 μL，按2.1色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄三者峰面積，結(jié)果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素峰面積的RSD分別為0.71%、0.56%、0.72%，表明儀器精密度良好。

2.7 中間精密度試驗(yàn)

稱取鴨跖草提取物(批號(hào)20160903)約100 mg，按2.3.2方法配制供試品溶液，分別由不同人員(A、B)在不同儀器(LC-20A、LC-2010AHT)用不同色譜柱(Phenomenex C18、Kromasil C18)操作，按2.1色譜條件進(jìn)樣，測(cè)得咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素的平均含量分別為1.095、2.974、1.282 mg/g，三者含量的RSD分別為1.46%、0.87%、1.34%，表明方法中間精密度良好。

1.咖啡酸； 2.槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷； 3.異葒草素圖1 鴨跖草提取物及對(duì)照品色譜圖

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取鴨跖草提取物(批號(hào)：20160903)6份，每份約100 mg，按2.3.2方法配制供試品溶液，再按2.1色譜條件進(jìn)樣，記錄咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素的峰面積，計(jì)算三者含量。結(jié)果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素在鴨跖草提取物的含量分別為1.096、2.973、1.284 mg/g，三者含量的RSD分別為1.37%、1.05%、1.26%，均小于2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取2.3.2供試品溶液，按2.1色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素峰面積，結(jié)果咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素峰面積RSD分別為1.41%、0.98%、1.27%，均小于2%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

稱取已知含量的鴨跖草提取物(20160903批)6份(每份約50 mg)于10 mL容量瓶中，分別精密加入咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素濃度分別為43.2、128.9、65.85 mg/L的混合對(duì)照品溶液1 mL，加適量甲醇后超聲溶解并定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率及RSD值，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率結(jié)果

2.11 樣品測(cè)定

稱取3批鴨跖草提取物各1份，每份100 mg，精密稱定，按2.3.2方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，通過(guò)回歸方程分別計(jì)算鴨跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 鴨跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素含量

3 討 論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷及異葒草素對(duì)照品分別經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果咖啡酸在323 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷在368 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，異葒草素在350 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，綜合考慮后選擇350 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

在選擇流動(dòng)相比例時(shí)，曾嘗試采用甲醇-水等度洗脫系統(tǒng)同時(shí)測(cè)定咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素3種成分，結(jié)果分離效果較差或保留時(shí)間相對(duì)過(guò)長(zhǎng)。因此，采用了甲醇-水梯度洗脫系統(tǒng)對(duì)鴨跖草提取物中3種成分進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果較為理想，同時(shí)加體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸調(diào)整峰型，結(jié)果峰型良好。

4 結(jié) 論

本研究采用HPLC同時(shí)測(cè)定鴨跖草提取物中咖啡酸、槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷和異葒草素的含量，該方法快速、準(zhǔn)確，重復(fù)性高，可用于鴨跖草提取物的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制，為鴨跖草功能性產(chǎn)品的研究開(kāi)發(fā)提供依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：282.

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[4] 譚志榮，李沛波，袁干軍.鴨跖草水提取物降血糖作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)熱帶醫(yī)學(xué)，2009，9(8)：1457-1461.

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[責(zé)任編輯：謝 平]

Simultaneous determination of caffeic acid, quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and isoorientin in extract ofCommelinacommunisL. by HPLC

CAO Xu1, SHI Pei-pei2, TONG Sheng-ling1, LIANG Peng-fei1, CAI Fang1, HU Yang1

(1.Jiangsu Jibrier Pharmaceutical Joint Stock Co., Ltd., Zhenjiang 212009, China;2.Zhenjiang Huakang Pharmacy Chain Co., Ltd., Yangzhong 212200, China)

The study uses HPLC method for simultaneous determination of the content of caffeic acid, quercetin-3-O-α-L-rhamnoside and isoorientin in extract ofCommelinacommunisL.. The HPLC analysis has been carried out on Phenomenex C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm) with methanol(A)-0.1% formic acid(B) gradient elution：0 min～17 min, 22% A～42% A;17 min～28 min, 42% A～56% A;28 min～40 min, 56% A～90% A at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength is 350 nm and the column temperature is 35 ℃. Good linear relationship has been found in the the range of 2.16～86.4 mg/L for caffeic acid, 6.445～257.8 mg/L for quercetin-3-O-α-L-rhamnoside, 3.293～131.7 mg/L for isoorientin. Their average recoveries are 98.36%, 99.42% and 98.00%, respectively. The method is accurate, reliable, and can be used for the quality control and evaluation of extract ofCommelinacommunisL..

extract ofCommelinacommunisL.; caffeic acid; quercetin-3-O-α-L-rhamnoside; isoorientin; HPLC

R284.1; O657.7+2

A

2096-3998(2017)05-0065-05

2017-06-02

2017-06-22

曹旭(1988—)，男，江蘇省揚(yáng)中市人，江蘇吉貝爾藥業(yè)股份有限公司工程師，碩士，主要研究方向?yàn)樾滤幹苿┘百|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。