馬錢子堿微囊制備工藝的研究

張少孩　　王鴻　　尚小廣

[摘要] 目的 制備馬錢子堿微囊，考察其影響因素，找出最優(yōu)方案。 方法 以殼聚糖和明膠為囊材，馬錢子堿為囊心物，采用復凝聚法制備載藥微囊。通過正交設計試驗，以包封率、粒徑為指標，確定最佳囊材比、囊心與囊材比及CaCl2的濃度，確定最優(yōu)配方。觀察其形態(tài)，測定其包封率、粒徑、載藥量、Zeta電位等。 結果 通過正交實驗，制備馬錢子堿微囊的最優(yōu)配方：殼聚糖濃度為5 mg/mL，明膠濃度為4 mg/mL，CaCl2濃度為2%，囊心與囊材比為1∶3。3次平行制備所得的載藥微囊的各參數(shù)的平均值：包封率為28.73%，粒徑為2.15 μm，載藥量為10.6%，Zeta電位為12.61 mV。微囊分散性好，表面平滑完整，囊壁清晰，無粘連。 結論 以殼聚糖和明膠為原料的復凝聚法制備馬錢子堿微囊具有較高的包封率，且穩(wěn)定性好，制備工藝簡單。

[關鍵詞] 馬錢子堿；微囊；殼聚糖；明膠

[中圖分類號] R917.4 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）27-0042-04

Study on the preparation technology of brucine microcapsules

ZHANG Shaohai1 WANG Hong2 SHANG Xiaoguang2

1.Department of Pharmacology， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China； 2.Hangzhou Medical College， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To prepare brucine microcapsules， investigate the influencing factors and find out the optimal scheme. Methods Chitosan and gelatin were used as the capsule materials，and brucine was taken as the core materials.Drug-loaded microcapsules were prepared by complex coagulation method. Through orthogonal design test， with the encapsulation efficiency and particle size as an indicator， the best ratio of capsule materials， ratio of core to materials and the concentration of CaCl2 were determined， and the optimal formula was determined. Its shape was observed， and the encapsulation efficiency， particle size， drug loading capacity and zeta potential were measured. Results Through orthogonal design test，the optimum formula for preparing brucine microcapsules was as follows： The concentration of chitosan was 5 mg/mL， gelatin concentration 4 mg/mL， CaCl2 concentration 2%， and the ratio of capsule core to capsule materials was 1∶3. The average values of the parameters of the drug-loaded microcapsules prepared in three parallel preparations： The encapsulation efficiency was 28.73%， particle size 2.15 μm， the drug loading capacity 10.6% and Zeta potential 12.61 mV. Microcapsules were with good dispersion， smooth and complete surface， clear wall， and no adhesion. Conclusion The preparation of brucine microcapsules with chitosan and gelatin as raw materials has a high encapsulation efficiency， and the stability is good and the preparation process is simple.

[Key words] Brucine； Microcapsules； Chitosan； Gelatin

馬錢子堿（brucine，C23H26N2O4·4H2O）為白色結晶性粉末，在水中微溶，味極苦，屬劇毒品，是馬錢科植物馬錢子（Strychnosnuxvomical L1或云南馬錢StrychnosPierriannas A.W.Hi11）種子的主要生物堿之一[1]。2010 版《中國藥典》載其味苦，微溫，有劇毒，歸肝、脾經。有通絡止痛、消腫散結之功?？捎糜诘驌p傷，骨折腫痛，風濕頑痹，麻痹癱瘓，癰疽瘡毒，喉嚨腫痛[2]。近年來馬錢子用于冶療多種疑難雜癥均取得奇特療效，外用冶療癌痛效果更佳。有文獻報道，不同粒度的馬錢子粉末中生物堿的體外釋放速度很快，10 min的累計釋放率達到50%～80%，在80 min時基本釋放完全[3]。馬錢子堿具有中樞毒性，因此這樣的釋放速度采用常規(guī)方法如口服、注射等給藥往往風險較大，容易引起中毒，且藥效較短。希望通過適當?shù)闹苿┦侄?，延緩馬錢子堿的釋放速度，同時降低藥物的毒性，達到安全用藥的目的。endprint

微囊化是利用高分子原料將固體或液體藥物包封起來而形成直徑1～250 μm的微型膠囊[4]。微囊具有保護物質免受環(huán)境條件的影響、掩蔽藥物的刺激性、提高藥效，減少副作用、增加藥物穩(wěn)定性、延長藥物及靶向釋放等功能[5，6]。經過微囊化后的藥物又可以制備成各種劑型，如注射劑、散劑、植入劑、膠囊劑、顆粒劑等，方便臨床用藥[7，8]。本實驗將馬錢子堿包封在微囊中，使其給藥部位能夠穩(wěn)定持續(xù)的釋放所包裹的藥物，維持恒定的血藥濃度[9]，達到連續(xù)控制癌癥疼痛的效果，以減少藥物的副作用，提高療效和患者生活質量。雖然已有有關馬錢子堿微囊的研究報道[1，3，10]，但是采用復凝聚法[11，12]制備的報道很少，為了進一步研究馬錢子堿制劑，本實驗擬采用殼聚糖和明膠為囊材[11-15]，以馬錢子堿為囊心物，復凝聚法制備馬錢子堿微囊，以包封率、粒徑為指標，確定最優(yōu)制備配方。并對制備所得的微囊進行相應的質量評價和體外釋放實驗，以確保其質量符合要求。

1 材料與儀器

1.1 材料

馬錢子堿（南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司，含量≥98%）；明膠（上海試劑總廠，批號為20031006）；殼聚糖（上海伯奧生物科技有限公司，批號為080116）。其他化學試劑全部為分析純或化學純。

1.2 儀器

AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；SK8200HP超聲波洗濯器（上?？茖С晝x器有限公司）；IKARC-MAG HS4磁力攪拌器；FA25高速乳勻機（上海弗魯克液體機器有限公司）；E200MV生物顯微鏡（南京尼康江南光學儀器有限公司）；TDL-40C低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；DKB-501A超級恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；ZEN3690激光微粒測定儀（馬爾文儀器）；激光粒度分析儀（上海精密科學儀器有限公司）；TU-1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）。

2 方法和結果

2.1 馬錢子堿的標準曲線的測定

2.1.1 馬錢子堿測定波長的選擇 精密稱取27.5 mg馬錢子堿，置于50 mL容量瓶，用蒸餾水稀釋至刻度，再精密移取2 mL稀釋25倍成0.022 mg/mL的溶液；以蒸餾水為空白，在190～400 nm波長范疇內進行光譜掃描，曲線見圖1，從圖中可看出，馬錢子堿在270 nm有吸收，200 nm附近有末端吸收，因此選擇270 nm作為馬錢子堿的檢測波長。并將所用的輔料進行以10倍的濃度在190～400 nm波長范疇內進行光譜掃描，結果顯示輔料對藥物的吸收沒有影響。

2.1.2 線性范圍及標準曲線的制作 精密稱取12.5 mg馬錢子堿原料藥，置于100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，作為儲備液。取適量儲備液用0.45 μm的微孔濾膜進行過濾，精密移取續(xù)濾液 1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL和6 mL，置于25 mL的容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。采取紫外分光光度計在270 nm波長處測量吸光度，經線性擬合得標準曲線方程為A=0.0302C-0.0005（R2=0.999）。線性范圍為0～30 μg/mL，結果見圖2。

2.1.3 精密度測定 取上述濃度為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL的標準溶液，分別加入最大處方量的輔料，1 d內連續(xù)測定5次，計算日內精密度，每日測定1次，連續(xù)測定5 d，計算日間精密度。結果顯示日內精密度RSD為0.56%、0.35%、0.31%（n=5），日間精密度RSD為0.68%，0.74%，0.56%（n=5），所有的RSD均在1%以內，符合要求。

2.1.4 回收率實驗 測定2.1.3項下的三個濃度溶液的吸光度值，并進行回收率和RSD值的計算，結果顯示平均回收率分別為（99.75±0.52）%，（98.97±0.78）%，（99.56±0.45）%，RSD均小于1%（n=3），符合要求。

2.1.5 穩(wěn)定性實驗 取上述濃度為10 μg/mL的標準溶液，加入最大處方量的輔料，分別于1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h在270 nm測定吸光度，結果顯示溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

2.2 微囊的制備及其優(yōu)化[16-17]

2.2.1 微囊制備條件的選擇及優(yōu)化 稱取適量明膠，用蒸餾水浸泡適宜時間，攪拌溶解完全后，加適量液體石蠟及司盤80，用高速乳勻機制成W/O型乳液；另稱取對應比例的殼聚糖浸泡超聲溶于2%醋酸溶液，加CaCl2及藥物，制得含藥殼聚糖溶液，調節(jié)磁力攪拌器溫度為30℃，攪拌下將其滴加到W/O型乳液中，用NaOH調節(jié)pH 4.5，繼續(xù)攪拌90 min，冰浴冷卻至10℃，加適量戊二醛，攪拌120 min。加正丁醇適量，搖勻后靜置30 min，溶液離心5000 rpm 15 min，沉淀用蒸餾水洗滌至無醛味，干燥，即得微囊。

通過查閱相關文獻和預實驗，選取對微囊形成及包封率影響較為明顯的3個因素：殼聚糖與明膠的質量比（A）、CaCl2的濃度（B）以及囊心與囊材的質量比（C），每個因素有3個水平進行試驗（表1），以包封率為主要評價指標，同時以微囊粒徑為參考指標，選用L9（34）正交表進行試驗，篩選出最優(yōu)制備處方。正交試驗結果見表2。

2.2.2 微囊包封率的測定[18] 將各處方制備的微囊混懸液5000 rpm離心15 min后的上清液，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1～3 mL置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，于270 nm波長處測量其吸光度值，以蒸餾水為空白。將測定的數(shù)值代入標準曲線，獲得上清液的濃度，并根據下面公式計算包封率，結果見表3。

2.2.3 微囊載藥量的測定[19] 精密稱取25 mg干燥微囊，研缽中研磨粉碎，加入蒸餾水約15 mL，超聲使微囊中的藥物溶解完全后，轉移至25 mL容量瓶中，定容，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液于270 nm測吸光度，用標準曲線計算濃度，按照下式計算載藥量。見表2。endprint

載藥量（%）=微囊中的藥物重量/微囊重量×100%

2.2.4 微囊粒徑的測定 將制備所得到的微囊稀釋到一定濃度后，用激光粒度分析儀和ZEN3690激光微粒測定儀（馬爾文儀器）分別測定粒徑與Zeta電位。處方篩選的微囊的粒徑和Zeta電位結果見表2。

2.2.5 處方篩選及制備工藝優(yōu)化結果[5-6，16-17，20-21] 正交試驗結果級極差分析見表3，其中綜合評分=包封率×0.6+D50×0.4。微囊實驗的方差分析見表4。

從以上結果可以看出，3個因素的影響程度為B>A>C，即氯化鈣的濃度>殼聚糖與明膠的質量比>囊心與囊材的質量比。最佳水平組合為A1B2C2，即制備馬錢子堿微囊的最優(yōu)配方：殼聚糖濃度為5 mg/mL，明膠濃度為4 mg/mL，CaCl2濃度為2%，囊心與囊材比為1∶3。

2.3 驗證實驗

按照所獲得的最佳處方進行A1B2C2重復性試驗，制得3個批次的馬錢子堿微囊，測得其包封率分別為28.63%，28.74%，28.82%，均值為28.73%；載藥量為10.35%，10.15%，11.31%，均值為10.6%；SMD為2.46 μm，2.75 μm，2.36 μm，平均SMD為2.52 μm；Zeta電位為12.37 mV，13.41 mV，12.04 mV，平均值為12.61 mV。

將所制得的馬錢子堿微囊在10×10倍的生物顯微鏡下觀察其形態(tài)，并拍下圖像。再在40×10倍狀態(tài)下觀察并拍下圖像，見封三圖5和封三圖6，微囊分散性好，表面平滑完整，囊壁清晰，無粘連。

3 討論

馬錢子堿作為馬錢子生物堿中的主要成分之一，具有鎮(zhèn)痛、抗炎作用，對整個中樞神經系統(tǒng)有選擇性興奮作用。馬錢子堿占馬錢子總生物堿質量的30%～40%，屬于有毒成分，使用不當容易產生中毒甚至危及生命。如要使其發(fā)揮療效，需要通過一定的制劑手段，控制體內藥物量及釋放速度，達到安全用藥的目的。微囊作為一種制劑手段，采用合適的高分子材料和制備方法將藥物包裹，通過選擇的囊材的緩釋作用，使藥物在體內釋放減慢，延長藥效，避免了毒性反應的發(fā)生。

復凝聚法是常見的微囊制備方法，利用兩種相反電荷的高分子原料作為復合囊材，在一定前提下交聯(lián)，使囊材的溶解度降低而自溶液中析出，包裹囊心物成囊。本實驗中采用的殼聚糖[12-13]和明膠兩種囊材均為是天然化合物，無毒，有良好的生物相容性和可生物降解性，是比較常用的藥用高分子材料，易得價廉。殼聚糖為聚陽離子型多糖，明膠為兩性化合物，溶液中的pH大于等電點時使其帶負電荷，因此實驗中要注意調節(jié)pH，使明膠始終帶負電荷。本實驗通過正交實驗法確定了微囊制備的最佳工藝并進行了驗證。通過驗證，采用最佳工藝制備的微囊粒徑較小，流動性好，包封率和載藥量較好，重復性好。

通過實驗發(fā)現(xiàn)除了實驗所考察的三個主要因素外，其他因素也會對微囊的制備產生一定的影響，如戊二醛、正丁醇、明膠的乳化程度等。實驗過程中，戊二醛起到交聯(lián)固化的作用，但是要嚴格控制加入的量，過多會使微囊粘連緊密，難以分離；加入量過少，固化不完全，不易形成微囊。必須要根據藥物、囊材以及實驗條件進行選擇，以獲取最合適的固化劑的用量，以確保獲得流動性好的微囊。通過摸索，在本實驗條件下戊二醛最適合的量為1 mL左右。

同時在實驗中發(fā)現(xiàn)，在固化完全后，不加入正丁醇，微囊不能形成沉淀物，難以離心分離；加入正丁醇混勻后，可見底部有沉淀，由此可見正丁醇可以使微囊分離，起到促進固化的作用，進一步減少微囊間的相互粘連。

在明膠制備W/O型乳液時，應充分乳化，使明膠在液體石蠟中充分分散形成液滴，以便于在后面的成囊過程中能夠充分與殼聚糖結合形成微囊，否則難以形成微囊，只是液滴。為了保證乳化完全，明膠必須充分溶解，液體石蠟時分數(shù)次加入，確保乳化完全。

本實驗采用了藥劑學中經常采用的正交實驗法對處方篩選和制備方法的確定進行了優(yōu)選，具有一定的精密度，但是對各因素之間的交互作用不能較好的考察，這需要進一步改進。實驗制備得到的馬錢子堿微囊的體外釋放度及體內的溶出特性是否能達到預期的要求，還有待于進一步的研究。

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（收稿日期：2017-07-31）endprint