BMP-2在骨折三期愈合表達影響實驗研究

●楊緒峰

BMP-2在骨折三期愈合表達影響實驗研究

●楊緒峰

目的：觀察BMP-2在骨折愈合三期治療過程中表達，探討其對骨折愈合的影響。方法：家兔建立骨折模型(n=105)，將105只家兔隨機分為三期治療組、一期治療組和對照組，每組35只。每個小組再隨機分7個小組( n = 5/組)，分別為第3、6、9、14、28、42、56天組。并進行取材，組織學及免疫組化法檢測分析。結果：各組術后骨折端BMP-2表達陽性細胞平均光密度(MOD)值:三期組＞一期組＞模型組(P＜0.05)。結論：BMP-2能顯著促進骨折愈合。

骨折；骨形態(tài)發(fā)生蛋白；免疫組化；家兔

骨折為臨床的常見病，多發(fā)病。隨著現(xiàn)代運輸業(yè)及交通業(yè)的迅速發(fā)展，人們的出行及工作環(huán)境的變化，骨折病人呈現(xiàn)越來越多趨勢，其損傷程度也越來越來越復雜，并出現(xiàn)創(chuàng)傷年輕化，高致殘率的特點?；颊吖钦垡院?，多伴有肢體功能障礙，因各種原因發(fā)生的骨折延遲愈合和不愈合嚴重危害人們的生存質量，對患者及整個家庭帶來了嚴重的精神壓力和經濟壓力。由于骨折愈合的分子機制不是完全明了，因此，如何促進骨折愈合一直是學者們研究的熱點。骨折愈合的組織修復過程十分復雜，期間涉及許多蛋白信號因子，來調節(jié)細胞的增殖、分化及細胞外基質合成，其中對骨原細胞的分化起主要決定性作用的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)，是促進成骨的重要因子[1]，是唯一可獨自誘導成骨的重要信號蛋白因子，是研究骨折愈合機制的重點。本實驗建立兔骨折模型，將BMP-2作用于兔橈骨骨折斷端，探討B(tài)MP-2在骨折三期愈合中的影響及機理，為臨床應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 骨折模型建立

選取健康的雄性新西蘭大白兔105只（濟南西嶺角種兔養(yǎng)殖繁育中心提供，許可證號SCXK魯20100005），體重（2.5±0.5）kg。氯胺酮8 mg/ kg腹腔內注射麻醉，常規(guī)脫毛，參照 Farso Nielsen方法[2]選取右前肢中下段外側切口，無菌條件下縱行切開約1 cm，暴露橈骨，用牙科磨鉆（直徑0.5 mm）橫行斷開橈骨，止血、沖洗、縫合切口。實驗組兔在切口縫合前于骨折處注射BMP-2（北京中科物源生物科技有限公司），注射劑量1ug/kg；對照組兔于骨折處注射生理鹽水。術后兩組實驗動物均不作任何固定，術后肌肉注射青霉素80萬單位/次/，每天一次，連續(xù)三天。

1.2 分組

將選取的105只家兔隨機分三期治療組、一期治療組和對照組，每組35只。每個小組再隨機分7個小組( n=5/組)，分別為第 3、6、9、14、28、42、56 天組。

1.3 試劑

重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)，濃度1mg/m l（北京中科物源生物科技有限公司提供）。鼠抗兔BMP-2抗體（福州邁新生物技術開發(fā)有限公司）。4%多聚甲醛溶液（行知生物科技有限公司），EDTA溶液(自配，PH 7.3-7.5)， DAB顯色劑（上海亨代勞商貿有限公司），5%的正常山羊血清（上海睿鷹生物科技有限公司）。HOLOGIC雙能X線吸收儀（HOLOGIC公司，美國），Olympus BX43F型光學顯微鏡，Olympus DP70高分辨率相機。

1.4 分期

將家兔橈骨骨折愈合過程分為早期、中期、后期:早期即血腫機化演進期，骨折后 1-7d；中期即骨痂原始形成期，骨折后 8-28天；后期即骨痂改造通常塑形期，骨折28天以后。三期治療組配合早期加入活血化瘀藥物，中期加入接骨藥物，后期加入強筋壯骨藥物。一期治療組 把骨折三期合并為一期，BMP-2配合活血化瘀、強筋壯骨綜合治療。

1.5 觀察方法

術后分別于第3、6、9、14、28、42、56天觀察，每個實驗組隨機抽取1小組家兔。選取左側橈骨標本作為觀察對象，以骨折端為中心，切取橈骨段1.5cm，剔除軟組織，用4%的多聚甲醛在4℃下固定30m in。后放入200g/L的EDTA液中脫鈣，溫度50℃，每天1h，脫鈣結束后更換脫鈣液，于室溫下繼續(xù)脫鈣，2d后將骨組織完全脫鈣，脫鈣完成后將骨段縱行剖開，進行冰凍切片，厚度5μ m，行免疫組化染色，觀察在不同骨折愈合時間點外骨膜、內骨膜和骨髓組織BMP-2的表達情況。

1.6 結果判斷

顯微鏡下肉眼觀察BMP-2在兩組切片中表達情況，并進行比較。細胞核或胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒染色的，細胞核清晰，形狀規(guī)則，周圍輪廓界限分明為陽性細胞，未顯棕色為陰性。在兩斷端附近相同位置及骨折中心，應用顯微圖像采集系統(tǒng)，選取5個高倍視野(×400)，高分辨率相機拍照后，對免疫組化切片骨折斷端附近的外骨膜、內骨膜和骨髓組織，儲存入計算機，使用 Image- Pro- Plus IPP6.0醫(yī)學病理圖像分析系統(tǒng)軟件，對 BMP-2在骨表達陽性細胞進行光密度(MOD)測定。1.7統(tǒng)計學分析采用

SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以()表示，相同時間實驗組與對照組比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

不同時間點骨折愈合BMP-2表達結果，在骨折愈合不同時間點，骨外膜、骨內膜、骨髓腔的BMP-2免疫組化染色結果顯示，對照組及實驗組骨折端均有顯色，實驗組較對照組術后大部分時間 BMP-2表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義( P＜0.05)。骨折愈合不同時間點，各組標本BMP-2表達測定結果見表1、2、3。

表1 骨折合愈過程不同時間點各組標本骨外膜BMP-2表達(MOD，±s，n =5)

表1 骨折合愈過程不同時間點各組標本骨外膜BMP-2表達(MOD，±s，n =5)

注：表示與對照組比較P＜0.05，表示與對照組比較P＜0.01；表示與一期治療組比較P＜0.05，表示與一期治療組比較P＜0.01。

時間 對照組 一期治療組 三期治療期3d 0.0576±0.0068 0.0948±0.0506** 0.0677±0.0033 6d 0.0647±0.0038 0.0728±0.0027* 0.0752±0.0055△9d 0.0591±0.0074 0.0746±0.0065** 0.0759±0.0040*14d 0.0645±0.0044 0.0798±0.0101** 0.0769±0.0067*28d 0.0630±0.0047 0.0715±0.0027* 0.7044±0.0150 42d 0.0645±0.0057 0.0788±0.0087** 0.0811±0.0128**△56d 0.0665±0.0053 0.0724±0.0040* 0.0725±0.0039*均值 0.0628±0.0060 0.0778±0.0200** 0.0791±0.0136**

表2 骨折合愈過程不同時間點各組標本骨內膜BMP-2表達(MOD，±s，n =5)

表2 骨折合愈過程不同時間點各組標本骨內膜BMP-2表達(MOD，±s，n =5)

注：表示與對照組比較P＜0.05，表示與對照組比較P＜0.01；表示與一期治療組比較P＜0.05，表示與一期治療組比較P＜0.01。

時間 對照組 一期治療組 三期治療期3d 0.1035±0.0171 0.1440±0.0190** 0.1528±0.0102**6d 0.1417±0.0042 0.1546±0.0163 0.1517±0.0118 9d 0.1585±0.0056 0.1485±0.0236 0.1669±0.0187△14d 0.1360±0.0172 0.1680±0.0149** 0.1838±0.0341*△28d 0.1512±0.0212 0.1564±0.0191 0.2008±0.0630**△△42d 0.1673±0.0055 0.1855±0.0145* 0.2110±0.0811**△△56d 0.1547±0.0168 0.1779±0.0122* 0.1704±0.0262*△均值 0.1447±0.0236 0.1621±0.0216* 0.1768±0.0452**△△

表3 骨折愈合過程不同時間點各組標本骨髓腔BMP-2表達(MOD，±s，n =5)

表3 骨折愈合過程不同時間點各組標本骨髓腔BMP-2表達(MOD，±s，n =5)

注：表示與對照組比較P＜0.05，表示與對照組比較P＜0.01；表示與一期治療組比較P＜0.05，表示與一期治療組比較P＜0.01。

時間 對照組 一期治療組 三期治療期3d 0.0258±0.0026 0.0261±0.0041 0.0365±0.0047*6d 0.0272±0.0045 0.0303±0.0047* 0.0348±0.0051*△9d 0.0262±0.0024 0.0396±0.0042* 0.0433±0.0060**△14d 0.0230±0.0035 0.0329±0.0052** 0.0372±0.0053*△28d 0.0293±0.0038 0.0350±0.0019* 0.0438±0.0051**△△42d 0.0307±0.0054 0.0389±0.0035 0.0485±0.0064**△△56d 0.0312±0.0065 0.0282±0.0030 0.0344±0.0037均值 0.0276±0.0049 0.0328±0.0063* 0.0398±0.0070*△

3 討論

骨折的愈合是個復雜的動態(tài)過程，自 Urist[3]提出誘導成骨理論以后，學者們漸漸認識到 下列骨生長因子與骨折愈合關系較密切，如TGF-β1、BMP-2、bFGF、VEGF等。研究還發(fā)現(xiàn)，BMP-2對促進骨生成具有極其重要的作用，能夠誘導不同種類未分化間充質干細胞增值和分化為成骨細胞，從而促進成骨和骨折的愈合。骨折愈合在早期的病理變化主要是[4-5]，骨折部位血腫的形成及浸潤炎性細胞，骨折部位血腫大小會影響到軟組織內新生血管的形成及機化完成所需的時間。在骨折早期給以BMP-2干涉，大大改善了骨折部位血液供給狀況，加快了損傷的組織修復和局部水腫吸收，從而使骨折加速愈合。在兔骨折愈合過程中期[6]，BMP-2促進了軟骨鈣化，加快了軟骨消散，促使軟骨形成期得到提前，通過加快增殖和分化成骨細胞[7]，從而促進了骨痂生長以及外骨痂的橋接過程。到骨折后期，BMP-2提高了破骨細胞的活性與數(shù)量，促進髓腔的提前再通和板層骨的提早形成。新生的連續(xù)骨皮質形成以及再通的髓腔，可作為骨折愈合的組織學標準[8]。目前學者們研究BMP-2促進骨折愈合多階段的動物實驗較少，且往往都是試驗組與空白對照組之間比較，這樣只能說明BMP-2對骨折愈合有促進作用，但不能充分說明骨折三期 BMP-2對骨折愈合的影響。本實驗表明在促進骨折局部BMP-2表達方面，無論是BMP-2表達總體平均水平、峰值持續(xù)時間，三期試驗組明顯強于對照組。

骨組織的愈合過程是骨折或者骨質缺損的修復，骨質的完全修復需要局部生長因子的調控。局部骨折的整個修復過程受骨生長因子的調控，其決定著骨折修復的質量和速度[9-10]。在骨誘導分化因子中，BMP-2被公認為是目前最強，其能誘導血管細胞或成軟骨細胞，決定著間充質細胞的分化方向，誘導間充質細胞不可逆地向軟骨細胞和成骨細胞方向分化，促進成骨細胞分化和刺激膠原合成，促使新骨生成。從實驗結論來看，BMP-2表達出現(xiàn)在骨折愈合早期，外骨膜BMP-2表達第3天較低，第六天逐漸升高。骨折中期為骨痂形成初期，無論骨外膜、骨內膜、還是骨髓腔，BMP-2表達實驗組均高于對照組，可能間充質細胞發(fā)生化學趨向、聚集，進而形成骨和軟骨的過程。骨折后期，骨外膜、骨內膜及骨髓腔的BMP-2表達實驗組均優(yōu)于對照組。綜上所述，在骨折三期愈合過程中，實驗組（三期治療組、一期治療組）優(yōu)于對照組，可能是BMP-2在各階段促進了血管形成及骨的誘導分化，從而促進了骨折愈合。

（作者單位：新泰市人民醫(yī)院）

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Experimental study of the BMP-2 expression on fracture healing by the three stage treatment

(Yang xu-feng，The people’s hospital of Xin Tai 271200)

Objective: To observe the three period treatment theory of bone fracture on the BMP-2 expression of rabbits in the issues of fracture healing，and to explore the effects of that method． Methods: Rabbits( n = 105) were make bone fracture models．Rabbits were random ly divided into three groups，including three-phase treatment group ( TTG ) ( n = 35 ) ，one-phase treatment group ( OTG) ( n = 35) ，and model control group( MCG) ( n = 35) ． Every group was random ly divided into seven groups.They have 3,6,9,14,28,42and56 day point( n = 5 ) ，The left radiuses were taken out as the research object． Immunohistochemistry stain was performed to examinate the BMP-2 expression in the fracture bone． Results: Group mean MOD ( mean optical density) in positive cell of the BMP-2 expression in every group at deferent time points and those of more time points after operation: TTG＞OTG＞MCG (P＜0.05) ． Conclusion: BMP-2 can promote fracture healing．

fracture；BMP-2；Immunohistochemistry；rabbits

楊緒峰（1973～），男，主治醫(yī)師，碩士研究生，研究方向為骨外科臨床。