SUMO-1在ApoE-/-小鼠PM2.5暴露中調(diào)控血管HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的研究

甘向東， 李 飛， 蔡 欣， 付文亮， 徐東剛*， 龍民慧

(1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850； 2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院， 天津 300457)

SUMO-1在ApoE-/-小鼠PM2.5暴露中調(diào)控血管HIF-1α/VEGF信號(hào)通路的研究

甘向東1,2， 李 飛1， 蔡 欣1， 付文亮1， 徐東剛1*， 龍民慧2*

(1. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所， 北京 100850； 2. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院， 天津 300457)

以氣管滴注方法研究了ApoE-/-小鼠經(jīng)PM2.5暴露后，其主動(dòng)脈弓中SUMO-1、HIF-1α、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)變化規(guī)律及HIF-1α的SUMO化修飾情況. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： PM2.5暴露后，小鼠主動(dòng)脈SUMO-1、HIF-1α、VEGF的表達(dá)上調(diào)；PM2.5暴露誘導(dǎo)了SUMO-1對(duì)HIF-1α的SUMO化修飾； 低氧條件下SUMO-1敲低導(dǎo)致HIF-1α表達(dá)的下調(diào). 結(jié)果提示PM2.5暴露通過(guò)上調(diào)細(xì)胞中SUMO-1的表達(dá)，穩(wěn)定或者上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，進(jìn)而影響血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)，造成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定.

PM2.5暴露; SUMO-1; 缺氧誘導(dǎo)因子-1α; 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

Keywords： PM2.5exposure; SUMO-1; HIF-1 alpha; Vascular endothelial growth factor (VEGF)

細(xì)顆粒物(PM2.5)濃度急劇升高能夠引起動(dòng)脈粥樣硬化(AS)斑塊不穩(wěn)定，并增加缺血性心血管疾病等冠脈綜合癥發(fā)病率[1]. 血管的修復(fù)和新生是導(dǎo)致斑塊穩(wěn)定性減弱的主要因素[2]. 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)能夠與相應(yīng)受體結(jié)合促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和血管通透性增加來(lái)參與血管的修復(fù)和新生[3]，提示VEGF可能對(duì)AS斑塊穩(wěn)定起了重要的作用. 但PM2.5暴露通過(guò)何種途徑影響VEGF 表達(dá)并導(dǎo)致AS斑塊穩(wěn)定性變差的機(jī)制尚未明確. 有研究證實(shí)PM2.5進(jìn)入人體到肺泡后，直接影響肺的通氣功能，使機(jī)體處在缺氧狀態(tài)[4]. 機(jī)體缺氧狀態(tài)的應(yīng)激反應(yīng)之一就是低氧誘導(dǎo)因子HIF的應(yīng)答反應(yīng)和在細(xì)胞中積聚[5]. HIF-1是異二聚體的轉(zhuǎn)錄因子，由氧敏感的α亞基(HIF-1α)和在核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的β亞基(HIF-1β)組成. HIF-1α是功能性亞基，調(diào)控VEGF等多種基因的表達(dá)，與血管的修復(fù)和動(dòng)脈斑塊的穩(wěn)定性有重要的聯(lián)系[6]. 因此，HIF-1的穩(wěn)定性可能是影響斑塊穩(wěn)定性的重要因子. 影響HIF-1穩(wěn)定性對(duì)血管重構(gòu)和新生引發(fā)的AS斑塊形成有著重要的意義. 最近幾年發(fā)現(xiàn)的泛素樣蛋白家族成員小泛素蛋白樣修飾蛋白-1(SUMO-1)能與HIF-1α共價(jià)結(jié)合，并對(duì)其進(jìn)行翻譯后修飾作用，該過(guò)程稱為小泛素相關(guān)修飾(Small Ubiquitin-related Modifier，SUMO)[7]. SUMO化是一個(gè)可逆的動(dòng)態(tài)過(guò)程，可被特異性蛋白酶SENP-1將其從底物上去除，此過(guò)程稱為去SUMO化[8]. 可逆的SUMO化修飾能在低氧下調(diào)節(jié)HIF-1α的穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄活性[9]. 本文旨在研究SUMO在PM2.5暴露引發(fā)低氧應(yīng)激過(guò)程中對(duì)HIF-1α和VEGF表達(dá)的影響，探究PM2.5暴露引起AS斑塊不穩(wěn)定導(dǎo)致缺血性心血管疾病發(fā)生的可能機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：ApoE-/-小鼠24只，體質(zhì)量20～22 g，雄性，10周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供. 實(shí)驗(yàn)儀器：顆粒物采樣器(Thermo Anderson G- 215，美國(guó)熱電子公司)；玻璃纖維濾膜(Whatman? 41 filters ，Whatman Inc, Maidstone，UK)；mini-VIDAS-IDAS全自動(dòng)免疫熒光酶標(biāo)儀(法國(guó)生物梅里埃公司)；DU640型分光光度計(jì)(美國(guó)Beckman公司)；PAC200型電轉(zhuǎn)印儀與電轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)BIO-RAD公司)；600PJ型電泳儀與垂直電泳槽(天能公司)；PE2400型PCR擴(kuò)增儀(PerkinElmer公司)；Mx3000P qPCR Systems(美國(guó)安捷倫公司). 實(shí)驗(yàn)試劑：Lowry法蛋白含量檢測(cè)試劑盒(中國(guó)凱基生物技術(shù)公司)；RIPA裂解緩沖液(Applygen Technologies Inc.China)；PrimerScript Reverse Transcriptase(TaKaRa Biotechnology Co,Ltd.Jan)；GAPDH(中國(guó)康為世紀(jì)生物公司)；實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系：Ecv304細(xì)胞. 胎牛血清(Gibco公司)，DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；所用抗體：SUMO-1(abcam,Y299)，HIF-1α(abcam,ab16066)，VEGF(abcam,ab46154)；轉(zhuǎn)染SUMO-1的siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司).

1.2 方法

1.2.1 PM2.5采樣及處理 PM2.5采樣于2013月12月1號(hào)起，采用ThermoAnderson G- 215采樣器在北京三環(huán)某采樣點(diǎn)連續(xù)2周采集PM2.5，將載有顆粒物的濾膜剪裁成2 cm2大小，浸入去離子蒸餾水中，超聲清洗機(jī)中對(duì)PM2.5進(jìn)行洗脫，功率700 W，震蕩30 min，震蕩液6層紗布過(guò)濾，濾液冷凍真空干燥，低溫冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組和染毒 ApoE-/-小鼠在恒溫、恒濕二級(jí)動(dòng)物房高脂(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%膽固醇和10%脂肪)飼養(yǎng)18周后，將小鼠隨機(jī)分成3組，PM2.5組、生理鹽水組、空白對(duì)照組，每組8只. PM2.5染毒劑量為8 mg/kg, 染毒方法為氣管滴注，每4 h一次，共3次. 染毒過(guò)程沒(méi)有出現(xiàn)動(dòng)物死亡情況，最后一次染毒24 h后，每組采集7只小鼠血液，并分離得血清；頸部脫臼處死小鼠，取小鼠主動(dòng)脈，凍存于液氮罐中.

1.2.3 PM2.5暴露對(duì)心肌損傷指標(biāo)肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase Isoenzyme,CK-MB)、肌鈣蛋白(Troponin，CTn-I)的影響 血清中肌鈣蛋白CTn-I、肌酸激酶CK及肌酸激酶同工酶CK-MB采用mini-VIDAS-IDAS全自動(dòng)免疫熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè).

1.2.4 qPCR檢測(cè)PM2.5暴露對(duì)血管SUMO-1、HIF-1α、VEGF轉(zhuǎn)錄的影響 RNApure超純總RNA快速提取試劑盒按說(shuō)明書操作，小鼠主動(dòng)脈標(biāo)本每組取3只，分別提取總RNA，總RNA按1 μg 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄. 轉(zhuǎn)錄后的cDNA 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)，使用帶熒光的MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×) 在Mx3000P QPCR Systems上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)體系50 μL. 分別檢測(cè)SUMO-1、HIF-1α、VEGF在不同處理組的小鼠血管中表達(dá)水平，所需引物序列見(jiàn)表1.

表1 小鼠主動(dòng)脈qPCR所需引物序列Table 1 Primer sequenles for qPCR in aortic of mice

1.2.5 Western-blot檢測(cè)PM2.5暴露對(duì)血管SUMO-1、HIF-1α、VEGF表達(dá)的影響 小鼠主動(dòng)脈標(biāo)本加RIPA裂解緩沖液在冰浴條件下勻漿，提取組織總蛋白，并用Lowry法蛋白含量檢測(cè)試劑盒定量細(xì)胞總蛋白. 總蛋白經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)12% SDS-PAGE凝膠電泳分離，通過(guò)蛋白印跡法轉(zhuǎn)移到孔徑為0.2 μm的PVDF膜上. 將PVDF膜在質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% 脫脂奶粉液(溶劑為含體積分?jǐn)?shù)1‰ Tween20的Tris緩沖液，TBS-T)配制成的室溫中封閉非特異結(jié)合位點(diǎn)1～2 h. 然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% 脫脂奶粉配制的特異性抗體(一抗)SUMO-1、HIF-1α、VEGF，稀釋度均為(1∶1 000)，4 ℃過(guò)夜孵育PVDF膜，過(guò)夜后用TBS-T洗去未結(jié)合的抗體，洗3次，每次10 min，再用帶有辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)簽的羊抗鼠和羊抗兔的二抗繼續(xù)室溫孵育PVDF膜1 h，接著用TBS-T洗去未結(jié)合的二抗，洗3次，每次10 min. 最后用Super Signal West Femto Substrate 處理，暗室中顯影. 以GAPDH作為內(nèi)參.

1.2.6 免疫共沉淀(CO-IP) 取小鼠主動(dòng)脈標(biāo)本加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑，冰上研磨后放置30 min，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，收集上清；取1.5 mL離心管，每管加入30 μL ProteinA/G-agarose，加入200 μL RIPA裂解液洗珠子，3 000 r/min、4 ℃離心2 min，用RIPA裂解液洗2次后將上述組織上清液加入到ProteinA/G-agarose管中，4 ℃漩渦混合器上孵育1 h；將該混合物3 000 r/min、4 ℃離心2 min后取上清，各管加入HIF-1α抗體標(biāo)簽1 μg，4 ℃漩渦混合器上孵育4 h，各上清管加入ProteinA/G-agarose 50 μL，4 ℃漩渦混合器上孵育過(guò)夜，3 000 r/min、4 ℃離心5 min，小心棄去上清液，加入500 μL的RIPA裂解液重懸ProteinA/G-agarose沉淀，上述步驟重復(fù)5次后，徹底吸干裂解液后各樣品加入30 μL 2×SDS上樣緩沖液，混勻后100 ℃煮10 min，吸取上清，Western-blot檢測(cè)SUMO-1的表達(dá)情況.

1.2.7 qPCR檢測(cè)低氧對(duì)SUMO-1、HIF-1α轉(zhuǎn)錄的影響 ECV304細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于6孔培養(yǎng)板，37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄上清，每孔均加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入CoCl2，使其終濃度為300 mmol/L. 培養(yǎng)24 h后，提取總RNA，qPCR檢測(cè)所需引物序列見(jiàn)表2.

表2 ECV304細(xì)胞qPCR所需引物序列Table 2 Primer sequences for qPCR in ECV304 cell

1.2.8 低氧培養(yǎng)ECV304細(xì)胞，利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA敲低SUMO-1基因 將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成對(duì)照組和敲低SUMO-1組，按照2.5×105個(gè)/孔、體積2 mL接種ECV304細(xì)胞于6孔板，并放置于低氧培養(yǎng)箱中12 h后轉(zhuǎn)染，待細(xì)胞融合度達(dá)80%以上后，使用Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后用于mRNA水平和蛋白水平檢測(cè). 用于轉(zhuǎn)染的 siRNA序列分別為：

SUMO-1 siRNA：5′-AACTACATCTTCGTGTACCTC-3′；

NCsiRNA：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用均值±方差表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件有SPSS13.0、MxPro3000-qPCR分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析. 有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義的用*P<0.05和**P<0.01表示. 計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的進(jìn)行t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)檢驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 PM2.5暴露對(duì)血清CK、CK-MB及CTn-I的影響

與空白對(duì)照組、生理鹽水組相比，PM2.5暴露后的ApoE-/-小鼠血清中CK、CK-MB及CTn-I含量顯著性提高(P<0.01)，而生理鹽水組小鼠血清中CK、CK-MB及CTn-I含量與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05). 結(jié)果說(shuō)明PM2.5暴露影響心肌酶譜的變化，缺血反應(yīng)發(fā)生，心肌出現(xiàn)損傷(表3).

表3 PM2.5暴露對(duì)ApoE-/-小鼠血清CK、CK-MB及CTn-I的影響Table 3 Effects of PM2.5 on CK、CK-MB and CTn-I in serum after ApoE-/- mice exposed to PM2.5

注：**表示與空白組相比有顯著性差異(P<0.01).

2.2 PM2.5暴露對(duì)SUMO-1、HIF-1、VEGF基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

如圖1A所示，ApoE-/-小鼠經(jīng)PM2.5暴露后主動(dòng)脈血管SUMO-1、HIF-1α、VEGF轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，生理鹽水處理組小鼠與空白組相比無(wú)明顯變化. 在蛋白水平上進(jìn)一步研究證實(shí)：PM2.5暴露后小鼠血管中SUMO-1、HIF-1α、VEGF的表達(dá)水平與其基因轉(zhuǎn)錄水平有相似結(jié)果(圖1B). 說(shuō)明PM2.5能夠上調(diào)主動(dòng)脈SUMO-1、HIF-1α、VEGF等蛋白的表達(dá).

圖1 PM2.5暴露對(duì)SUMO-1、HIF-1α、VEGF基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

Figure 1 Effects of PM2.5 exposure on transcription and protein expression ofSUMO-1,HIF-1α andVEGF注：**表示與對(duì)照組相比有顯著性差異，下圖同.

2.3 PM2.5暴露對(duì)HIF-1α的SUMO化修飾的影響

ApoE-/-小鼠經(jīng)PM2.5暴露3次后，每組取2只小鼠主動(dòng)脈進(jìn)行研磨，免疫共沉淀結(jié)果顯示，生理鹽水組SUMO-1沒(méi)有對(duì)HIF-1α發(fā)生SUMO化修飾，PM2.5暴露后SUMO-1對(duì)HIF-1α產(chǎn)生了明顯的SUMO化修飾(圖2). 本實(shí)驗(yàn)中以生理鹽水組作為PM2.5組的對(duì)照,故沒(méi)有設(shè)置空白對(duì)照組，每種處理2個(gè)重復(fù).

圖2 PM2.5暴露后HIF-1α的SUMO化修飾情況

Figure 2 SUMO modification of HIF-1 alpha after exposure to PM2.5

2.4 低氧處理ECV304細(xì)胞后對(duì)SUMO-1、HIF-1α轉(zhuǎn)錄的影響及敲低SUMO-1對(duì)HIF-1α表達(dá)的影響

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ECV304細(xì)胞，經(jīng)正常培養(yǎng)和低氧培養(yǎng)24 h后qPCR結(jié)果可見(jiàn)：低氧上調(diào)了ECV304細(xì)胞中SUMO-1、HIF-1α基因的表達(dá)(圖3A)；在低氧培養(yǎng)條件下，敲低SUMO-1蛋白表達(dá)后，HIF-1α的表達(dá)也受到了抑制(圖3B)，這些結(jié)果說(shuō)明HIF-1α的表達(dá)受SUMO-1基因的調(diào)控.

圖3 低氧培養(yǎng)情況下SUMO-1敲低對(duì)ECV304細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的影響

Figure 3 Effects SUMO-1 knockdown on the expression of HIF-1αin ECV304 cells under hypoxia

3 討論

由于PM2.5暴露直接作用于肺部，引起氣道反應(yīng)，造成呼吸功能減弱，導(dǎo)致機(jī)體缺氧發(fā)生. 缺氧與許多生理和病理過(guò)程密切相關(guān)[10]. 細(xì)胞對(duì)低氧應(yīng)激的直接反應(yīng)之一是在細(xì)胞內(nèi)積聚轉(zhuǎn)錄因子HIF-1, 在細(xì)胞對(duì)環(huán)境條件的應(yīng)答調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[11]. HIF-1參與細(xì)胞內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程, 包括血管生成、能量代謝以及細(xì)胞存活等. 而HIF-1需經(jīng)歷翻譯后的修飾, 如羥基化修飾、泛素化修飾、乙?；揎梺?lái)調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性[12]. 有研究表明SUMO-1介導(dǎo)了HIF-1α翻譯后的修飾[13]. 另外的研究則認(rèn)為 SUMO-1 對(duì) HIF-1α的翻譯后修飾起穩(wěn)定作用并上調(diào)其表達(dá)，增加 HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性[14]. HIF-1 穩(wěn)定性及轉(zhuǎn)錄活性增高，增強(qiáng)了 VEGF 的表達(dá)，影響血管新生和重構(gòu)[15]. 因此，本文推測(cè) PM2.5暴露引發(fā)肺部和呼吸道反應(yīng)，造成肺部低氧，進(jìn)而影響氣血循環(huán)，并通過(guò)上調(diào)HIF-1α表達(dá)和抑制其降解來(lái)調(diào)控 VEGF 表達(dá)和血管新生，最后導(dǎo)致 VP 形成，這可能是 PM2.5暴露引發(fā)急性冠脈綜合癥的原因之一.

本文利用 ApoE-/- 小鼠證實(shí)： PM2.5暴露引起血清中 CK、CK-MB、CTnI 水平顯著增高，確實(shí)引發(fā)了心肌損傷，并且損傷可能是由于心肌缺血所引起的. 不僅如此，文中還檢測(cè)到 PM2.5暴露后，小鼠血管中 HIF-1α、SUMO-1 轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平升高，說(shuō)明 PM2.5暴露引起了機(jī)體缺氧的發(fā)生，并且血管重構(gòu)相關(guān)的重要因子VEGF表達(dá)上調(diào)，提示 PM2.5暴露可能引發(fā)血管重構(gòu).

細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)低氧條件下 SUMO-1表達(dá)水平升高，同時(shí)也證實(shí)了HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平升高. SUMO-1被敲低后，HIF-1α的表達(dá)降低. 這一結(jié)果表明SUMO-1可能增強(qiáng)了HIF-1α的表達(dá). 綜上所述，PM2.5暴露引起 SUMO-1 表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)了 HIF-1α/VEGF 通路信號(hào)傳遞，最終導(dǎo)致斑塊的不穩(wěn)定，可能是 PM2.5暴露導(dǎo)致急性冠脈綜合癥的一個(gè)機(jī)制.

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HIF-1α/VEGF Signal Pathway Regulated by SUMO-1 in Vessel after ApoE-/- Mice Exposed to PM2.5

GAN Xiangdong1,2, LI Fei1, CAI Xin1, FU Wenliang1, XU Donggang1*, LONG Minhui2*

(1. Laboratory of Genomic Engineering, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850，China;2. College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457，China)

To evaluated the regulation of SUMO-1 to HIF-1αand vascular endothelial growth factor (VEGF) in ApoE-/- mice after PM2.5exposure by intratracheal instillation method, the SUMOylation of HIF-1αby SUMO-1, the expressions of SUMO-1, HIF-1α, and VEGF were investigated. After PM2.5exposure, the expressions of SUMO-1, HIF-1α, and VEGF in mouse aorta were up-regulated remarkably. PM2.5exposure induced SUMO-1 mediated SUMOlytion of HIF-1α. The expression of HIF-1αwas down-regulated bySUMO-1 knockdown under hypoxia. These results suggest that PM2.5exposure up-regulates the expression of SUMO-1 and stabilizes or up-regulates expression of HIF-1α, then upregulates the expression of VEGF, causing the unstablility of atherosclerotic plaques.

2015-12-31 《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(973)項(xiàng)目(2011CB503803)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81170255,31271476)

*通訊作者:徐東剛，研究員，Email:xudg@bmi.ac.cn;龍民慧，副研究員，Email:longminhui2006@126.com.

R318

A

1000-5463(2017)05-0054-05

【中文責(zé)編：成文 編輯助理：冷佳奕 英文審校：李海航】