復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血清維生素D水平與自身免疫抗體、淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系研究

賈新轉(zhuǎn) ，郭麗娜 ，李玉琢 ，王葉 ，魏蘭

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011；2.河北省胸科醫(yī)院，河北 石家莊 050041）

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者血清維生素D水平與自身免疫抗體、淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系研究

賈新轉(zhuǎn)1，郭麗娜1，李玉琢2，王葉1，魏蘭2

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011；2.河北省胸科醫(yī)院，河北 石家莊 050041）

目的探討復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（RSA）患者血清維生素D水平與自身免疫抗體、淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系。方法回顧性分析RSA患者125例，根據(jù)血清25羥維生素D[25（OH）D]水平，分為25（OH）D正常水平組50例、25（OH）D低水平組75例，分析兩組自身免疫抗體陽(yáng)性率及淋巴細(xì)胞亞群水平。結(jié)果25（OH）D低水平組抗心磷脂抗體（ACA）、抗核抗體（ANA）的陽(yáng)性率及甲狀腺過(guò)氧化物酶（TPO）抗體陽(yáng)性率均高于25（OH）D正常水平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；25（OH）D 低水平組外周血 CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD19+及 CD56+百分率均高于25（OH）D正常水平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論RSA患者中維生素D缺乏的比例較高，維生素D缺乏的RSA患者ACA、ANA及TPO抗體陽(yáng)性率較高，RSA維生素D水平與CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞及NK細(xì)胞免疫平衡有關(guān)。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；維生素D；T淋巴細(xì)胞；B淋巴細(xì)胞；NK細(xì)胞

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指連續(xù)≥3次的自然流產(chǎn)，在孕齡女性中的發(fā)病率為1%～3%[1]，目前證實(shí)免疫失衡與RSA有關(guān)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)維生素D作為胚胎種植中免疫調(diào)節(jié)因子，在生殖中發(fā)揮重要作用[2]，維生素D充足與體外受精（in vitro fertilization，IVF）妊娠率提高相關(guān)[3]。但關(guān)于維生素D在RSA中作用的研究較少。本研究旨在探討RSA患者血清維生素D水平與自身免疫抗體、淋巴細(xì)胞亞群的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年6月-2016年9月在本院生殖中心就診的RSA患者125例作為研究對(duì)象，年齡25～32歲。入組標(biāo)準(zhǔn)：①夫妻雙方染色體核型均正常；②盆腔彩超除外生殖道器質(zhì)性病變；③宮頸分泌物檢查除外生殖道感染；④生殖內(nèi)分泌激素檢查無(wú)異常，且無(wú)內(nèi)分泌疾病史；⑤無(wú)血栓形成傾向或高凝狀態(tài)；⑥月經(jīng)周期規(guī)律，最近3個(gè)月內(nèi)未應(yīng)用內(nèi)分泌或免疫調(diào)制劑及維生素D；⑦男方精液常規(guī)檢查無(wú)異常。根據(jù)血清25（OH）D水平將研究對(duì)象分為維生素D正常水平組（25（OH）D≥30 ng/ml）、維生素 D 低水平組（25（OH）D＜30 ng/ml）。兩組研究對(duì)象既往流產(chǎn)次數(shù)[25（OH）D低水平組既往流產(chǎn)3次49例（65.33%），既往流產(chǎn)≥4次 26例（34.67%），25（OH）D 正常水平組既往流產(chǎn)3次29例（58.00%），既往流產(chǎn)≥4次21 例（42.00%）（χ2=0.69，P=0.41）]差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組研究對(duì)象年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、月經(jīng)周期及末次自然流產(chǎn)后的時(shí)間間隔差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

1.2 研究方法

研究對(duì)象均于月經(jīng)周期第3天，抽取晨空腹靜脈血3 ml（檢測(cè)標(biāo)本均為外周血）。

1.2.1 血清25（OH）D水平測(cè)定 應(yīng)用JC028酶標(biāo)儀（瑞士澳斯邦公司）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）法檢測(cè) 25（OH）D 水平，按照 25（OH）D 試劑盒（英國(guó)IDS公司）說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.2 自身免疫抗體檢測(cè) 應(yīng)用ELISA測(cè)定抗心磷脂抗體（anti cardiolipin antibody，ACA）、ACA-IgG及ACA-IgM。采用間接免疫熒光法測(cè)定抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）和免疫印跡法測(cè)定ANA譜（抗-dsDNA抗體、抗-ssDNA抗體、抗-組蛋白抗體及抗Scl70抗體）；應(yīng)用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）。TPOAb試劑盒購(gòu)自美國(guó)Beckman公司，其余試劑盒購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司，所用儀器分別為JC028酶標(biāo)儀，Eurolinescan自動(dòng)判別軟件（德國(guó)歐蒙公司），EUROBlotMaster分析儀熒光顯微鏡（德國(guó)歐蒙公司），DXI800型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（美國(guó)Beckman公司）。

1.2.3 淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定淋巴 細(xì) 胞 亞 群 [CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+、CD19+、CD56+]。所用試劑盒購(gòu)自美國(guó)eBiascience公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RSA女性25（OH）D水平分組情況

125例 RSA 患者中，50例（40.00%）為 25（OH）D 正常水平（≥30 ng/ml），75例（60.00%）是 25（OH）D 低水平（＜30 ng/ml）。

2.2 兩組自身免疫抗體陽(yáng)性率的比較

25（OH）D低水平組ACA、ANA的陽(yáng)性率及TPOAb陽(yáng)性率均高于25（OH）D正常水平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組 ACA-IgG、ACA-IgM、抗-dsDNA、抗-ssDNA、抗-組蛋白及抗Scl70陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 兩組淋巴細(xì)胞亞群的比較

25（OH）D 低水平組外周血 CD3+CD4+、CD4+/CD8+、CD19+及 CD56+百分率均高于 25（OH）D 正常水平組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組CD3+及CD3+CD8+差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表1 兩組基本情況的比較 （±s）

表1 兩組基本情況的比較 （±s）

組別例數(shù)年齡/歲BMI/（kg/m2）月經(jīng)周期/d末次自然流產(chǎn)后的時(shí)間間隔/月25（OH）D 低水平組 75 27.75±1.71 21.42±1.72 27.52±2.12 4.13±0.82 25（OH）D 正常水平組 50 27.46±1.97 21.16±1.75 26.68±2.30 4.12±0.79 t值 0.861 0.819 0.789 0.091 P值 0.391 0.414 0.481 0.928

表2 兩組自身免疫抗體陽(yáng)性率的比較 %

表3 兩組淋巴細(xì)胞亞群的比較 （±s）

表3 兩組淋巴細(xì)胞亞群的比較 （±s）

組別 例數(shù) CD3+T/% CD3+CD4+T/% CD3+CD8+T/% CD4+/CD8+ CD19+/% CD56+/%25（OH）D 低水平組 75 74.48±3.02 42.12±3.79 25.52±2.34 1.65±0.04 10.65±1.60 13.23±3.07 25（OH）D 正常水平組 50 74.86±2.83 36.30±3.47 25.16±1.87 1.44±0.05 6.55±0.48 10.44±1.48 t/u值 0.706 8.687 1645.000 15.000 273.000 777.000 P值 0.481 0.000 0.243 0.000 0.000 0.000

3 討論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，維生素D參與鈣磷代謝、機(jī)體免疫及生殖等生理過(guò)程[4]，維生素D是生殖成功過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵因素[5]。大量流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)維生素D缺乏在世界范圍內(nèi)普遍存在[6]。最近研究中顯示，妊娠期女性同樣普遍存在維生素D缺乏[7]。本研究發(fā)現(xiàn)在RSA患者中維生素D缺乏的比例較高。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，RSA患者中25（OH）D低水平組ACA、ANA及TPO抗體的陽(yáng)性率高于25（OH）D正常水平組，而兩組IgG、IgM、抗-dsDNA、抗-ss-DNA、抗-組蛋白及抗Scl70抗體陽(yáng)性率均無(wú)差異。本研究組前期研究提示TPOAb陽(yáng)性與維生素D低水平密切相關(guān)，維生素D低水平、TPOAb陽(yáng)性相互作用增加自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)[8]，另有學(xué)者報(bào)道，維生素D水平與TPOAb定量負(fù)相關(guān)[9]。ROUSSEV等[10]報(bào)道抗磷脂抗體綜合征的患者維生素D缺乏普遍性增加，維生素D缺乏與ACA、ANA及TPOAb增加相關(guān)。本研究結(jié)果與之相似，推測(cè)維生素D水平可影響RSA自身免疫抗體。有學(xué)者對(duì)維生素D水平如何影響自身抗體進(jìn)行研究，證實(shí)維生素D缺乏與經(jīng)B細(xì)胞活化的自身抗體增加相關(guān)[11]，維生素D通過(guò)抑制活化的B細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡，在自身抗體產(chǎn)生中起調(diào)節(jié)作用。在本研究中RSA患者25（OH）D低水平組外周血CD19+百分比高于25（OH）D正常水平組，推測(cè)維生素D通過(guò)調(diào)節(jié)B淋巴細(xì)胞增殖及功能影響自身免疫抗體，進(jìn)而影響妊娠過(guò)程，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

在本研究中同時(shí)對(duì)RSA女性維生素D水平與T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，維生素D低水平組CD4+較維生素D正常水平組增多，CD4+/CD8+增高，但T細(xì)胞總數(shù)、CD8+均無(wú)差異。T淋巴細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)主要的免疫細(xì)胞，主要包括CD4+、CD8+。CD4+介導(dǎo)細(xì)胞免疫，其數(shù)量增多可使母體對(duì)胚胎發(fā)生較強(qiáng)的免疫排斥，引起流產(chǎn)。CD8+可抑制CD4+介導(dǎo)的免疫排斥，正常情況下兩者達(dá)到平衡狀態(tài)。反復(fù)流產(chǎn)患者外周血CD4+增多，而CD8+無(wú)變化[12]。體外試驗(yàn)證實(shí)維生素D可調(diào)控活化T細(xì)胞，促進(jìn)其分化及免疫耐受[13]，維生素D可抑制Th1細(xì)胞增殖并限制其產(chǎn)生細(xì)胞因子（如IFN-r、IL-2及TNF-α），誘導(dǎo) Th2細(xì)胞因子（如 IL-4，IL-5，IL-6，IL-9，IL-10及 IL-13）[14]。而維生素 D 在RSA 患者體內(nèi)如何調(diào)控T淋巴細(xì)胞有待于進(jìn)一步研究。

NK細(xì)胞數(shù)量、功能異常是引起RSA的重要因素[15]，外周血NK細(xì)胞高水平能夠預(yù)測(cè)下次妊娠仍有可能發(fā)生自然流產(chǎn)[16]。有研究報(bào)道，維生素D與NK細(xì)胞毒性呈負(fù)相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)缺乏維生素D可抑制穿孔素分泌，進(jìn)而影響對(duì)靶細(xì)胞的殺傷[7]。本研究結(jié)果顯示，25（OH）D低水平組外周血CD56+百分比高于25（OH）D正常組，推測(cè)維生素D同時(shí)參與NK細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞毒性的調(diào)控。

綜上所述，RSA患者中維生素D缺乏的比例較高，維生素D缺乏可影響RSA患者的免疫狀態(tài)。維生素D低水平的RSA患者有ACA、ANA及TPOAb陽(yáng)性的傾向，而ACA、ANA及TPOAb陽(yáng)性與生殖失敗相關(guān)。RSA患者維生素D水平與CD4+、B細(xì)胞及NK細(xì)胞免疫平衡有關(guān)。對(duì)于維生素D缺乏的RSA患者添加維生素D治療是否可改善生殖狀況有待于進(jìn)一步研究。

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Study on relationship between serum vitamin D level and autoantibodies or lymphocyte subsets in patients with RSA

Xin-zhuan Jia1,Li-na Guo1,Yu-zhuo Li2,Ye Wang1,Lan Wei2
(1.Fourth Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang,Hebei 050011,China;2.Hebei Chest Hospital,Shijiazhuang,Hebei 050041,China)

ObjectiveTo investigate the relationship between serum vitamin D level and autoantibodies or lymphocyte subsets in patients with recurrent spontaneous abortion (RSA).MethodsA total of 125 patients with RSA were included in a retrospective analysis.According to the serum levels of 25-hydroxy vitamin D[25-(OH)-D],the patients were divided into[25-(OH)-D]normal group including 50 cases and[25-(OH)-D]low level group including 75 cases.The positive rate of autoantibodies and the level of lymphocyte subsets in the two groups were analyzed.ResultsCompared with the [25-(OH)-D]normal group,the positive rates of anticardiolipin antibody(ACA),antinuclear antibody(ANA)and thyroid peroxidase(TPO)antibody were higher in the [25-(OH)-D]low level group,the difference was statistically significant(P＜0.05);the percentages of(CD3+/CD4+)T,CD4+/CD8+,CD19+B cells and CD56+natural killer(NK)cells were higher in the[25-(OH)-D]low level group,the difference was statistically significant(P＜0.05).ConclusionsThe rate of vitamin D deficiency is higher in women with RSA.The positive rates of ACA,ANA and TPO are higher in RSA women with vitamin D deficiency.The vitamin D level in women with RSA is related to CD4+T cells,B lymphocytes and the balance of NK cells.

recurrent spontaneous abortion;vitamin D;T lymphocyte;B lymphocyte;NK cell

R71

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.014

1005-8982（2017）24-0066-04

2017-03-16

魏蘭，E-mail：1134979643@qq.com

（唐勇 編輯）