誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和缺氧誘導(dǎo)因子-1α與尖銳濕疣發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究

吳然 ，賈敏 ，唐挺 ，馬尊峰 ，賀愛娟 ，孫藺波 ，胡文韜 ，曾義燕 ，馮浩

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 貴陽 550001；2.湖南省人民醫(yī)院 皮膚科，湖南 長沙 410005）

誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和缺氧誘導(dǎo)因子-1α與尖銳濕疣發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性研究

吳然1，賈敏1，唐挺1，馬尊峰1，賀愛娟1，孫藺波1，胡文韜1，曾義燕1，馮浩2

（1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 皮膚科，貴州 貴陽 550001；2.湖南省人民醫(yī)院 皮膚科，湖南 長沙 410005）

目的檢測尖銳濕疣（CA）組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）與缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的表達(dá)，以明確其在CA發(fā)生、發(fā)展中的臨床意義。方法收集50例CA和20例正常包皮組織，采用免疫組織化學(xué)法檢測組織中iNOS與HIF-1α的表達(dá)并與CD34表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果50例CA患者中，iNOS陽性50例（100%），表現(xiàn)為表皮全層細(xì)胞均為iNOS陽性表達(dá)；對(duì)照組20例正常皮膚中iNOS陽性14例（70%），iNOS陽性表達(dá)主要位于表皮基底層，且呈弱陽性表達(dá)，CA患者皮損中iNOS灰度值為（97.985±20.320）高于對(duì)照組（73.017±15.633）（P＜0.05）。50例CA 患者中 42例 HIF-1α 陽性（84%），高于對(duì)照組陽性 9例（45%）（P＜0.05）；且 HIF-1α在 CA 患者中灰度值為（0.204±0.064），高于對(duì)照組（0.135±0.019）（P＜0.05）。CA患者組織中iNOS與CD34表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.375，P=0.007）；CA患者組織中HIF-1α與CD34表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.393，P=0.005）。結(jié)論iNOS與HIF-1α可能協(xié)同參與CA的發(fā)病和發(fā)展。

尖銳濕疣；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）；缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）

尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）是由人類乳頭瘤病毒（HPV）感染所致生殖器增生性損害（亞臨床感染除外），在臨床呈逐年增多的趨勢[1]，且極易復(fù)發(fā)，組織學(xué)中?？梢娚掀ぜ?xì)胞及血管異常增生。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide，i-NOS）與組織增殖、血管增生有關(guān)[2]，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α）是細(xì)胞對(duì)缺氧環(huán)境應(yīng)答的重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)認(rèn)為與組織增生有關(guān)[3-4]。本文旨在研究CA組織中i-NOS與HIF-1α的表達(dá)及其與CA發(fā)病與發(fā)展的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年1月-2016年8月貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的門診患者50例，經(jīng)臨床及醋酸白實(shí)驗(yàn)診斷為CA患者，并經(jīng)病理活檢證實(shí)。其中，男性28例，女性22例；年齡19～63歲，平均37歲；病程10 d～1年。正常包皮對(duì)照組20例，來自同期我院泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)者。年齡6～18歲，平均10歲。所有患者及對(duì)照組皮損組織放入10%中性福爾馬林液固定過夜，常規(guī)石蠟包埋，4μm切片覆于多聚賴氨酸處理過的玻片上備用。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 iNOS一抗（購自Labvison公司），HIF-1α一抗和CD34試劑盒（購自武漢博士德生物有限公司）。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法檢測組織中iNOS、HIF-1α和CD34表達(dá) 采用Envision兩步法進(jìn)行檢測：水浴鍋中40 min進(jìn)行抗原修復(fù)，3%鏈霉菌抗生素-過氧化物酶孵育20 min后，滴加iNOS、HIF-1α和CD34一抗，37℃孵育30 min，加以Envision/HRP室溫孵育30 min，DAB顯色。蘇木素復(fù)染，常規(guī)封片。

1.2.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) iNOS陽性為細(xì)胞膜或胞漿染色呈棕黃色或棕褐色；HIF-1α陽性為細(xì)胞漿和（或）細(xì)胞核內(nèi)棕黃色染色。在200視野選擇5個(gè)有代表性區(qū)域，每個(gè)區(qū)域計(jì)算200個(gè)細(xì)胞。陽性細(xì)胞評(píng)分：0～5%計(jì) 0分，6%～35%計(jì) 1分，36%～70%為 2分，＞70%為3分。染色程度：0為不著色，1為弱著色（淡棕黃色），2為強(qiáng)著色（明顯棕黃色）。兩項(xiàng)評(píng)分相加，≤2分為陰性，3分為（+），4分為（++），5分為（+++）。隨機(jī)取5個(gè)視野，免疫組化評(píng)分為定量評(píng)分與染色程度評(píng)分之和除以2，得分為3～4認(rèn)為是強(qiáng)陽性。陽性片使用Image-Pro Plus醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量測定。

1.2.4 微血管密度計(jì)數(shù)（microvessel density，MVD）胞核或胞漿出現(xiàn)淡至棕黃或棕褐色顆粒為CD34陽性細(xì)胞，低倍鏡下選擇血管分布最高區(qū)域，高倍鏡下計(jì)數(shù)著色的毛細(xì)血管和微小血管，取5個(gè)高倍視野血管數(shù)目平均即為MVD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用t檢驗(yàn)；組間陽性率比較用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson直線相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 iNOS在CA及正常組織中的表達(dá)

50例CA患者中，iNOS陽性50例（100%），表現(xiàn)為表皮全層細(xì)胞均為iNOS陽性表達(dá)；對(duì)照組20例正常皮膚中iNOS陽性14例（70%），iNOS陽性表達(dá)主要位于表皮基底層，且呈弱陽性表達(dá)，CA患者皮損中iNOS灰度值為（97.985±20.320），對(duì)照組為（73.017±15.633），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.528，P=0.000）。見附表和圖 1。

附表 兩組iNOS、HIF-1α與CD34表達(dá)比較 （±s）

附表 兩組iNOS、HIF-1α與CD34表達(dá)比較 （±s）

組別 例數(shù) iNOS HIF-1α CD34 CA 組 50 73.017±15.633 0.204±0.064 9.7120±2.145對(duì)照組 20 97.985±20.320 0.135±0.019 3.845±1.694 t值 5.528 6.889 10.928 P值 0.000 0.000 0.000

圖1 iNOS在包皮組織中的表達(dá)

2.2 HIF-1α和在CA及正常組織中的表達(dá)

50例CA患者中42例HIF-1α陽性（84%），20例對(duì)照組中HIF-1α陽性9例（45%），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.988，P=0.001）；且 HIF-1α 在CA患者中灰度值為（0.204±0.064），在對(duì)照組中為（0.135±0.019），兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.889，P=0.000）。見附表和圖 2。

2.3 CA患者iNOS和HIF-1α與CD34表達(dá)相關(guān)性

經(jīng)Person直線相關(guān)分析結(jié)果顯示，CA患者包皮組織中iNOS與CD34表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.375，P=0.007）；CA患者包皮組織中HIF-1α與CD34表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.393，P=0.005）。見圖 3、4。

圖中數(shù)據(jù)分布趨勢呈正相關(guān)，且呈線性上升趨勢，說明iNOS和HIF-1α有直線相關(guān)關(guān)系。

圖2 HIF-1α在包皮組織中的表達(dá)

圖3 CA患者包皮組織中iNOS和HIF-1α與CD34表達(dá)相關(guān)性

圖4 CD34在包皮組織中的表達(dá)

3 討論

CA[4]由人乳頭瘤病毒感染所致，常發(fā)生在肛周及生殖器部位，主要表現(xiàn)為菜花狀、乳頭狀及蕈樣狀疣狀良性增生物，傳染性強(qiáng)、生長迅速和易復(fù)發(fā)為其主要特征。占我國性傳播疾病第2位，且仍有不斷上升趨勢，嚴(yán)重影響患者的生活、工作及心理，故而進(jìn)一步研究該疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，為疾病的治療提供新的思路及途徑具有一定的臨床研究價(jià)值。典型的CA組織病理常可見上皮細(xì)胞及血管異常增生，基于組織病理上細(xì)胞及血管異常增生的特性，iNOS、HIF-1α與CA的相關(guān)性研究進(jìn)入人們的視野。

CA雖為良性腫瘤，但其生長迅速，角質(zhì)形成細(xì)胞增生明顯，血運(yùn)豐富，在細(xì)胞快速增長的過程中導(dǎo)致氧的需求量增加，造成局部缺氧微環(huán)境。一氧化氮（NO）[5]是機(jī)體內(nèi)一種重要的信使分子，同時(shí)也是一種重要的效應(yīng)分子，其具有擴(kuò)張血管、增加血管通透性和促進(jìn)血管生成的作用，由L-精氨酸經(jīng)一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化生成。NOS有3種同工酶，即誘導(dǎo)型NOS（iNOS）、神經(jīng)性NOS（nNOS）、內(nèi)皮型 NOS（eNOS）。正常情況下，組織中iNOS表達(dá)量很少，只有炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)及腫瘤等病理情況下iNOS的表達(dá)增多，且其誘生NO的能力高于其余兩型。大量研究表明[6]，iNOS與腫瘤血管生成之間存在相關(guān)性。有研究[7-8]表明，其可能機(jī)制為iNOS誘導(dǎo)NO生成，進(jìn)而通過NO擴(kuò)張血管、增加血管通透性、上調(diào)MMPs并下調(diào)TIMPs從而促進(jìn)血管生成。其次，NO可通過刺激血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成[9]。除此之外，研究證實(shí)[10]，iNOS還與細(xì)胞增殖密切相關(guān)。

HIF-1[11]是機(jī)體缺氧微環(huán)境下誘導(dǎo)基因表達(dá)和恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的1個(gè)核心調(diào)節(jié)因子，由1個(gè)α及1個(gè)β亞單位組成。HIF-1α在機(jī)體中受氧濃度調(diào)節(jié)，常氧條件下易被降解，而缺氧條件下，降解受阻，穩(wěn)定增加，是HIF-1中真正起調(diào)節(jié)作用的功能單位。研究表明[12]，缺氧環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)和合成增加，并通過與其靶基因中的缺氧反應(yīng)原件-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 1（glucose transporter 1，GLUT-1）結(jié)合，誘導(dǎo)GLUT-1大量表達(dá)，繼而增加葡萄糖代謝，本研究結(jié)果顯示，CA患者中iNOS及HIF-1α陽性強(qiáng)度高于對(duì)照組，且iNOS、HIF-1α表達(dá)與CD34表達(dá)呈正相關(guān)。該因素在CA患者中可能具有改善CA細(xì)胞快速增殖所致的能量失衡，進(jìn)而助長CA的快速增長的作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，缺氧反應(yīng)基因VEGF、環(huán)氧合酶-2及iNOS上均有HIF-1α的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)3者在缺氧環(huán)境下的表達(dá)，從而促進(jìn)新血管生成，增加氧運(yùn)輸，改善缺氧微環(huán)境。

故而認(rèn)為CA患者中iNOS及HIF-1α可能通過以上途徑參與CA的發(fā)病與發(fā)展，且兩者具有協(xié)同作用。

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Effect of iNOS and HIF-1α on condyloma acuminatum

Ran Wu1,Min Jia1,Ting Tang1,Zun-feng Ma1,Ai-juan He1,Lin-bo Sun1,Wen-tao Hu1,Yi-yan Zeng1,Hao Feng2
(1.Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Guiyang Medical College,Guiyang,Guizhou 550001,China;2.Department of Dermatology,Hunan Provincial People's Hospital,Changsha,Hunan 410005,China)

ObjectiveTo investigate the expression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)and hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α)and their effect on development of condyloma acuminatum (CA).MethodsA total of 50 patients with CA and 20 healthy volunteers were collected.The expression of iNOS,HIF-1α and CD34 was determined by Immunohistochemistry.ResultsA total of 50 cases with CA were identified as iNOS positive(100%)which were expressed in whole epidermis;14 out of 20 volunteers(70%)were iNOS positive(weak signal)which were mainly expressed in epidermal basal cells.Gray value of iNOS in CA patients was higher than that in healthy volunteers(97.9854±20.3196 vs 73.0174±15.6330,respectively)(P＜0.05).Fortytwo out of 50 patients (84%)experienced increased expression of HIF-1α while only 9 volunteers had positive signals (45%) (P＜0.05).Gray value of HIF-1α in CA patients was higher than that in the control group (0.2035±0.0637 vs 0.1349±0.0194) (P＜0.05).Intimate correlation between iNOS or HIF-1α and CD34 in CA was observed (r=0.375 and 0.393,P＜0.05).ConclusioniNOS and HIF-1α is involved in the pathogenesis of CA.

condyloma acuminatum;inducible nitric oxide synthase;hypoxia inducing factor-1α

R752

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.010

1005-8982（2017）24-0049-04

2017-03-31

馮浩，E-mail：doctorfenghao@126.com

（王榮兵 編輯）