• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    結(jié)直腸癌組織中卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域12蛋白表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng)侵襲的關(guān)系*

    2017-11-02 06:28:33耿瑋葉智斌范亞男梁巍張夢(mèng)陽
    關(guān)鍵詞:結(jié)構(gòu)域陽性率直腸癌

    耿瑋,葉智斌,范亞男,梁巍,張夢(mèng)陽

    (河北省人民醫(yī)院 普外五科,河北 石家莊 050051)

    結(jié)直腸癌組織中卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域12蛋白表達(dá)與腫瘤生長(zhǎng)侵襲的關(guān)系*

    耿瑋,葉智斌,范亞男,梁巍,張夢(mèng)陽

    (河北省人民醫(yī)院 普外五科,河北 石家莊 050051)

    目的觀察結(jié)直腸癌組織中卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域12(CCDC12)蛋白的表達(dá)情況,并探討CCDC12蛋白與腫瘤生長(zhǎng)侵襲的關(guān)系。方法免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)94例結(jié)直腸癌組織及癌旁正常腸黏膜組織中CCDC12蛋白的表達(dá),同時(shí)檢測(cè)與腫瘤生長(zhǎng)侵襲有關(guān)的蛋白質(zhì)Cyclin D1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)。記錄患者腫瘤生物學(xué)特征,分析CCDC12蛋白與結(jié)直腸癌生物學(xué)特征及Cyclin D1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白的關(guān)系。結(jié)果CCDC12、CyclinD1、MMP-9及TIMP-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率均高于癌旁正常腸黏膜組織(χ2=38.480、30.312、38.368及 7.667,均P<0.01),P21蛋白在兩種組織中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.862,P=0.353)。在結(jié)直腸癌組織中CCDC12蛋白陽性表達(dá)與腫瘤細(xì)胞分化、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(χ2=5.130、5.902、9.760 及 4.458,P=0.024、0.015、0.002 及 0.035)。Spearman 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),CCDC12 與CyclinD1、MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.302和0.365,P=0.003和0.001),CCDC12與P21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.287,P=0.005)。結(jié)論結(jié)直腸癌中存在CCDC12蛋白表達(dá)增高現(xiàn)象,CCDC12可能通過與CyclinD1、P21及MMP-9蛋白的相互作用參與了結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及侵襲過程。

    結(jié)直腸癌;卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域12;腫瘤生長(zhǎng);腫瘤侵襲

    我國(guó)結(jié)直腸癌的發(fā)病率占惡性腫瘤第4位,死亡率居第5位[1],雖然手術(shù)及藥物治療結(jié)直腸癌已取得了較大的進(jìn)展[2-3],但由于結(jié)直腸癌發(fā)病隱匿、無特異性癥狀,因此很難早期診斷,患者就診時(shí)多已處于進(jìn)展期。該病的整體治療效果還遠(yuǎn)不能令人滿意[4]。結(jié)直腸癌生長(zhǎng)迅速、具有較強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力,這是結(jié)直腸癌治療效果不佳的重要原因。結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及侵襲是多種基因異常表達(dá)的結(jié)果,探討其機(jī)制對(duì)結(jié)直腸癌的綜合診治意義重大。卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域(coiled-coil domain-containing,CCDC)基因家族有多個(gè)成員,研究發(fā)現(xiàn)一些CCDC基因與惡性腫瘤關(guān)系密切[5-7],也有研究發(fā)現(xiàn)CCDC12與結(jié)直腸癌有關(guān)[8]。但有關(guān)結(jié)直腸癌組織中CCDC12表達(dá)及意義的相關(guān)報(bào)道極少。本研究通過檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中CCDC12蛋白表達(dá)情況,為探討CCDC12蛋白與結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及侵襲的關(guān)系提供依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料

    選取2013年1月-2015年6月于河北省人民醫(yī)院外科手術(shù)的94例結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織及癌旁正常腸黏膜組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。入組標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥18歲;②患者有手術(shù)切除標(biāo)本確診為結(jié)直腸癌;③術(shù)前未接受過放療、化療及介入治療等措施;④患者為初診。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并其他惡性腫瘤或有其他腫瘤病史的患者;②曾行手術(shù)治療的復(fù)發(fā)患者;③接受新輔助放化療或靶向治療的患者。男性61例,女性 33例;年齡 37~81歲,平均(53.52±8.95)歲?;颊呔炇鹬橥馕募?,本研究得到河北省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 主要試劑及儀器

    CCDC12(購(gòu)自美國(guó) Aviva公司),CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1抗體(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司),免疫組織化學(xué)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine,DAB)顯色試劑盒(均購(gòu)自北京中杉生物公司),切片機(jī)(RM2255型)、組織細(xì)胞染色機(jī)(ST5020型)(購(gòu)自德國(guó)LEICA公司)。

    1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)及結(jié)果判斷

    將石蠟包埋的組織在切片機(jī)上連續(xù)4 μm切片,然后進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)及阻斷內(nèi)源性過氧化物酶(peroxidase,POD)活性,分別加入各一抗,浸泡、沖洗后加入二抗,37℃孵育30 min,最后進(jìn)行顯色、復(fù)染及封片。陰性對(duì)照為磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS),陽性對(duì)照為各一抗提供的陽性對(duì)照。CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白均以在細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為染色陽性。在鏡下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)視野,應(yīng)用二次計(jì)分法將陽性細(xì)胞比例與染色強(qiáng)度的乘積作為讀片結(jié)果。乘積為0記為(-),1~2記為(+),3~4記為(++),>4記為(+++)。(-)為陰性表達(dá),其他均記為陽性表達(dá)。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件,各蛋白在腫瘤組織與正常黏膜組織間的表達(dá)差異及腫瘤組織中各指標(biāo)表達(dá)與病理特征關(guān)系用χ2檢驗(yàn),腫瘤組織各指標(biāo)之間的相關(guān)性用Spearmann相關(guān)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9 及 TIMP-1在結(jié)直腸癌腫瘤組織及癌旁正常腸黏膜組織中的表達(dá)情況

    在結(jié)直腸癌組織中,CCDC12陽性表達(dá)率為75.53%、CyclinD1陽性率為61.70%、P21陽性率為37.23%、MMP-9陽性率為82.98%、TIMP-1陽性率為58.51%,癌旁正常腸黏膜組織中CCDC12、Cyclin D1、P21、MMP-9及TIMP-1陽性率分別為19.15%、15.96%、31.91%、25.53%及34.04%。經(jīng)配對(duì) χ2檢驗(yàn),CCDC12、CyclinD1、MMP-9 及 TIMP-1 蛋白在結(jié)直腸癌組織中陽性表達(dá)率均高于癌旁正常腸黏膜組織(χ2=38.480、30.312、38.368 及 7.667,P=0.001、0.001、0.001及0.006),P21蛋白在兩種組織中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.862,P=0.353)。見表1和圖1。

    2.2 CCDC12在結(jié)直腸癌組織表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

    結(jié)直腸癌組織中CCDC12蛋白陽性率與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、神經(jīng)血管侵犯及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.163、1.973、1.057、4.458、2.729、0.146 及 0.132,P=0.141、0.160、0.788、0.099、0.703 及 0.716),CCDC12 蛋白陽性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.902、5.130、9.760及4.458,P=0.015、0.024、0.002 及 0.035)。見表 2。

    表1 CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白在結(jié)直腸癌組織及相應(yīng)癌旁正常腸黏膜組織中的表達(dá) (n=94,例)

    圖1 CCDC12、CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá) (×200)

    2.3 CCDC12與CyclinD1、P21、MMP-9及TIMP-1蛋白在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

    經(jīng)Spearman相關(guān)分析顯示,在結(jié)直腸癌組織中,CCDC12與CyclinD1、MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.3022 和 0.3653,P=0.003 和 0.001),CCDC12 與 P21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.2886,P=0.005)。

    表2 CCDC12蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系 例

    3 討論

    隨著我國(guó)社會(huì)發(fā)展及飲食結(jié)構(gòu)的改變,近年來結(jié)直腸癌的發(fā)生率不斷升高[9],已成為最常見的消化道惡性腫瘤之一。該病無特異性癥狀,早期易于誤診漏診。結(jié)直腸癌具有生長(zhǎng)迅速、侵襲轉(zhuǎn)移快的特點(diǎn),因而在就診時(shí)多數(shù)患者已處于進(jìn)展期,治療效果不理想。目前對(duì)結(jié)直腸癌的主要治療措施包括手術(shù)、放化療及部分靶向藥物的治療[4,10],但總體治療效果尚待進(jìn)一步提高。因此,了解結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)侵襲機(jī)制有重要的臨床價(jià)值。結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)侵襲是多基因共同作用的結(jié)果,在該方面已有不少研究成果,但具體機(jī)制尚未完全闡明。

    CCDC12基因是CCDC家族的成員之一,該家族有眾多成員,近年來研究發(fā)現(xiàn)該家族的多個(gè)成員與惡性腫瘤關(guān)系密切[5-7]。本研究顯示,在結(jié)直腸癌組織中CCDC12表達(dá)比正常腸黏膜增強(qiáng),且CCDC12的陽性表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、分化情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān),本研究結(jié)果提示CCDC12可能參與結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及侵襲過程,具有導(dǎo)致結(jié)直腸癌進(jìn)展的作用。但CCDC12在腫瘤不同階段發(fā)揮的具體作用還有待進(jìn)一步研究。

    CyclinD1是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的一種重要蛋白,該蛋白可以使Rb蛋白磷酸化而失活,從而啟動(dòng)細(xì)胞周期。在腫瘤組織中CyclinD1表達(dá)異常,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖,對(duì)多種腫瘤的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌中CyclinD1表達(dá)比正常腸黏膜增強(qiáng),與LI等的研究結(jié)果符合[13]。P21蛋白具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能,其主要作用在于P21能抑制周期素依賴激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)復(fù)合物的活性,從而抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展,抑制細(xì)胞分裂[14]。但本研究中P21蛋白在腫瘤與正常腸黏膜組織中表達(dá)無差異。筆者分析這可能是由于P21蛋白只在腫瘤的特定階段發(fā)揮作用,而正常組織中P21也保持一定的表達(dá),對(duì)細(xì)胞周期發(fā)揮調(diào)控作用,因而也有一定程度表達(dá)。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)的重要成員之一,具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的功能,在腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移中有重要的促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)MMP-9在結(jié)直腸癌腫瘤組織中具有高表達(dá)現(xiàn)象[15]。本研究也發(fā)現(xiàn),MMP-9在腫瘤組織中表達(dá)增強(qiáng),且與腫瘤的浸潤(rùn)及分期有關(guān),提示MMP-9在結(jié)直腸癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。TIMP-1具有抑制MMP-9的功能,在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移過程中發(fā)揮重要作用,研究表明TIMP-1在結(jié)直腸癌腫瘤組織的表達(dá)高于癌旁組織[16],本研究也得到相似結(jié)果。筆者分析認(rèn)為在腫瘤中MMP-9表達(dá)增強(qiáng)會(huì)導(dǎo)致抑制劑TIMP-1表達(dá)也有所增強(qiáng),因而腫瘤組織也出現(xiàn)TIMP-1高表達(dá)現(xiàn)象,但總的MMPs-TIMPs平衡破壞,導(dǎo)致腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。

    本結(jié)果發(fā)現(xiàn),在結(jié)直腸癌組織中CCDC12與Cyclin D1及MMP-9蛋白表達(dá)呈正相關(guān)性,而與P21表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性,說明CCDC12蛋白與結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)及侵襲有關(guān),CCDC12可能通過上調(diào)CyclinD1、MMP-9,同時(shí)下調(diào)P21的表達(dá)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞周圍基質(zhì)降解,從而使結(jié)直腸癌易于侵襲轉(zhuǎn)移。但本研究結(jié)果僅為臨床結(jié)果的分析,具體調(diào)控關(guān)系是否存在還有待深入的研究進(jìn)行證實(shí)。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)CCDC12蛋白在結(jié)直腸癌組織中存在表達(dá)增高現(xiàn)象且與部分病理學(xué)特征相關(guān),說明CCDC12蛋白可能參與腫瘤的生長(zhǎng)侵襲過程。CCDC12參與結(jié)直腸癌生長(zhǎng)侵襲的機(jī)制可能與CCDC12與 CyclinD1、MMP-9及 P21相互調(diào)控、共同作用有關(guān),但具體情況還應(yīng)擴(kuò)大研究規(guī)模、并進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

    [1]CHEN W,ZHENG R,ZENG H,et al.The incidence and mortality of major cancers in China,2012[J].Chin J Cancer,2016,35(8):73.

    [2]DONG J,WANG W,YU K,et al.Outcomes of laparoscopic surgery for rectal cancer in elderly patients[J].Journal of B.u.on.Official Journal of the Balkan Union of Oncology,2016,21(1):80-86.

    [3]JIN X,CHE D B,ZHANG Z H,et al.Ginseng consumption and risk of cancer:a meta-analysis[J].J Ginseng Res,2016,40(3):269-277.

    [4]LIU J,ZHOU Q,XU J,et al.Detection of EGFR expression in patients with colorectal cancer and the therapeutic effect of cetuximab[J].J BUON,2016,21(1):95-100.

    [5]GONG Y,QIU W,NING X,et al.CCDC34 is up-regulated in bladder cancer and regulates bladder cancer cell proliferation,apoptosis and migration[J].Oncotarget,2015,6(28):25856-25867.

    [6]LIU Y,KHERADMAND F,DAVIS CF,et al.Focused analysis of exome sequencing data for rare germline mutations in familial and sporadic lung cancer[J].J Thorac Oncol,2016,11(1):52-61.

    [7]YIN D T,XU J,LEI M,et al.Characterization of the novel tumor-suppressor gene CCDC67 in papillary thyroid carcinoma[J].Oncotarget,2016,7(5):5830-5841.

    [8]KE J,LOU J,ZHONG R,et al.Identification of a potential regulatory variant for colorectal cancer risk mapping to 3p21.31 in Chinese population[J].Sci Rep,2016(6):25194.

    [9]BODE A M,DONG Z,WANG H.Cancer prevention and control:alarming challenges in China[J].Natl Sci Rev,2016,3(1):117-127.

    [10]CHENG Y,SONG W.Efficacy ofFOLFOXIRI versus XELOXIRI plus bevacizumab in the treatment of metastatic colorectal cancer[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(10):18713-18720.

    [11]GOPALAKRISHNAN N,SARAVANAKUMAR M,MADANKUMAR P,et al.Colocalization of beta-catenin with Notch intracellular domain in colon cancer:a possible role of Notch1 signaling in activation of CyclinD1-mediated cell proliferation[J].Mol Cell Biochem,2014,396(1/2):281-293.

    [12]LIAO K,LI J,WANG Z.Dihydroartemisinin inhibits cell proliferation viaAKT/GSK3beta/cyclin D1 3beta/cycl n D1 pa apoptosis in A549 lung cancer cells[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(12):8684-8691.

    [13]LI Q,DONG Q,WANG E.Rsf-1 is overexpressed in non-small cell lung cancers and regulates cyclinD1 expression and ERK activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2012,420(1):6-10.

    [14]WANG S,CHEN Y,BAI Y.p21 participates in the regulation of anaplastic thyroid cancer cell proliferation by miR-146b[J].Oncol Lett,2016,12(3):2018-2022.

    [15]JIN H,LI X J,PARK M H,et al.FOXM1-mediated downregulation of uPA and MMP9 by 3,3'-diindolylmethane inhibits migration and invasion of human colorectal cancer cells[J].Oncol Rep,2015,33(6):3171-3177.

    [16]IONESCU C,BRAICU C,CHIOREAN R,et al.TIMP-1 expression in human colorectal cancer is associated with SMAD3 gene expression levels:a pilot study[J].J Gastrointestin Liver Dis,2014,23(4):413-418.

    Effect of Coiled-coil domain-containing protein 12 on growth and invasion of colorectal cancer tissues*

    Wei Geng,Zhi-bin Ye,Ya-nan Fan,Wei Liang,Meng-yang Zhang
    (Department of Fifth General Surgery,Hebei General Hospital,Shijiazhuang,Hebei 050051,China)

    ObjectiveTo investigate the effect of Coiled-coil domain-containing protein 12 (CCDC12)on growth and invasion of colorectal cancer.MethodsImmunohistochemistry (IHC)was used to detect expression of CCDC12 in 94 cases of colorectal cancer and associated adjacent healthy tissues.Growth and invasion related proteins including CyclinD1, P21, nD1, P 1, matrix metall 9 (MMP-9), tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP-1)were also determined.Biological characteristics of cancer were recorded and correlated with concentrationsofCCDC12,CyclinD1,P21,MMP-9,TIMP-1 proteins.ResultsPositive expression rates of CCDC12,CyclinD1,MMP-9 and TIMP-1 in colorectal cancer tissues were significantly increased when compared with those in healthy tissues (χ2=38.480,30.312,38.368 and 7.667,respectively)(P< 0.01)while no significant difference was observed in concentration of P21 in the tissues (χ2=0.862,P=0.353).Intimate correlations of CCDC12 with characters of tumor such as differentiation,depth of invasion,lymphatic metastasis,and TNM stages(χ2=5.130,5.902,9.760 and 4.458;P=0.024,0.015,0.002 and 0.035,respectively)were observed.Spearman correlation analysisshowed thatthe expression ofCCDC12 was positively correlated with Cyclin D1 and MMP-9 (r=0.302 and 0.365,P=0.003 and 0.001,respectively)while negative correlation was found between CCDC12 and P21 (r=-0.287,P=0.005).ConclusionsCCDC12 is highly expressed in colorectal cancer,which affects Cyclin D1-,P21-and MMP-9-mediated growth and metastasis of colorectal cancer.

    colorectal cancer;CCDC12 gene;tumor growth;tumor invasion

    R735.3

    A

    10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.009

    1005-8982(2017)24-0044-05

    2017-01-10

    河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No:162777218)

    (王榮兵 編輯)

    猜你喜歡
    結(jié)構(gòu)域陽性率直腸癌
    蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域劃分方法及在線服務(wù)綜述
    腹腔鏡下直腸癌前側(cè)切除術(shù)治療直腸癌的效果觀察
    不同類型標(biāo)本不同時(shí)間微生物檢驗(yàn)結(jié)果陽性率分析
    重組綠豆BBI(6-33)結(jié)構(gòu)域的抗腫瘤作用分析
    直腸癌術(shù)前放療的研究進(jìn)展
    組蛋白甲基化酶Set2片段調(diào)控SET結(jié)構(gòu)域催化活性的探討
    COXⅠ和COX Ⅲ在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其臨床意義
    急性藥物性肝損傷患者肝病相關(guān)抗體陽性率調(diào)查及其臨床意義
    密切接觸者PPD強(qiáng)陽性率在學(xué)校結(jié)核病暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值
    肌電圖在肘管綜合征中的診斷陽性率與鑒別診斷
    人妻丰满熟妇av一区二区三区| 在线观看免费高清a一片| 99久久99久久久精品蜜桃| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 男人舔女人下体高潮全视频| 午夜福利在线免费观看网站| 一区二区三区精品91| 久久伊人香网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲 国产 在线| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产精品偷伦视频观看了| 欧美一级毛片孕妇| 成人永久免费在线观看视频| 国产野战对白在线观看| 久久精品影院6| 丝袜人妻中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产成人系列免费观看| 在线看a的网站| 无人区码免费观看不卡| 韩国av一区二区三区四区| 久久人人97超碰香蕉20202| 欧美激情 高清一区二区三区| 日韩av在线大香蕉| 国产片内射在线| a级毛片黄视频| 丁香欧美五月| 精品福利永久在线观看| 国产激情久久老熟女| 欧美性长视频在线观看| 国产三级在线视频| 国产成人精品在线电影| 十分钟在线观看高清视频www| 在线观看免费高清a一片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线免费观看的www视频| 久久久久久久精品吃奶| √禁漫天堂资源中文www| 高清欧美精品videossex| 自线自在国产av| 88av欧美| 中文字幕人妻熟女乱码| 可以在线观看毛片的网站| 不卡一级毛片| 国产免费现黄频在线看| 国产区一区二久久| 岛国在线观看网站| 在线永久观看黄色视频| 久久久久九九精品影院| 国产高清videossex| 国产精品免费视频内射| 国产三级在线视频| 91在线观看av| 国产成人欧美在线观看| tocl精华| 国产精品亚洲av一区麻豆| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产区一区二久久| 午夜日韩欧美国产| 黄色成人免费大全| 国产不卡一卡二| 91av网站免费观看| 大码成人一级视频| 曰老女人黄片| 1024香蕉在线观看| 久久性视频一级片| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 视频区欧美日本亚洲| 69精品国产乱码久久久| 中文字幕高清在线视频| 在线观看免费视频日本深夜| 国产免费av片在线观看野外av| 精品福利永久在线观看| 成人影院久久| 亚洲一区二区三区色噜噜 | 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产色视频综合| 日韩人妻精品一区2区三区| 99re在线观看精品视频| 欧美日韩精品网址| 99国产精品一区二区三区| 99国产精品99久久久久| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲情色 制服丝袜| 9色porny在线观看| 国产人伦9x9x在线观看| 两个人看的免费小视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 黄片播放在线免费| 一级毛片高清免费大全| 亚洲精品av麻豆狂野| 午夜免费鲁丝| 热99re8久久精品国产| 亚洲精华国产精华精| 日本免费a在线| 国产精品av久久久久免费| 久久人人精品亚洲av| 成人永久免费在线观看视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 久久久久久久久免费视频了| 日本三级黄在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美人与性动交α欧美软件| 天堂影院成人在线观看| 可以在线观看毛片的网站| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲国产欧美网| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 岛国在线观看网站| ponron亚洲| 新久久久久国产一级毛片| 色播在线永久视频| 黄色丝袜av网址大全| 欧美人与性动交α欧美软件| 午夜免费观看网址| 免费在线观看黄色视频的| 看片在线看免费视频| 亚洲 国产 在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 午夜福利免费观看在线| av网站在线播放免费| 成年版毛片免费区| 十八禁网站免费在线| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产激情欧美一区二区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 国产精品久久视频播放| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 又大又爽又粗| 丝袜美足系列| 巨乳人妻的诱惑在线观看| av超薄肉色丝袜交足视频| 最新美女视频免费是黄的| 亚洲成人久久性| 淫秽高清视频在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 黄色 视频免费看| 色综合站精品国产| 人妻久久中文字幕网| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲成人国产一区在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 色婷婷久久久亚洲欧美| 99精品欧美一区二区三区四区| 午夜精品在线福利| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 国产精品免费一区二区三区在线| 人人妻人人澡人人看| av电影中文网址| 久热这里只有精品99| 久久九九热精品免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 无遮挡黄片免费观看| 久久亚洲真实| 久久国产亚洲av麻豆专区| 涩涩av久久男人的天堂| www.www免费av| 久久青草综合色| 久久久久亚洲av毛片大全| а√天堂www在线а√下载| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美成人午夜精品| 日韩视频一区二区在线观看| 国产av一区在线观看免费| 999精品在线视频| 国产精华一区二区三区| 真人做人爱边吃奶动态| 久热这里只有精品99| 一区在线观看完整版| 亚洲欧美一区二区三区久久| 亚洲精品一二三| 99精品久久久久人妻精品| 香蕉久久夜色| 岛国视频午夜一区免费看| 国产麻豆69| 色老头精品视频在线观看| 亚洲,欧美精品.| 国产麻豆69| 老司机在亚洲福利影院| 亚洲精品粉嫩美女一区| 黑人猛操日本美女一级片| 久久婷婷成人综合色麻豆| 黄色视频,在线免费观看| 日韩欧美在线二视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久久久久久午夜电影 | 午夜福利,免费看| 69精品国产乱码久久久| 美女国产高潮福利片在线看| 国产三级黄色录像| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 成人av一区二区三区在线看| 人成视频在线观看免费观看| 91在线观看av| 亚洲av成人av| 国产激情久久老熟女| 悠悠久久av| 99精国产麻豆久久婷婷| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 欧美国产精品va在线观看不卡| 国产91精品成人一区二区三区| 国产成人av教育| 色老头精品视频在线观看| 亚洲精品美女久久av网站| www国产在线视频色| 一边摸一边做爽爽视频免费| 最近最新中文字幕大全免费视频| 麻豆一二三区av精品| av欧美777| 一区在线观看完整版| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲久久久国产精品| 国产97色在线日韩免费| 亚洲精品在线美女| 性色av乱码一区二区三区2| 两个人看的免费小视频| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 真人一进一出gif抽搐免费| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 美女高潮到喷水免费观看| 婷婷丁香在线五月| 成人国产一区最新在线观看| 一区二区三区精品91| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品电影一区二区三区| 国产一卡二卡三卡精品| 99久久综合精品五月天人人| 少妇粗大呻吟视频| 高清毛片免费观看视频网站 | 亚洲av成人av| 亚洲男人的天堂狠狠| 自线自在国产av| 日韩人妻精品一区2区三区| 色综合婷婷激情| 久久狼人影院| e午夜精品久久久久久久| 中文亚洲av片在线观看爽| 叶爱在线成人免费视频播放| 美女福利国产在线| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 制服诱惑二区| 久久国产精品影院| 亚洲黑人精品在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 亚洲中文av在线| 黄色丝袜av网址大全| 91成人精品电影| 午夜精品在线福利| 中文亚洲av片在线观看爽| 51午夜福利影视在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲精品一二三| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久人人精品亚洲av| 69精品国产乱码久久久| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 欧美一区二区精品小视频在线| 1024视频免费在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 日本a在线网址| 成人精品一区二区免费| 99在线人妻在线中文字幕| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲伊人色综图| 久久精品亚洲av国产电影网| 国产精品99久久99久久久不卡| av在线天堂中文字幕 | 国产主播在线观看一区二区| 女警被强在线播放| 色哟哟哟哟哟哟| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美成人免费av一区二区三区| 日韩免费av在线播放| 国产黄色免费在线视频| 欧美日韩精品网址| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产熟女xx| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| www.熟女人妻精品国产| 久久国产乱子伦精品免费另类| 久久香蕉激情| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99riav亚洲国产免费| 超碰成人久久| 香蕉丝袜av| 久久国产亚洲av麻豆专区| 99热只有精品国产| 伦理电影免费视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 久久久国产成人精品二区 | 狂野欧美激情性xxxx| 久久久久久人人人人人| 久久精品成人免费网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美成人性av电影在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美久久黑人一区二区| 亚洲激情在线av| 亚洲欧美精品综合久久99| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 热99re8久久精品国产| 黄色 视频免费看| a在线观看视频网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 91av网站免费观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日本免费a在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲精品美女久久av网站| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲激情在线av| 午夜成年电影在线免费观看| 日本 av在线| 欧美黄色淫秽网站| 国产欧美日韩一区二区三区在线| av福利片在线| 男人舔女人的私密视频| bbb黄色大片| 欧美日韩黄片免| 亚洲五月婷婷丁香| 亚洲三区欧美一区| 久久精品亚洲av国产电影网| 热re99久久精品国产66热6| 国产精品久久视频播放| 久久国产精品影院| 久久久久九九精品影院| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 电影成人av| 国产精品国产高清国产av| 日韩欧美免费精品| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 麻豆一二三区av精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 怎么达到女性高潮| 久久香蕉国产精品| 国产1区2区3区精品| 天堂动漫精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲av日韩精品久久久久久密| xxxhd国产人妻xxx| 老汉色av国产亚洲站长工具| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产一区二区三区综合在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲精品一二三| 级片在线观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 黄片播放在线免费| 久久久水蜜桃国产精品网| 黄片播放在线免费| 啦啦啦 在线观看视频| 免费在线观看日本一区| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲色图综合在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产99久久九九免费精品| 一进一出好大好爽视频| 9色porny在线观看| 日韩三级视频一区二区三区| 中文字幕高清在线视频| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久国产亚洲av麻豆专区| videosex国产| 久久精品国产综合久久久| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产有黄有色有爽视频| 岛国在线观看网站| 视频在线观看一区二区三区| 久久精品91蜜桃| 制服诱惑二区| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 一进一出抽搐动态| 久久久久亚洲av毛片大全| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产av在哪里看| 成人国语在线视频| 国产真人三级小视频在线观看| 老司机福利观看| av欧美777| 国产精品永久免费网站| 国产精品免费一区二区三区在线| 看免费av毛片| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 色精品久久人妻99蜜桃| 午夜两性在线视频| 国产av又大| 老熟妇仑乱视频hdxx| 在线观看免费午夜福利视频| 国产野战对白在线观看| 精品午夜福利视频在线观看一区| 黄色女人牲交| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产午夜精品久久久久久| 热re99久久国产66热| av在线天堂中文字幕 | 成人免费观看视频高清| 咕卡用的链子| а√天堂www在线а√下载| 成年版毛片免费区| 亚洲黑人精品在线| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 免费av毛片视频| 亚洲国产精品sss在线观看 | 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美性长视频在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 久久人人97超碰香蕉20202| 午夜福利欧美成人| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲欧美激情在线| 丝袜美腿诱惑在线| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产精品影院久久| 日韩大码丰满熟妇| av电影中文网址| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美黄色淫秽网站| 午夜视频精品福利| 国产有黄有色有爽视频| 人人澡人人妻人| 美女午夜性视频免费| 美女 人体艺术 gogo| 久久精品91蜜桃| 大香蕉久久成人网| 亚洲专区中文字幕在线| 久久草成人影院| avwww免费| 最新美女视频免费是黄的| 老汉色av国产亚洲站长工具| av电影中文网址| 交换朋友夫妻互换小说| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 色婷婷久久久亚洲欧美| a在线观看视频网站| 午夜视频精品福利| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲精品在线美女| 精品久久久久久电影网| 欧美日本亚洲视频在线播放| 人妻久久中文字幕网| 亚洲激情在线av| av国产精品久久久久影院| 国产免费现黄频在线看| 热99国产精品久久久久久7| 视频在线观看一区二区三区| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 长腿黑丝高跟| 黑人操中国人逼视频| 满18在线观看网站| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲自拍偷在线| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 久久久水蜜桃国产精品网| 香蕉久久夜色| 又大又爽又粗| 97碰自拍视频| www.精华液| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 色精品久久人妻99蜜桃| 国产高清视频在线播放一区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 少妇被粗大的猛进出69影院| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲性夜色夜夜综合| 水蜜桃什么品种好| 久9热在线精品视频| av中文乱码字幕在线| 成人三级做爰电影| 深夜精品福利| 亚洲国产欧美网| 夜夜爽天天搞| 少妇粗大呻吟视频| 色综合欧美亚洲国产小说| 亚洲激情在线av| 精品高清国产在线一区| 69av精品久久久久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 精品国产一区二区久久| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲色图综合在线观看| 国产成人精品无人区| 成人特级黄色片久久久久久久| 国产麻豆69| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 脱女人内裤的视频| 久久99一区二区三区| 精品一区二区三卡| xxx96com| 叶爱在线成人免费视频播放| 在线观看免费视频日本深夜| 性少妇av在线| 亚洲视频免费观看视频| 黑人操中国人逼视频| 色精品久久人妻99蜜桃| 韩国精品一区二区三区| 日韩欧美在线二视频| 国产一区二区在线av高清观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 成人手机av| 国产av在哪里看| 正在播放国产对白刺激| 天天添夜夜摸| 午夜两性在线视频| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | av网站免费在线观看视频| 欧美不卡视频在线免费观看 | 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲精品中文字幕在线视频| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产99白浆流出| 成人黄色视频免费在线看| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 精品熟女少妇八av免费久了| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99久久国产精品久久久| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲成a人片在线一区二区| 日韩成人在线观看一区二区三区| 精品欧美一区二区三区在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 精品日产1卡2卡| av视频免费观看在线观看| 欧美大码av| 欧美黄色片欧美黄色片| 精品国内亚洲2022精品成人| 日韩三级视频一区二区三区| 热re99久久国产66热| 中文字幕人妻丝袜制服| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线观看日韩欧美| 久久久久亚洲av毛片大全| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 99久久精品国产亚洲精品| 精品人妻1区二区| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲国产看品久久| 婷婷丁香在线五月| 一区福利在线观看| 伦理电影免费视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| xxxhd国产人妻xxx| 老汉色av国产亚洲站长工具| 日日爽夜夜爽网站| 午夜福利免费观看在线| 一本大道久久a久久精品| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 真人一进一出gif抽搐免费| 97碰自拍视频| 老司机午夜福利在线观看视频| 久热这里只有精品99| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 亚洲第一青青草原| 正在播放国产对白刺激| www.999成人在线观看| 色综合婷婷激情| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美乱妇无乱码| 久久人人97超碰香蕉20202| 狂野欧美激情性xxxx| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲在线自拍视频| 五月开心婷婷网| 欧美性长视频在线观看| 99热国产这里只有精品6| av欧美777| 亚洲午夜理论影院| 亚洲人成电影观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 国产99久久九九免费精品| 中亚洲国语对白在线视频| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲av熟女| 好男人电影高清在线观看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 好男人电影高清在线观看| 久久热在线av| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 两个人看的免费小视频| 人成视频在线观看免费观看| av天堂在线播放| 日韩欧美在线二视频| 国产精品一区二区三区四区久久 | 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 |