食管癌患者miR-182表達(dá)水平及其對預(yù)后的影響

魯之中 ，李軍民 ，胡云芝 ，李曉輝 ，李衛(wèi) ，姜富國 ，李帥 ，申辰

（河南省焦作市人民醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.兒科，3.腫瘤外科，河南 焦作 454002）

食管癌患者miR-182表達(dá)水平及其對預(yù)后的影響

魯之中1，李軍民1，胡云芝2，李曉輝3，李衛(wèi)1，姜富國1，李帥1，申辰1

（河南省焦作市人民醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科，2.兒科，3.腫瘤外科，河南 焦作 454002）

目的探討miR-182在食管癌患者組織中的基因表達(dá)及其對預(yù)后的影響。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測59例食管癌標(biāo)本和癌旁組織中miR-182表達(dá)水平；并分析其表達(dá)水平與患者的臨床病理特征和隨訪結(jié)局之間的關(guān)系。結(jié)果相較于癌旁組織，食管癌組織中miR-182表達(dá)水平增高（P＜0.05）；miR-182表達(dá)水平與腫瘤分化程度、浸潤深度、是否發(fā)生轉(zhuǎn)移以及臨床分期相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡以及腫瘤大小無關(guān)系（P＞0.05）；生存分析顯示miR-182高表達(dá)組總體生存期低于低表達(dá)組（P＜0.05）；Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示miR-182表達(dá)水平可作為食管癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志之一。結(jié)論miR-182在食管癌組織中高表達(dá)，其高表達(dá)提示預(yù)后較差，可作為食管癌潛在的預(yù)測分子標(biāo)志物。

miR-182；食管癌；預(yù)后；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

食管癌在我國屬于臨床常見惡性腫瘤之一，病死率高，危害較大，其病理類型＞90%為鱗癌。雖然根治性食管癌切除術(shù)+化療的治療方案已經(jīng)普及，但其5年總體生存率仍較低[1]。到目前為止，雖然分子生物學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)食管癌發(fā)生過程中大量異常出現(xiàn)的分子事件，但是針對食管癌高危人群篩選、早期診斷以及預(yù)后判斷的有效分子標(biāo)志物仍很有限。因此，更深入的研究和篩選食管癌早期診斷和預(yù)后判斷分子標(biāo)志物具有重要臨床意義。

MicroRNAs是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，主要通過與靶mRNA結(jié)合抑制其蛋白表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能[2]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在多種腫瘤，包括食管癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，因此其異常表達(dá)可能作為食管癌潛在的診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物。

近期研究發(fā)現(xiàn)，MicroRNA 182（miR-182）在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且其異常表達(dá)跟患者預(yù)后相關(guān)。JIAN等[3]發(fā)現(xiàn)食管癌細(xì)胞系KYSE410中miR-182上調(diào)，且食管癌患者血清中miR-182同樣高于正常對照，但食管癌組織中miR-182表達(dá)情況以及異常表達(dá)的miR-182跟食管癌患者預(yù)后是否相關(guān)尚不明確。本研究主要通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-182在食管癌標(biāo)本中的表達(dá)水平，并結(jié)合臨床病理及隨訪資料，探討miR-182在食管癌預(yù)后判斷中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 標(biāo)本來源 選取2011年2月-2013年2月本院手術(shù)切除并且常規(guī)HE染色確定為食管鱗癌患者的食管癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織，所有標(biāo)本均液氮凍存并存儲(chǔ)于-80℃冰箱中，后續(xù)用于提RNA。所有患者術(shù)前均未接受化療并且均簽署知情同意書。食管癌病理分型及分期標(biāo)準(zhǔn)按照國際抗癌聯(lián)盟（international union against cancer，UICC）食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。本研究經(jīng)焦作市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 患者資料 食管癌患者總共59例。其中，男性38例，女性21例；年齡44～79歲，中位年齡61歲；臨床分期Ⅰ、Ⅱ期36例，Ⅲ、Ⅳ期23例；中、高分化29例，低、未分化30例。

1.1.3 主要試劑及儀器 高速冷凍離心機(jī)（購自德國eppendorf公司）、nanodrop紫外分光光度計(jì)（購自美國nanoDrop公司）、PCR反應(yīng)儀（美國Bio Raid公司）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀（購自美國ABI公司）、miRcute miRNA isolation kit（購自北京天根公司）、miRNA逆轉(zhuǎn)錄及熒光定量試劑盒（購自日本TaKaRa公司）、has-miR-182及內(nèi)參RNU6B引物（購自美國金維智公司）。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 根據(jù)天根miRcute miRNA isolation kit試劑盒操作步驟，取0.1 g組織液氮保護(hù)下研磨，加入1 ml裂解液，加入氯仿抽提，并用過柱法分別提取腫瘤組織和癌旁組織總RNA。用紫外分光光度計(jì)測量RNA濃度及吸光度，要求A260/A280＞1.8。取1μl RNA溶液在1.5%的變性瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，測定RNA的完整性。

1.2.2 加尾法逆轉(zhuǎn)錄 取1μg總RNA使用Prime-Script miRNA cDNA合成試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，反應(yīng)體系為20μl，具體操作步驟見使用說明書。

1.2.3 miR-182表達(dá)水平檢測 用以上步驟獲得的cDNA進(jìn)行適當(dāng)稀釋，參照SYBR Premix Ex Taq kit試劑盒說明書進(jìn)行操作。反應(yīng)具體過程為：50℃激活聚合酶2 min，95℃預(yù)變性1 min；95℃變性5 s，60℃退火和延伸34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；結(jié)束后制作溶解曲線。采用管家基因U6作為內(nèi)參對照。

1.2.4 qRT-PCR結(jié)果分析 結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行處理，首先獲取miR-182和內(nèi)參U6的Ct值，然后計(jì)算ΔCt=Ct（miR-182）-Ct（U6），再計(jì)算ΔΔCt=ΔCt腫瘤組織-ΔCt癌旁組織，進(jìn)一步計(jì)算 miR-182在食管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)倍數(shù)的差異。

1.3 隨訪

所有食管癌術(shù)后患者均進(jìn)行電話隨訪，了解術(shù)后并發(fā)癥、復(fù)發(fā)以及生存情況等信息，隨訪截止日期為2016年5月，中位隨訪時(shí)間為29個(gè)月（5～42個(gè)月）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間miRNA-182表達(dá)倍數(shù)的均值差異采用配對樣本t檢驗(yàn)分析；miRNA-182與臨床病理特征的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，并繪制生存曲線；采用Cox回歸模型進(jìn)行多因素分析，其中α入=0.05，α出=0.10；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-182在食管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

結(jié)果顯示，食管癌腫瘤組織中miR-182表達(dá)水平（10.89±3.95）高于癌旁組織（6.34±2.91，P=0.000）。見圖 1。

2.2 miR-182的表達(dá)水平與食管癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系

根據(jù)miR-182的表達(dá)情況，將食管癌患者分為miR-182高表達(dá)（n=30）和低表達(dá)組（n=29）。食管癌組織中miR-182的表達(dá)水平與患者臨床病理特征間的關(guān)系見表1。miR-182的高表達(dá)跟食管癌患者腫瘤分化程度（P=0.042）、T分期（P=0.007）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況（P=0.001）以及臨床分期相關(guān)（P=0.001）；而跟患者性別（P=0.336）、年齡（P=0.436）以及腫瘤大小無關(guān)（P=0.110）。見表1。

圖1 miR-182在食管癌組織和癌旁組織中的相對表達(dá)量（n=59）

圖2 不同miR-182表達(dá)水平食管癌患者的生存分析

2.3 miR-182表達(dá)水平與食管癌患者預(yù)后的關(guān)系

miR-182高表達(dá)組中位生存時(shí)間（平均28.9個(gè)月）低于miR-182低表達(dá)組（36.1個(gè)月），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015）（見圖 2）。此外，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析結(jié)果顯示，T分期（P=0.060），臨床分期（P=0.687）以及分化程度（P=0.140）跟食管癌患者預(yù)后無關(guān)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.027）以及miR-182表達(dá)水平（P=0.032）是食管癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表2。

表1 食管癌組織中miR-182表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

表2 食管癌患者總生存期Cox多因素回歸分析相關(guān)參數(shù)

3 討論

食管癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，病死率較高，且預(yù)后較差。目前很多臨床病理學(xué)特征可作為食管癌患者預(yù)后的重要提示，但是其不能準(zhǔn)確且個(gè)體化預(yù)測患者預(yù)后情況[4]。因此，研究食管癌發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵分子生物學(xué)事件，尋找能早期診斷、靶向治療以及預(yù)后預(yù)測的重要分子標(biāo)記物具有重要臨床意義。

現(xiàn)已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)超過1 900條miRNAs，該miRNAs可調(diào)控超過60%基因功能[2]。在腫瘤研究中已證實(shí)異常表達(dá)的miRNAs可發(fā)揮促癌或者抑癌的作用；且該異常表達(dá)的miRNAs也可作為潛在的診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物[5]。近年來，食管癌中的研究發(fā)現(xiàn)越來越多異常表達(dá)的miRNAs；其中miR-21[6]、miR-192[7]和miR-106b等[8]上調(diào)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲轉(zhuǎn)移；miR-375[9]、miR-203 等[10]下調(diào)，可抑制腫瘤細(xì)胞周期并且促進(jìn)其凋亡。此外，miR-21[11]和miR-375[12]在食管癌預(yù)后判斷中的研究也已經(jīng)被證實(shí)。本研究主要就miR-182在食管癌中的表達(dá)以及其臨床意義就行探討。

本研究結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，miR-182在食管癌組織中表達(dá)上調(diào)。JIANG等[3]發(fā)現(xiàn)，食管癌細(xì)胞系KYSE410中miR-182上調(diào)，并且食管癌患者血清中miR-182同樣高于正常對照。以上結(jié)果提示miR-182在食管癌中具有癌基因的傾向。但是，目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-182在不同腫瘤中發(fā)揮不同的作用。在宮頸癌[13]、乳腺癌[14]以及肝癌[15]中，miR-182 可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展；但是在胃腺癌[16]和肺癌[17]中，miR-182可抑制腫瘤的進(jìn)展。由于miRNA的作用機(jī)制是通過和目的mRNA結(jié)合抑制其功能，其產(chǎn)生的總體生物學(xué)效應(yīng)依賴于其調(diào)控的不同基因之和，因此，同一miRNA在不同腫瘤中能發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。此外，檢測手段的差異以及腫瘤患者的異質(zhì)性也是miRNA不同生物學(xué)效應(yīng)產(chǎn)生原因。

此外，筆者發(fā)現(xiàn)miR-182的高表達(dá)跟食管癌分化程度、浸潤深度、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及臨床分期密切相關(guān)，生存分析結(jié)果顯示高表達(dá)miR-182患者預(yù)后較低表達(dá)患者差，且單因素和多因素回歸分析結(jié)果也證實(shí)miR-182的表達(dá)水平跟食管癌患者預(yù)后相關(guān)，以上結(jié)果提示miR-182在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，且具有一定的病情評估和預(yù)后判斷作用。JANG等[18]發(fā)現(xiàn)miR-182在黑色素瘤腫瘤組織表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平跟病理分級以及預(yù)后密切相關(guān)。LIU等[19]發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中高表達(dá)的miR-182跟腫瘤大小和腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可以作為預(yù)后判斷的有效指標(biāo)。

本研究主要從臨床角度去研究miR-182異常高表達(dá)與食管癌臨床特征的相關(guān)性，未進(jìn)一步從分子角度探討其促進(jìn)食管癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制。在多種腫瘤中，miR-182的促癌機(jī)制均有過報(bào)道。miR-182在成神經(jīng)管細(xì)胞瘤中可通過活化PI3K/Akt/mTOR通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[20]。在乳腺癌中，miR-182可抑制多種抑癌基因的表達(dá)，如BRCA1、FOXO1和FOXO3等[21-23]。而在葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞中，miR-182主要通過靶向調(diào)節(jié)MITF、BCL2或細(xì)胞周期蛋白D2起到抑癌基因的作用[24]。miR-182在食管癌中的研究不多，JIANG等發(fā)現(xiàn)miR-182可通過抑制MTSS1促進(jìn)食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[25]。miR-183和miR-182屬于同一家族，可能具有相似的生物學(xué)功能，研究也發(fā)現(xiàn)miR-183可通過調(diào)節(jié)食管癌細(xì)胞中PDCD4抑制其凋亡[26]。

綜上所述，miR-182在食管癌中的表達(dá)水平具有重要的臨床意義，其在腫瘤的發(fā)展過程中可能發(fā)揮癌基因的作用，并且可以作為一個(gè)潛在的獨(dú)立預(yù)測預(yù)后的因素。

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Expression of miRNA-182 and its effect on prognosis of esophageal carcinoma

Zhi-zhong Lu1,Jun-min Li1,Yun-zhi Hu2,Xiao-hui Li3,Wei Li1,Fu-guo Jiang1,Shuai Li1,Chen Shen1
(1.Department of Laboratory,2.Department of Pediatrics,3.Department of Surgical Oncology,People's Hospital of Jiaozuo,Jiaozuo Henan 454002,China)

ObjectiveTo investigate the concentration of miRNA-182 in esophageal carcinoma and its association with disease prognosis.MethodsMicroRNA-182 in 59 esophageal carcinoma tissues and related adjacent healthy tissues were measured by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCT).Association of miRNA-182 with clinical characters including pathologic types,and clinical outcome was determined.ResultsThe concentration of miRNA-182 in esophageal carcinoma tissues was significantly increased when compared with that in adjacent healthy tissues (P＜0.05).Overexpression of miRNA-182 correlated closely with tumor differentiation level,depth of infiltration,metastasis,and clinical stage(P＜0.05).Kaplan-Meier survival analysis indicated that patients with high miRNA-182 experienced worse outcome compared with others(P＜0.05).Moreover,multivariate analysis showed that increase of miRNA-182 was an independent predictor of overall survival(P＜0.05).ConclusionsMicroRNA-182 is overexpressed in esophageal carcinoma tissue and concentration of miRNA-182 is closely correlated with poor outcome,suggesting that miRNA-182 may serve as a prognostic biomarker for esophageal carcinoma.

miRNA-182;esophageal carcinoma;prognosis factor;qRT-PCR

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.008

1005-8982（2017）24-0039-05

2017-03-30

（王榮兵 編輯）