二氫楊梅素對(duì)裸鼠腹腔移植人胃癌細(xì)胞中Caveolin-1表達(dá)的影響*

王佑權(quán)，張帆，周壽紅

（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腫瘤外科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，湖南 衡陽(yáng) 421001）

二氫楊梅素對(duì)裸鼠腹腔移植人胃癌細(xì)胞中Caveolin-1表達(dá)的影響*

王佑權(quán)1，張帆1，周壽紅2

（1.南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腫瘤外科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，湖南 衡陽(yáng) 421001）

目的觀察二氫楊梅素（DMY）對(duì)裸鼠腹腔移植人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用及對(duì)腹腔瘤組織中Caveolin-1表達(dá)的影響。方法復(fù)制人胃癌腹腔移植的裸鼠模型。將復(fù)模成功的24只裸鼠隨機(jī)分為4組，即移植瘤模型組，DMY低、中及高劑量處理組。分別觀察荷瘤裸鼠的腹腔移植瘤的生長(zhǎng)和成瘤情況，測(cè)量腫瘤的重量、長(zhǎng)短徑并計(jì)算腫瘤的體積。采用免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測(cè)人胃癌腹腔移植瘤腹腔瘤體中Caveolin-1和Ki67的表達(dá)。結(jié)果與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤成瘤個(gè)數(shù)，腹腔瘤體的重量及腹腔瘤體的體積均降低，呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05），裸鼠的食欲、活動(dòng)情況和精神狀態(tài)等一般情況改善。與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤體表達(dá)Caveolin-1的陽(yáng)性細(xì)胞百分率和Caveolin-1的蛋白表達(dá)水平均增加，呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）；而Ki67的陽(yáng)性細(xì)胞百分率和Caveolin-1的蛋白表達(dá)水平均降低，也呈現(xiàn)劑量依賴性（P＜0.05）。結(jié)論二氫楊梅素以劑量依賴的方式抑制人胃癌腹腔移植瘤的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Caveolin-1的表達(dá)有關(guān)。

二氫楊梅素；胃癌；裸鼠；腹腔移植瘤；小凹蛋白-1

在我國(guó)每年約有36萬(wàn)人死于胃癌，占女性惡性腫瘤死因的第2位，男性的第3位[1]。胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因，進(jìn)行過(guò)胃癌根治性術(shù)的患者，其5年生存率也只有30%左右[2]。因此，抑制胃癌浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是提高胃癌患者的生存率及生活質(zhì)量的主要任務(wù)。然而目前，盡管在防治腫瘤轉(zhuǎn)移的方面開展大量的研究，但效果仍然不理想。近年來(lái)，中醫(yī)藥腫瘤防治領(lǐng)域中作用和優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受到人們的關(guān)注。藤茶是一種廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南地區(qū)的藥食兩用植物，長(zhǎng)期用作茶類植物和中草藥。二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種二氫黃酮醇類化合物，主要從藤茶莖葉中提取。DMY具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、止咳及調(diào)節(jié)免疫功能等作用[3-4]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，DMY具有抗腫瘤的作用，研究顯示DMY以劑量依賴的方式誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549細(xì)胞的凋亡，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)而上調(diào)Bax的表達(dá)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，DMY[100 mg/（kg·d）]灌胃處理減少小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移瘤的瘤重和轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量[6]。Caveolae-1是Caveolae的標(biāo)志性蛋白，Caveolin-1通過(guò)磷酸化與去磷酸化的方式與基質(zhì)金屬蛋白酶、Paxilli和E-鈣粘蛋白等信號(hào)分子產(chǎn)生相互作用，參與腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、凋亡及遷移等過(guò)程的調(diào)控[7-8]。研究顯示，抑制Caveolin-1的表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增生[9]。因此，本研究擬觀察DMY對(duì)裸鼠腹腔移植人胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并從Caveolin-1的角度探討其可能的機(jī)制，為胃癌的的防治提供新的靶點(diǎn)和策略。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

人胃低分化黏液腺癌細(xì)胞株MGC-803細(xì)胞（由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供），DMY（購(gòu)自成都曼斯特生物科技公司），DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清（購(gòu)自Hyclone公司），免疫組織化學(xué)（免疫組織化學(xué)）染色試劑盒（購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司），BCA蛋白定量試劑（購(gòu)自Invitrogen公司），一抗兔抗人Caveolin-1單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取35只4周齡雄性裸鼠，體重16～18 g/只，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2015～0001，飼養(yǎng)于本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無(wú)特殊病原體（SPF）級(jí)實(shí)驗(yàn)室（許可證號(hào)：SYXK（湘）2010～0006）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與人胃癌裸鼠腹腔種植模型的復(fù)制

采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人胃低分化黏液腺癌細(xì)胞株MGC-803細(xì)胞，在37℃、5%二氧化碳CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整密度為 5×107個(gè) /ml，按 0.2 ml/只（約為 1×107個(gè)細(xì)胞）將細(xì)胞懸液注射到裸鼠的腹腔內(nèi)，正常對(duì)照裸鼠組腹腔注射等量的生理鹽水。操作完成后裸鼠均正常喂養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將復(fù)模成功的裸鼠隨機(jī)分為4組，即移植瘤模型組，DMY低、中及高劑量處理組，每組6只。接種后第18天開始藥物處理，DMY低、中和高劑量分別按50、100和200 mg/（kg·d）灌胃給藥。對(duì)照組裸鼠，給予相同體積的生理鹽水灌胃處理。DMY組每天給藥1次，連續(xù)30 d。觀察并記錄裸鼠的情況（外觀、精神、飲食、活動(dòng)情況和全身改變情況）以及裸鼠腹腔移植瘤生長(zhǎng)情況。末次給藥后7 d處死裸鼠。開腹解剖，取出腹腔瘤體，稱量其重量，腹腔瘤體的長(zhǎng)短徑，計(jì)算腹腔瘤體的體積。計(jì)算抑瘤率=（移植瘤模型組的瘤重-處理組的瘤重）/移植瘤模型組的瘤重×100%。

1.5 HE染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)

腹腔瘤體甲醇固定后進(jìn)行石蠟切片和HE染色，光鏡下觀察形態(tài)學(xué)的變化。石蠟切片在脫蠟后，通過(guò)煮沸修復(fù)抗原，脫脂奶粉封閉，一抗（1∶200）孵育，在4℃條件下過(guò)夜。清洗后二抗孵育，在37℃30 min，DAB顯色，鏡下控制反應(yīng)，及時(shí)終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，烘干，透明，封片，顯微鏡下觀察拍照記錄結(jié)果。Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度，進(jìn)行半定量分析。

1.6 Western blot檢測(cè)

取適量的腹腔瘤體放入碾缽中，加入蛋白裂解液，按試劑盒說(shuō)明提取組織總蛋白。測(cè)定樣本的蛋白濃度，2×SDS凝膠加樣緩沖液溶解蛋白樣本，煮沸。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜用10%脫脂牛奶封閉非特異性抗原，在室溫下孵育2 h。加入兔抗人Caveolin-1（1∶400）、Ki67 和 β-actin（1∶1000）的一抗，4℃下孵育過(guò)夜。清洗后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，4℃下繼續(xù)孵育4 h。洗膜后用ECL法顯色并曝光成像于X線，經(jīng)顯影、定影后，以β-actin作為內(nèi)參照，應(yīng)用凝膠圖像分析軟件對(duì)膠片掃描，分析目的蛋白的表達(dá)水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠的一般情況觀察

在接種后15d，移植瘤模型組的裸鼠腹部可捫及瘤結(jié)節(jié)，隨著時(shí)間的增長(zhǎng)，捫及的瘤結(jié)節(jié)不斷增大，30 d時(shí)就可用注射器從腹腔中抽出少量血性腹水，裸鼠的腹部隆起越來(lái)越明顯，裸鼠的食欲明顯減退、活動(dòng)明顯減少、出現(xiàn)精神萎靡和體重減輕等情況。將裸鼠解剖后觀察到裸鼠腹腔內(nèi)有明顯血性腹水，肝周、腸系膜、網(wǎng)膜、橫膈、腹膜、腹壁和盆腔等地方可見灰白色0.1～3.0 cm大小不等的腫瘤結(jié)節(jié)，質(zhì)地較硬，結(jié)節(jié)與周圍組織有粘連，部分出現(xiàn)壞死，表明腫瘤移植成功，腹腔移植成功率為100%。與移植瘤模型組比較，DMY中及高劑量處理組腹部可捫及瘤結(jié)節(jié)較小，30 d時(shí)不能從腹腔中抽出血性腹水，裸鼠腹部隆起較小，裸鼠食欲和活動(dòng)情況正常，精神狀態(tài)良好。而DMY低劑量處理組組與移植瘤模型組以上癥狀無(wú)差異。見圖1、2。

2.2 DMY對(duì)人胃癌腹腔移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

各組腹腔移植瘤成瘤個(gè)數(shù)、瘤體的重量和體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.763、34.192和 48.114，P=0.001、0.011和0.001）。與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤成瘤個(gè)數(shù)（t=3.751和 4.762，均P=0.001），瘤體的重量及體積均降低（均P＜0.05），呈現(xiàn)劑量依賴性。50mg/（kg·d）DMY低劑量組與移植瘤模型組成瘤個(gè)數(shù)（t=0.773，P=0.542），瘤體的重量（t=1.152，P=0.363）及最大瘤體的體積（t=1.041，P=0.413）均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。50、100 和 200 mg/（kg·d）DMY 的抑瘤率分別為5.76%、38.43%和41.29%，提示高、中劑量的DMY對(duì)人胃癌腹腔移植瘤有抑制作用。見圖3。

圖1 各組裸鼠腹部外觀

圖2 各組裸鼠腹部解剖情況

2.3 DMY對(duì)人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Ki67表達(dá)的影響

采用免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Ki67的表達(dá)，各組表達(dá)Ki67的陽(yáng)性細(xì)胞百分率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=24.632，P=0.001）。見圖4A、B。與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤體表達(dá)Ki67的陽(yáng)性細(xì)胞百分率降低，呈現(xiàn)劑量依賴性（均P＜0.05）。與移植瘤模型組比較，100和200mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤體中Ki67的表達(dá)水平降低，呈現(xiàn)劑量依賴性（均P＜0.05）。見圖4C、D。

2.4 DMY對(duì)人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Caveolin-1表達(dá)的影響

采用免疫組織化學(xué)和Westernblot檢測(cè)人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Caveolin-1的表達(dá)，各組表達(dá)Caveolin-1的陽(yáng)性細(xì)胞百分率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=32.541，P＜0.05）。見圖 5A、B。與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤表達(dá)Caveolin-1的陽(yáng)性細(xì)胞百分率增加（均P＜0.05），呈現(xiàn)劑量依賴性。與移植瘤模型組比較，100和200 mg/（kg·d）DMY中、高劑量組腹腔移植瘤中Caveolin-1的表達(dá)水平增加（均P＜0.05），呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖5C、D。

圖3 DMY對(duì)人胃癌腹腔移植瘤腹腔成瘤個(gè)數(shù)、瘤重和瘤體積的影響及腫瘤抑制率

圖4 人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Ki67的表達(dá) （×400）

圖5 人胃癌腹腔移植瘤瘤體中Caveolin-1的表達(dá)（×400）

3 討論

隨著社會(huì)和生活壓力的增加以及飲食結(jié)構(gòu)和環(huán)境的變化，胃癌的發(fā)病率一直居高不下，而發(fā)病的年齡呈現(xiàn)出年輕化的態(tài)勢(shì)[10-11]。手術(shù)切除腫塊依然是目前胃癌的主要治療手段，但手術(shù)后有50%的患者在5年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12]。胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因是術(shù)前已經(jīng)存在于腹腔的微小轉(zhuǎn)移灶和手術(shù)過(guò)程中產(chǎn)生的游離的癌細(xì)胞。因此提高胃癌患者的生存率和生存質(zhì)量的關(guān)鍵是有效預(yù)防和及時(shí)治療腫瘤的腹腔轉(zhuǎn)移。

DMY是一種在藤茶中的含量較高的黃酮類化合物，也大量地存在于葡萄、楊梅和蔬菜中。DMY具有廣泛的藥理作用，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)DMY具有抗腫瘤的功效。研究顯示，DMY能升高肺癌細(xì)胞系A(chǔ)GZY-83-a細(xì)胞中Caspase-3的活性和鈣離子濃度，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。DMY也抑制肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)其細(xì)胞凋亡[14]。DMY還能抑制小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞的增殖、高轉(zhuǎn)移型乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞的增殖[15-16]。DMY也能抑制在體腫瘤的生長(zhǎng)，DMY能減少小鼠乳腺癌肺轉(zhuǎn)移腫瘤的重量和肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量[6]。DMY能抑制人肺癌GLC 82裸鼠移植瘤和人肝癌Bel27402裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，中、高劑量DMY能改善裸鼠的食欲、活動(dòng)情況和精神狀態(tài)等一般情況，能降低裸鼠的腹腔移植瘤成瘤個(gè)數(shù)，腹腔瘤體的重量及腹腔瘤體的體積。本結(jié)果表明，DMY有抗胃癌腹腔轉(zhuǎn)移作用，并可抑制胃癌腹腔轉(zhuǎn)移瘤生的長(zhǎng)。Ki67是一種核抗原，與細(xì)胞增殖特異性相關(guān)。靜止期的細(xì)胞不表達(dá)Ki67，而增殖期細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，常用來(lái)評(píng)估細(xì)胞的增殖水平。本研究結(jié)果也顯示中、高劑量DMY降低裸鼠腹腔移植瘤體中表達(dá)Ki67的陽(yáng)性細(xì)胞百分率和Ki67的蛋白表達(dá)水平，提示DMY可能是通過(guò)抑制胃癌細(xì)胞增殖，而發(fā)揮其抗胃癌效應(yīng)的，但是其詳細(xì)機(jī)制不清楚。

Caveolin-1是1個(gè)抑癌基因，通過(guò)磷酸化和去磷酸化的方式與很多信號(hào)分子發(fā)生相互作用，參與腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖、凋亡和遷移等生物學(xué)行為的控制。研究顯示，在肉瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和卵巢癌等多種惡性腫瘤中Caveolin-1的表達(dá)均降低[18]。非貼壁依賴性生長(zhǎng)（anchorage-independent cell growth，AICG）是惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞及具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)特征。具有AICG特征的細(xì)胞可表現(xiàn)為細(xì)胞伸展出片層偽足，生長(zhǎng)過(guò)程中未接觸性抑制，AICG與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1高表達(dá)于人乳腺癌細(xì)胞中可以抑制其AICG的特性[19]。研究顯示，在乳腺癌細(xì)胞中存在132位密碼子突變，而將突變型Caveolin-1基因?qū)隢IH 3T3細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)可使NIH 3T3細(xì)胞獲得AICG的特性，細(xì)胞的侵襲能力也增強(qiáng)[20]。在本研究中結(jié)果顯示，與移植瘤模型組比較，中、高劑量DMY組裸鼠腹腔移植瘤體中表達(dá)Caveolin-1的陽(yáng)性細(xì)胞百分率和Caveolin-1的蛋白表達(dá)水平均增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。

總之，本研究結(jié)果表明，二氫楊梅素以劑量依賴的方式抑制人胃癌腹腔移植瘤的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與上調(diào)Caveolin-1的表達(dá)有關(guān)。

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Effect of Dihydromyricetin on caveolin-1 in nude mouse models of human gastric cancer*

You-quan Wang1,Fan Zhang1,Shou-hong Zhou2
(1.Department of Oncological Surgery,the Second Hospital of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China;2.Department of Physiology,Medical College of University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

ObjectiveTo investigate inhibitory effect of Dihydromyricetin (DMY)on the growth of gastric cancer and expression of caveolin-1 in nude mouse models of human gastric cancer.MethodsNude mouse models of peritoneal transplanted human gastric cancer was established.Twenty-four successfully transplanted nude mice were randomly divided into 4 groups:tumor group,tumor with low dose group[50 mg/（kg·d）],moderate dose group[100 mg/（kg·d）]and high dose group[200 mg/（kg·d）]of DMY.The growth rate and tumorsize were monitored.The expression levelsofcaveolin-1 and Ki67 so caveolin-1 lin 1 by Immunohistochemistry and Western blot.ResultsThe number,weight,and volume of tumors were significantly decreased in both tumor with moderate and high dose groups dose dependently when compared with the tumor group(P＜0.05).The appetite,activity and mental state of animals in the tumor with moderate and high dose groups were significantly improved in comparison with the tumor group.Immunohistochemistry and Western blot data indicated that the percentage of Caveolin-1 positive cells and expression level of proteinCaveolin-1 were significantly increased in the tumor with moderate and high dose groups when compared with the tumor group dose dependently (P＜0.05).Similarly,the percentage of Ki67 positive cells and expression level were significantly increased in the moderate and high dose groups when compared with the tumor group dose dependently (P＜0.05).ConclusionsDMY inhibits the growth of peritoneal transplanted human gastric cancer in dose dependent manner and the mechanism may be related to upregulation of Caveolin-1.

Dihydromyricetin;gastric cancer;nude mice;peritoneal transplantable tumor;Caveolin-1

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.24.003

1005-8982（2017）24-0011-06

2017-07-11

湖南省教育廳科研項(xiàng)目（No：11c1108）

周壽紅，E-mail：zhoushouhong@126.com

（王榮兵 編輯）