尿酸酶自組裝空心納米微球體外穩(wěn)定性

鄧 雪， 胡雪原， 何 丹， 晏子俊， 周云莉， 張景勍

（重慶醫(yī)科大學 藥學院，重慶 400016）

尿酸酶自組裝空心納米微球體外穩(wěn)定性

鄧 雪， 胡雪原， 何 丹， 晏子俊， 周云莉， 張景勍*

（重慶醫(yī)科大學 藥學院，重慶 400016）

制備載尿酸酶（Uricase，UOX）聚乙二醇-透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid-graft-poly（ethylene glycol），HA-g-PEG）/羥丙基-β-環(huán)糊精（Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin，HPCD）自組裝空心納米微球（HA-g-PEG/HPCD self-assembly hollow spheres encapsulated uricase，UHPHD），并研究其體外穩(wěn)定性。制備UHPHD，并測定其包封率、粒徑及Zeta電位。再分別從最適溫度、最適pH、熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和抗胰蛋白酶水解能力初步考察游離UOX和UHPHD的差異。結(jié)果：UHPHD的包封率為（62.17±2.94）%，粒徑和Zeta電位分別為（299.60±13.05）nm和（-45.10±2.75）mV。UHPHD和UOX最適溫度均為40℃，最適pH均為8.5。體外穩(wěn)定性結(jié)果顯示，UHPHD的體外穩(wěn)定性明顯高于UOX。

尿酸酶；穩(wěn)定性；自組裝空心納米微球

尿酸是機體嘌呤代謝的終產(chǎn)物，經(jīng)腎臟隨尿液排出體外。尿酸及其鹽類在水中溶解度很低，在某些病理情況下，由于嘌呤代謝紊亂，血液中尿酸積累過多，會導致高尿酸血癥，繼而引發(fā)痛風綜合癥[1]。尿酸酶（Uricase，UOX）能夠催化尿酸氧化生成尿囊素、過氧化氫和二氧化碳[2]。UOX專一性強，催化效率高，能夠在短時間內(nèi)有效降低患者體內(nèi)的尿酸水平[3]。20世紀90年代，尿酸酶已作為治療痛風的藥物首先在歐洲上市。但是作為一種外源性的蛋白質(zhì)，UOX存在著易被體內(nèi)酶水解，穩(wěn)定性低、半衰期短等蛋白質(zhì)藥物的共同缺點，更嚴重的是它還存在著抗原性較強，易產(chǎn)生過敏反應(yīng)等問題，因此大大限制了其臨床使用[4]。

自組裝空心納米微球是一種新型的藥物載體。Ha等[5]人將L-天冬酰胺酶包載于海藻酸鈉-聚乙二醇/α-CD形成的空心納米囊中。由于形成的囊膜具有半滲透性，酶的底物和催化產(chǎn)物能順利通過囊膜，而酶不能自由通過從而提高了酶的穩(wěn)定性、拓寬了酶的最適溫度和最適pH。為了克服UOX的缺點，擴大其臨床應(yīng)用，作者以聚乙二醇-透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid-graft-poly ethylene glycol，HA-g-PEG）/羥 丙 基 -β-環(huán) 糊 精 （Hydroxypropyl-betacyclodextrin，HPCD）為載體，自組裝形成空心納米微球（HA-g-PEG/HPCD self-assembly hollow spheres encapsulated uricase，UHPHD）， 并 著 重 考 察 了UHPHD的體外穩(wěn)定性，為臨床用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

UOX：美國Sigma公司；尿酸：英國 Alfa Aesar公司；羥丙基-β-環(huán)糊精：武漢國邦達醫(yī)藥化工有限公司；乙醚為分析純。

AB204S電子分析天平：瑞士Mettler Toledo儀器公司；RE 52 AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；TGL-16B臺式高速離心機：上海安亭科學儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；UV-7504 PC型紫外分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；ZS90型激光粒度電位儀：英國馬爾文公司；PHS-3C型pH計：上海精密科學儀器有限公司；KQ-2200B型水浴型超聲儀：江蘇昆山市超聲儀器有限責任公司；Sephadex G-200層析柱：上?？笊锛夹g(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 UHPHD的制備 采用Meng等[6]的方法制備UHPHD。先配制1.0%的HA-g-PEG溶液和6.0%的HPCD溶液；將一定量的UOX加入到2 mL的HA-g-PEG溶液中，緩慢溶解；然后將2 mL含有UOX的HA-g-PEG溶液緩慢滴加入6 mL的HPCD溶液中。開始滴加時，溶液變輕微的渾濁，表明開始有空心納米球形成，繼續(xù)在10℃條件下磁力攪拌2 h，即得 UHPHD。

1.2.2 UHPHD的包封率的測定 按照參考文獻報道方法，采用凝膠柱分離-考馬斯亮藍法[7]測定包封率。吸取0.5 mL的UHPHD，上Sephadex G-200層析柱，用pH 8.5的Bicine-NaOH緩沖液以1 mL/min流速洗脫分離UHPHD和UOX。接收UHPHD部分，取其中100 μL，加入乙醚破乳后，再加入考馬斯亮藍，在595 nm波長處測定吸收度值（AUHPHD）。以同法處理的未過柱的UHPHD，同法測定吸收度值（A總）。包封率（%）=AUHPHD/A總×100%，重復3次。

1.2.3 UHPHD的粒徑和Zeta電位的測定 取少量UHPHD混懸液，以1∶10比例稀釋3倍后，在25℃下用激光粒度電位儀測定UHPHD的粒徑和Zeta電位。

1.2.4 UHPHD和UOX最適溫度和最適pH的測定將尿酸溶于50 mmol/L硼酸-硼砂（pH 8.5）緩沖液中，分別于20～70℃的水浴中預熱10 min后，在25℃下按照Zhou等[8]方法測定UHPHD和UOX的活性，繪制溫度-活性曲線圖。在硼酸緩沖體系中分別配制pH 6.5～9.5的尿酸溶液，分別在最適溫度條件下預熱10 min后測定UHPHD和UOX的活性，繪制pH-活性曲線圖。

1.2.5 UHPHD和UOX熱穩(wěn)定性的測定 分別取UHPHD和UOX各2 mL，置于55℃的水浴中，在第0、1、2、3、4、5 小時取 200 μL，測定 UHPHD 和 UOX的活性，結(jié)果以活性保留百分數(shù)進行計算。

1.2.6 UHPHD和UOX貯存穩(wěn)定性的測定 將UHPHD和UOX（UOX的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL）避光密封貯存于 4 ℃條件下， 分別于第 0、1、2、4、7、10、14、20、28天取出， 測定 UHPHD 和 UOX 的活性，結(jié)果以活性保留百分數(shù)進行計算。

1.2.7 UHPHD和UOX酸堿穩(wěn)定性的測定 分別取UHPHD和UOX（UOX的質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL）100 μL， 加入 pH 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5的緩沖液稀釋3倍，置于40℃水浴中放置40 min，取出測定UHPHD和UOX的活性。以UHPHD在pH 8.5時的酸堿穩(wěn)定性測定結(jié)果為100%，計算其余各點的相對活性。

1.2.8 UHPHD和UOX抗胰蛋白酶水解能力的測定 分別取1 mL UHPHD和UOX（UOX質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL），加入等體積0.2 mg/mL胰蛋白酶溶液混合，然后置于 37 ℃水浴中，在 0、10、20、30、40、50、60 min分別取出，測定UHPHD和UOX的活性，結(jié)果以活性保留百分數(shù)進行計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 UHPHD的包封率、粒徑及Zeta電位

制備3批UHPHD，經(jīng)檢測，平均包封率為（62.17±2.94）%，平均粒徑為（299.60±13.05）nm，Zeta電位為（-45.10±2.75）mV。UHPHD的粒徑分布和電位見圖1。

圖1 UHPHD的粒徑分布圖和zeta電位分布圖Fig.1 Size distribution profiles and zeta potential profiles of UHPHD

2.2 UHPHD和UOX的最適溫度

UHPHD和UOX的最適溫度均為40℃，如圖2所示。結(jié)果顯示，UHPHD在20～70℃ 時活性均高于UOX，其中40℃時UHPHD活性是UOX的116.31%。

2.3 UHPHD和UOX的最適pH值

pH測定結(jié)果見圖3。UHPHD和UOX的pH從5.0到8.5時，活性逐漸升高，從pH 8.5到pH 9.5時活性逐漸降低，故UHPHD和UOX的最適pH值為8.5。此時，UHPHD活性是UOX的1.4倍。在pH 5.0～9.5范圍內(nèi)，UHPHD的活性均高于游離UOX，表明UHPHD能明顯提高UOX的活性。

圖2 UHPHD和游離UOX的最適溫度（n=3）Fig.2 Optimal temperature of UHPHD and free UOX，（n=3）

圖3UHPHD和游離UOX的最適pH（n=3）Fig.3 Optimal pH of UHPHD and free UOX（n=3）

2.4 UHPHD和UOX熱穩(wěn)定性的測定

UHPHD和UOX的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果見圖4，UHPHD在55℃水浴中放置5 h后，酶活性仍保持為80%以上，而UOX在相同的條件下，活性由100%下降到16.76%。3 h時，UOX活性下降到50%以下，而UHPHD酶活性仍保留為85.31%。

圖4 UHPHD和游離UOX的熱穩(wěn)定性（n=3）Fig.4 Thermal stabilities of UHPHD and free UOX（n=3）

2.5 UHPHD和UOX貯存穩(wěn)定性的測定

UHPHD和UOX的貯存穩(wěn)定性測定的結(jié)果見圖5。在4℃避光密封貯存條件下，UHPHD的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于UOX。當游離UOX在第28天活性保留值降至23.72%時，UHPHD仍保留有57.78%的活性；UHPHD在第10天時活性保留值為81.66%時，游離UOX則低于50%。綜上，UHPHD有更好的貯存穩(wěn)定性。

圖5 4℃條件下UHPHD和UOX貯存穩(wěn)定性的測定（n=3）Fig.5 Storage stabilities of UHPHD and free UOX incubated at 4 ℃（n=3）

2.6 UHPHD和UOX酸堿穩(wěn)定性的測定

UHPHD和UOX的酸堿穩(wěn)定性測定結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示，在pH 5.0～9.5中，UHPHD活性保留最小值為55.64%，游離UOX活性保留最大值僅為66.77%，最小值為20.47%。在此pH范圍內(nèi)，UHPHD活性保留值均高于UOX。表明UHPHD較游離UOX有更好的耐溶液酸堿變化的能力。

圖6 UHPHD和UOX酸堿穩(wěn)定性的測定（n=3）Fig.6 pH stabilities of UHPHD and free UOX（n=3）

2.7 UHPHD和UOX抗胰蛋白酶水解能力的測定

UHPHD和UOX的抗胰蛋白酶水解能力測定見圖7。UOX的酶活性快速下降，在60 min時，活性僅保留了10.33%，幾乎喪失活性。相反，UHPHD活性仍保留在50%以上，表明UHPHD相比于UOX有更好的抗酶解能力。

圖7UHPHD和UOX抗胰蛋白酶水解能力的測定Fig.7 Proteolytic stabilities of UHPHD and free UOX

3 結(jié)語

本研究表明，UOX熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和抗胰蛋白酶水解能力均明顯低于UHPHD，其原因可能是酶蛋白中的反應(yīng)基團或者蛋白質(zhì)中的一些高級結(jié)構(gòu)直接暴露于外部環(huán)境中。過高或者過低的溫度、過酸或者過堿的環(huán)境、貯存時間的延長以及胰蛋白酶的水解使得酶分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和性質(zhì)改變，導致酶活力的降低甚至喪失。據(jù)報道，Li等[9]將葡萄糖氧化酶包裹于羧甲基魔芋苷葡聚糖-聚乙二醇/α-環(huán)糊精自組裝形成的納米球中，提高了葡萄糖氧化酶的穩(wěn)定性，且載體膜具有半滲透性及生物相容性。作者制備的HA-g-PEG/HPCD自組裝空心納米微球是一種新型的藥物載體，將UOX包裹于HA-g-PEG/HPCD自組裝空心納米微球后，由于載體對酶蛋白具有一定的保護作用，降低了外界環(huán)境變化引起的酶分子構(gòu)象改變的幾率，因而使得酶的穩(wěn)定性獲得了提高。

作者從熱穩(wěn)定性、貯存穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性和抗胰蛋白酶水解能力方面分別對UHPHD和UOX的體外穩(wěn)定性進行了研究，豐富了UOX的研究內(nèi)容，也為UHPHD的體內(nèi)研究奠定了良好的基礎(chǔ)。由本研究可看出，UHPHD有提高UOX體外穩(wěn)定性的優(yōu)點。

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會議名稱(中文)：第九屆中國工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇

所屬學科：生物技術(shù)與生物工程

開始日期：2017-11-06

結(jié)束日期：2017-11-08

所在城市：天津市 和平區(qū)

主辦單位：中國科學院科技促進發(fā)展局、中國生物工程學會

承辦單位：中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所、中科育成（天津）科技發(fā)展有限公司

聯(lián)系人：吳崇明

聯(lián)系電話：022-24828776

E-MAIL：biocap@tib.cas.cn

會議網(wǎng)站：http://www.cas.cn/xs/201707/t20170710_4608053.shtml

會議背景介紹：“中國工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇”是中國科學院科技促進發(fā)展局聯(lián)合國家發(fā)改委高技術(shù)產(chǎn)業(yè)司、科技部中國生物技術(shù)發(fā)展中心、中國生物工程學會等部門和單位共同精心打造的國內(nèi)唯一集政府、企業(yè)、科研、教育、金融等元素為一體的工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域品牌盛會?！爸袊锕I(yè)投資大會”由中國科學院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所策劃發(fā)起，國內(nèi)首個生物工業(yè)領(lǐng)域以資本、技術(shù)、產(chǎn)業(yè)為核心的專業(yè)性、商務(wù)型投資會議，為促進工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域“技術(shù)、產(chǎn)業(yè)、資本”深度融合搭建嶄新平臺。 2017年，中國工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇專注深耕工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域第十年，將與中國生物工業(yè)投資大會合并召開，力求辦成特色互補、效應(yīng)倍增的行業(yè)盛會！

“第九屆中國工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展高峰論壇暨第二屆中國生物工業(yè)投資大會”將組織“技術(shù)創(chuàng)新”和“項目路演”、“企業(yè)展覽”三大板塊內(nèi)容，著重探討工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域“合成生物技術(shù)”、“酶工程與生物催化”、“細胞工廠”、“生物計算與設(shè)計”、“高通量篩選裝備與技術(shù)”等議題，并甄選處于不同階段的優(yōu)秀生物工業(yè)項目進行路演，發(fā)布《中國工業(yè)生物技術(shù)白皮書暨中國生物工業(yè)投資分析報告2017》，還將設(shè)立“年度創(chuàng)新先鋒獎”、“年度科技轉(zhuǎn)化獎”及“年度綠色企業(yè)獎”等獎項，同時開展小組討論、一對一洽談等活動。大會將采取多種組織形式，加強互動交流，歡迎在線注冊報名參會！

In Vitro Stability of Uricase Self-Assembly Hollow Nanospheres

DENG Xue， HU Xueyuan， HE Dan， YAN Zijun， ZHOU Yunli， ZHANG Jingqing*
（College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

To prepare the self-assembly hollow nanospheres of hyaluronic acid-graft-poly（ethylene glycol）（HA-g-PEG）and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin （HPCD）containing uricase （U HPCD）and study their stability in vitro.UHPCD were prepared and the entrapment efficiency，size and zeta potential of UHPCD were detected.The optimum temperature，optimum pH，thermal stability，storage stability，pH stabilities and proteolytic stabilities of UOX and UHPHD were measured.The entrapment efficiency of UHPHD was（62.17±2.94）%.The average particle size was（299.60±13.05）nm，and the zeta potential was （-45.10±2.75） mV.The optimal temperatures for UHPHD and U0X were 40 ℃ ，the optimal pH values were 8.5.UHPHD significantly enhanced the stability of free UOX in vitro.

uricase，stability，self-assembly hollow nanosphere

R 944.9

A

1673—1689（2017）09—0933—05

2015-04-14

國家自然科學基金項目（30973645）；重慶市首批高等學校優(yōu)秀人才資助計劃項目（渝教人（2009）2號文件）。

*通信作者：張景勍（1973—），女，重慶市人，理學博士，教授，博士研究生導師，主要從事藥物新劑型與新技術(shù)方面的研究。E-mail：zjqrae01@163.com

鄧雪，胡雪原，何丹，等.尿酸酶自組裝空心納米微球體外穩(wěn)定性[J].食品與生物技術(shù)學報，2017，36（09）：933-937.