復(fù)合酶解法優(yōu)化黃精多糖提取工藝

苑 璐， 冷凱良， 周余航， 周 三*

（1.青島大學(xué) 藥學(xué)院，山東 青島 266021；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；3.煙臺(tái)大學(xué) 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái)264005）

復(fù)合酶解法優(yōu)化黃精多糖提取工藝

苑 璐1， 冷凱良2， 周余航3， 周 三*1

（1.青島大學(xué) 藥學(xué)院，山東 青島 266021；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；3.煙臺(tái)大學(xué) 藥學(xué)院，山東 煙臺(tái)264005）

采用復(fù)合酶解法優(yōu)化黃精多糖提取工藝，苯酚-濃硫酸顯色法測(cè)定黃精多糖質(zhì)量濃度，以黃精多糖提取率為指標(biāo)，對(duì)復(fù)合酶種類和配比進(jìn)行篩選后，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察酶解溫度、pH、料液比、加酶量對(duì)提取率的影響，并通過正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，復(fù)合酶提取優(yōu)于單酶提取和普通水提。酶用量配比為纖維素酶：木瓜蛋白酶=3∶7。酶解最佳條件為：pH值5.0，酶解溫度 50 ℃，料液比（g/mL）1∶20，加酶量 1.5 g/dL，即纖維素酶 0.45 g/dL，木瓜蛋白酶 1.05 g/dL，酶解2 h后，沸水浸提2 h。在此工藝條件下，黃精多糖提取率可達(dá)21.55%，是普通水提法得率的2.75倍，比單酶水解高出12.06%。

黃精；多糖；復(fù)合酶提?。徽辉囼?yàn)

黃精（Polygonatum sibiricum Red.），為百合科一種重要的藥食同源的植物，俗稱雞頭黃精、老虎姜和雞爪參等，其根莖作為大宗常用藥材，收載于《中國(guó)藥典》2010年版（一部）[1]。其成分豐富，有黃精多糖、薯蕷皂苷[2]、毛地黃糖苷、黃酮類、生物堿、醌類、木脂素等。而黃精多糖 （polygonatum sibiricum polysaccharides.PSP）被認(rèn)為是黃精最主要的功能性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心腦血管等重要的藥理活性[3]。傳統(tǒng)的黃精多糖提取方式主要為熱水浸提醇沉法、超聲輔助提取和酸堿提取法[4]，但這些方法提取效率低、耗時(shí)長(zhǎng)，不僅可能對(duì)多糖分子提取不完全，而且可能會(huì)破壞其結(jié)構(gòu)，浪費(fèi)成本。

近年來隨著生物化學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，新的輔助多糖提取方法逐漸完善增多。其中酶法提取多糖也開始廣泛應(yīng)用于中草藥多糖的提取。酶解輔助提取法具有反應(yīng)溫度低、效率高、無污染等優(yōu)點(diǎn)，能夠降低體系中的活化能，使反應(yīng)在比較溫和的條件下分解植物組織，加速多糖的釋放或提取，其中應(yīng)用較廣的有纖維素酶、蛋白酶、果膠酶和相關(guān)的復(fù)合酶。由于植物細(xì)胞的細(xì)胞壁主要由纖維素組成，纖維素酶可以將其水解為葡萄糖，使其內(nèi)容物更容易被溶解和提取出來，同時(shí)纖維素酶只破壞細(xì)胞壁，而細(xì)胞內(nèi)部物質(zhì)不含有纖維素類物質(zhì)，因此不會(huì)影響其內(nèi)容物的成分結(jié)構(gòu)[5]。黃精多糖分子在細(xì)胞中多以糖蛋白的形式與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，因此選用不同種類的蛋白酶將蛋白質(zhì)分子水解，也可以幫助多糖分子的溶出和提取。果膠酶本質(zhì)上是聚半乳糖醛酸水解酶，它能夠降解細(xì)胞間的果膠質(zhì)，使細(xì)胞得到更好的分離。

目前，已有酶解提取黃精多糖提取工藝研究的報(bào)道[6-7]，但均采用單一酶種輔助提取，由于不同的酶作用結(jié)合位點(diǎn)的不同，現(xiàn)多采用復(fù)合酶解，作用效率更高，而黃精多糖這方面的研究很少。作者以多糖提取率為考察指標(biāo)，對(duì)復(fù)合酶種類和配比進(jìn)行篩選，采用正交試驗(yàn)對(duì)復(fù)合酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期提高黃精多糖的提取效率，為工業(yè)化生產(chǎn)和臨床應(yīng)用提供研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與器材

KQ-600DE型數(shù)控

超聲波清洗儀：江蘇昆山；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗；CA-1111型冷卻水循環(huán)裝置：上海愛朗；TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海三發(fā)；AL-104型電子天平：梅特利-托利多；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：上海亞榮；SHZ-82型恒溫振蕩器：常州國(guó)華；FW100型高速萬能粉碎機(jī)：天津泰斯特；PHS-25型pH計(jì)：上海儀電；冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康；TD5A-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)：湖南湘儀；XW-80A旋渦混合器：上海精科。

1.2 材料與試劑

黃精材料產(chǎn)地為湖南，購(gòu)于吉林敖東藥業(yè)，經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鑒定為百合科黃精屬黃精根莖。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào) 1539-2000001；石油醚（60～90℃沸程）：國(guó)藥集團(tuán)；木瓜蛋白酶（酶活力≥150 000 U/g）：南寧龐博生物；纖維素酶（酶活力≥150 000 U/g）：寧夏和氏璧；果膠酶（酶活力≥50 000 U/g）：寧夏和氏璧；苯酚、硫酸、乙醇等化學(xué)試劑：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)；實(shí)驗(yàn)用水為純凈水：娃哈哈水站購(gòu)買。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖的提取工藝 黃精粉末60℃干燥至恒重→加入50 mL石油醚，40℃超聲提取30 min，脫脂，過濾，藥渣揮干溶劑（復(fù)合酶水溶液40℃活化10 min）→加入復(fù)合酶于50℃、pH 5.0環(huán)境下酶解120 min→迅速升溫至100℃，沸水浴提取2 h→過濾，藥渣采用熱水洗滌3次→濃縮、醇沉→無水乙醇、丙酮、乙醚分別洗滌、脫蛋白→冷凍干燥，計(jì)算多糖質(zhì)量濃度。

1.3.2 多糖質(zhì)量濃度測(cè)定方法的確定 參照藥典[1]，精密稱取105℃下干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即1.0 mg/mL葡萄糖的對(duì)照品溶液，于4℃冷藏備用。 分別精密吸取 0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL對(duì)照液于試管中，加水定容至100 mL。各取配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，分別精確加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，5 min沸水浴，冷卻。經(jīng)紫外-可見分光光度計(jì)在400～600 nm范圍內(nèi)掃描，確定多糖提取液和對(duì)照液最大吸收波長(zhǎng)均在490 nm處，因此將其確定為檢測(cè)波長(zhǎng)。以試劑空白為對(duì)照，于490 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度在0～0.10 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。以吸光值A(chǔ)值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)具塞試管中葡萄糖（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果確定苯酚-硫酸法為黃精多糖質(zhì)量濃度測(cè)定的方法?；貧w方程為y=14.705x-0.083 6（R2=0.997 7）。

1.3.3 黃精得率的計(jì)算方法

1.3.4 復(fù)合酶種類的篩選 選取纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)，在相同的加酶量、質(zhì)量配比和酶解時(shí)間的前提下，在各自的最適溫度、pH下，同時(shí)加入單酶和多種酶的方式，以多糖提取率為考察指標(biāo)，探討酶種類對(duì)酶解效率的影響。

1.3.5 復(fù)合酶用量配比試驗(yàn) 根據(jù)酶種篩選試驗(yàn)結(jié)果，使總加酶量固定為2 500 U/g，分別按照1∶4，3∶7，2∶3，1∶1，3∶2，7∶3，4∶1 的配比，研究效果較好的兩種酶制劑的酶解效果，其中pH為5.0，固液比為1∶15，溫度為50℃。

1.3.6 復(fù)合酶解單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)復(fù)合酶最佳配比結(jié)果，分別選取總加酶量、酶解時(shí)間、pH、溫度、提取方式、料液比為考察因素，多糖提取率為考察指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上探討最適宜酶解條件。

1.3.7 最佳復(fù)合酶配比組合酶解條件的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)復(fù)合酶最佳用量配比結(jié)果，選取pH、溫度和料液比為考察因素，以多糖提取率為考察指標(biāo)，按照表1進(jìn)行三因素三水平的L933正交試驗(yàn)。

表1 復(fù)合酶提取工藝正交試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factorsand levelsoforthogonaltestfor composite enzyme extraction process

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合酶種類的篩選結(jié)果

由圖1可知，采用纖維素酶和木瓜蛋白酶提取黃精多糖時(shí)，提取率與普通水提組相比，差異具有顯著性，可能是由于植物根莖中多糖多是以糖蛋白形式存在，因此采用木瓜蛋白酶能夠很好的將糖分子與蛋白質(zhì)分離；而在提取過程中，細(xì)胞質(zhì)壁往往會(huì)因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)難以完全破壞而影響提取效果，因此纖維素酶可以有效地解決這個(gè)問題；果膠酶差異不大的原因可能在于本次所用的材料為植物根莖，膠質(zhì)含量低，因而效果不明顯。而木瓜蛋白酶和纖維素酶一起添加時(shí)的水解效率比單酶水解效率要高，因此在后續(xù)試驗(yàn)中，選用木瓜蛋白酶和纖維素酶作為研究目標(biāo)進(jìn)行條件優(yōu)化。

圖1 復(fù)合酶酶解種類篩選結(jié)果Fig.1 Effects of the variety screening of compound enzyme digestion

2.2 復(fù)合酶用量配比試驗(yàn)結(jié)果

由圖2可知，纖維素酶與木瓜蛋白酶酶活力比值為3∶7時(shí)，黃精多糖的提取率最高達(dá)20.69%，因此在后續(xù)試驗(yàn)中確定酶活力比值為纖維素酶：木瓜蛋白酶=3∶7，即纖維素酶約為0.50 g/dL，木瓜蛋白酶約為1.17 g/dL，加酶方式為稱取一定量的酶配成酶溶液于40℃中活化10 min，酶解過程中分兩次加入。

圖2 復(fù)合酶酶解用量配比結(jié)果Fig.2 Effects of the ratio on the compound enzyme

2.3 復(fù)合酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 加酶量 由圖3可知，在加酶量由0.5 g/dL增加到1.5 g/dL過程中，黃精多糖的提取率隨之增高；而隨著加酶量的繼續(xù)增加，酶解效率卻出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)，原因可能是競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用使酶解效率降低。因此將總加酶量確定為1.5 g/dL，纖維素酶∶木瓜蛋白酶=3∶7，即纖維素酶為0.45 g/dL，木瓜蛋白酶為1.05 g/dL。

圖3 不同的加酶量對(duì)黃精多糖提取率的影響Fig.3 Effects of different amounts of compound enzyme on polysaccharide extraction yield

2.3.2 酶解pH值 由圖4可知，pH作為影響纖維素酶和木瓜蛋白酶的酶解效率的重要因子，在復(fù)合酶解時(shí)也有不同的影響結(jié)果。在pH為5.0時(shí)提取率達(dá)到最高，約為19.61%，而在其他不同的pH變化條件下提取率均有不同程度的降低。因此在后續(xù)試驗(yàn)中選取pH為5.0左右進(jìn)行研究。

2.3.3 酶解溫度 由圖5可知，溫度為50℃時(shí)復(fù)合酶的酶解效率相對(duì)其他溫度較高，此時(shí)黃精多糖的提取率為19.92%，而隨著溫度繼續(xù)升高，會(huì)導(dǎo)致酶活性的喪失而使提取率逐步下降。

圖4 不同pH對(duì)黃精多糖提取率的影響Fig.4 Effects of pH on polysaccharide extraction yield

圖5 不同酶解溫度對(duì)于黃精多糖提取率的影響Fig.5 Effects of temperature on polysaccharide extraction yield

2.3.4 料液比 由圖6可知，隨著酶解過程中料液比的增加，黃精多糖的提取率呈上升趨勢(shì)，可能是由于浸提液的增多不僅可以增加纖維素酶和木瓜蛋白酶與底物的結(jié)合面積，而且會(huì)加速多糖分子的溶出，但是在1∶20之后提取率逐漸趨于平緩，原因是酶與底物結(jié)合達(dá)到空間飽和，此時(shí)多糖分子也能夠較大程度的溶出，因此將1∶20作為中心水平進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)的優(yōu)化條件。

圖6 不同料液比對(duì)黃精多糖提取率的影響Fig.6 Effects of ratio of solid to liquid on polysaccharide extraction yield

2.4 酶解條件正交實(shí)驗(yàn)及方差分析結(jié)果

復(fù)合酶解正交試驗(yàn)及方差分析結(jié)果見表2-3?？梢钥闯觯饕蛩貙?duì)于黃精多糖提取率的影響順序?yàn)锳＞C＞B，即pH值＞料液比＞溫度；最佳酶解條件為A2B2C3，即pH值為5.0，酶解溫度為 50℃，料液比為 1∶20。 而表 3 的結(jié)果表明，F(xiàn)A＞FC＞FB，與極差 R的分析結(jié)果相同；但是三個(gè)因素對(duì)于得率的影響均不顯著，可能是因?yàn)楸敬卧囼?yàn)中誤差較大、自由度小，降低了檢驗(yàn)的靈敏度，掩蓋了考察因素的顯著性。因此根據(jù)以上結(jié)果，最終將復(fù)合酶解工藝條件最終確定為pH值5.0，酶解溫度50℃，料液比1∶20，加酶量為1.5 g/dL，酶解2 h后，沸水浸提2 h。

表2 復(fù)合酶解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Composite enzyme orthogonal experiment results

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

基于最優(yōu)的提取條件，實(shí)際進(jìn)行三組平行測(cè)定，取多糖提取率平均值為21.55%，與表2中最高提取率的相對(duì)誤差為2.18%，證明此優(yōu)化工藝條件是重復(fù)可行的。

3 結(jié)語

以提高黃精提取率為目標(biāo)，通過對(duì)單一酶和復(fù)合酶種類的篩選，確定了以纖維素酶和木瓜蛋白酶為研究對(duì)象的提取工藝。優(yōu)化后的復(fù)合酶提取法優(yōu)于單酶提取和普通水提，酶用量配比為纖維素酶∶木瓜蛋白酶=3∶7，酶解最佳條件為：pH 5.0，酶解溫度50 ℃，料液比 1∶20，加酶量為 1.5 g/dL，即纖維素酶為0.45 g/dL，木瓜蛋白酶為1.05 g/dL，酶解2 h后，沸水浸提2 h。在此工藝條件下，黃精多糖提取率可達(dá)21.55%，是普通水提法得率的2.75倍，與單酶水解率相比，RSD為12.06%，與李智慧等人[6]優(yōu)化的纖維素酶提取方法相比，提取率提高了5.25%。但在正交條件優(yōu)化酶解工藝過程中，選取的各因素對(duì)于提取率影響不大，可能是黃精多糖的提取已經(jīng)較完全，也說明通過考慮進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件來提高黃精多糖的得率是不可行的。而有其他研究表明[8-9]，在復(fù)合酶解過程中，由于不同的水解酶的最適溫度與最適pH的條件是不同的，因此如果改變加酶的方式，如分步加酶或同步加酶可能對(duì)提取率有不同的影響，這個(gè)有待進(jìn)一步研究。另外在酶解過程后，醇沉步驟可能不能將滅活的酶都純化掉，因此如何制備更高純度的黃精多糖也值得進(jìn)一步探討。而陳莉[10]在探討茯苓多糖提取工藝時(shí)認(rèn)為，酶解后熱水浸提的工藝同樣影響了多糖的溶出速率，并對(duì)其進(jìn)行了優(yōu)化，這或許可以為黃精多糖的提取提供思路。

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment results of variance analysis

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美國(guó)批準(zhǔn)“豆油產(chǎn)品預(yù)防心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)”健康功能聲稱

2017年7月21日，美國(guó)食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)“豆油產(chǎn)品預(yù)防心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)”健康功能聲稱（FDA-2016-Q-0995）。該健康聲稱由紐約邦基（Bunge Limited）有限公司于2016年2月8日提交。

FDA稱“經(jīng)過對(duì)申請(qǐng)材料數(shù)據(jù)和相關(guān)科研數(shù)據(jù)綜合評(píng)價(jià)，在保證相關(guān)用語恰當(dāng)和不誤導(dǎo)消費(fèi)者情況下，有關(guān)豆油產(chǎn)品中不飽和脂肪酸（UFA）能夠預(yù)防心血管疾病（CHD）風(fēng)險(xiǎn)的健康聲稱具有科學(xué)依據(jù)，可以標(biāo)注?！?/p>

［信息來源］食品伙伴網(wǎng).美國(guó)批準(zhǔn)“豆油產(chǎn)品預(yù)防心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)”健康功能聲稱[EB/OL].(2017-8-23).http://news.foodmate.net/2017/08/439148.html

美國(guó)FDA評(píng)估夏威夷果與冠心病的健康聲稱

食品伙伴網(wǎng)訊 據(jù)美國(guó)食品藥品管理局（FDA）消息，2017年7月24日美國(guó)FDA發(fā)布消息稱，夏威夷果與冠心病的健康聲稱已完成評(píng)估，認(rèn)為食用夏威夷果與冠心病風(fēng)險(xiǎn)降低存在一定的關(guān)聯(lián)。

生產(chǎn)企業(yè)可以宣稱：“支持性但非結(jié)論性研究表明，每天食用1.5 g夏威夷果作為低飽和脂肪膳食的一部分，在確保飽和脂肪或者熱量攝入量不增加的前提下，可能會(huì)降低冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。脂肪含量見營(yíng)養(yǎng)信息?！?/p>

Royal Hawaiian Macadamia Nut,Inc.提交了本次健康聲稱申請(qǐng)。

美國(guó)FDA認(rèn)為，本次健康聲稱被科學(xué)證據(jù)所支持，然而并不符合FDA認(rèn)可健康聲稱所要求嚴(yán)格意義上的“重大科學(xué)一致”標(biāo)準(zhǔn)。鑒于此，夏威夷果標(biāo)簽應(yīng)該附帶免責(zé)聲稱或者合理的語言，以保證該聲稱的科學(xué)性證據(jù)被準(zhǔn)確傳達(dá)。

［信息來源］食品伙伴網(wǎng).美國(guó)FDA評(píng)估夏威夷果與冠心病的健康聲稱 [EB/OL].(2017-7-28).http://news.foodmate.net/2017/07/437813.html

Optimization of Multi-Enzymatic Extraction Process of Polysaccharide from Ploygonatum sibiricum

YUAN Lu1， LENG Kailiang2， ZHOU Yuhang3， ZHOU San*1
（1.School of Pharmacy，Qingdao University，Qingdao 266021，China；2.Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China；3.School of Pharmacy，Yantai University，Yantai 264005，China）

Method of multi-enzyme was used to optimize the extraction process of polysaccharide from Ploygonatum sibiricum，phenol-sulfuric acid colorimetric method was applied to determine the content of polysaccharide，defined the polysaccharide extraction rate as the index to choice the kind and ratio of enzymes，the experimental factors were selected by single factor trials such as enzymatic hydrolysis temperature，pH，the rate of material to solvent，the amount of enzyme concentration，the important ones of which would be chosen to optimize by orthogonal test.Results showed that multi-enzyme extraction was better than extraction by single-enzyme or water.The rate of cellulose to papain was 3 to 7.The optimum enzymolysis conditions were as following：pH value of 5.0，temperature of 50 ℃，the rate of material to solvent was 1 to 20，the amount of enzyme concentration was 1.5%，which was 0.45%of cellulose and 1.05%of papain，2 hour-hot water extraction after 2hour-enzymatic hydrolysis.In this condition，the maximum polysaccharide rate was 21.55%，which was 2.75 times as high as water，and had 12.6%higher than that of single factor trials.

Ploygonatum sibiricum Red，polysaccharide，multi-enzymatic extraction，orthogonal test

TS 244.1

A

1673—1689（2017）09—0996—06

2015-04-09

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎(jiǎng)勵(lì)基金項(xiàng)目（2005BS08011）。

*通信作者：周 三（1966—），男，山東濟(jì)南人，理學(xué)博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事生藥資源與植物化學(xué)方面的研究。E-mail：zhousan@qdu.edu.cn

苑璐，冷凱良，周余航，等.復(fù)合酶解法優(yōu)化黃精多糖提取工藝[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（09）：996-1001.