艾蒿多糖抑菌活性及穩(wěn)定性

孫義玄， 包怡紅

（東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

艾蒿多糖抑菌活性及穩(wěn)定性

孫義玄， 包怡紅*

（東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040）

采用水提法提取艾蒿多糖，用濾紙片法測定多糖的抑菌活性及最低抑菌濃度（MIC），同時研究艾蒿多糖抑菌活性的酸堿穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性。結(jié)果表明：艾蒿多糖對3種常見細菌均有一定的抑制效果，對革蘭氏陽性細菌如金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑制作用較強，對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑制作用較弱；艾蒿多糖對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的最小抑制質(zhì)量濃度（MIC）分別為0.625、0.625、1.25 mg/mL；多糖的抑菌活性對溫度和紫外照射具有較好穩(wěn)定性，在不同的pH值條件下抑菌活性相對不穩(wěn)定，酸性處理條件下抑菌活性較強，堿性處理條件下抑菌活性較弱。艾蒿多糖具有良好的抑菌活性，可用于天然食品防腐劑的開發(fā)利用。

艾蒿；多糖；抑菌活性；穩(wěn)定性

艾蒿（Artemisia argyi Levl.et Vant），俗稱艾葉草等，在亞洲多個國家均有生長，在我國東北等地區(qū)種植十分廣泛[1]。艾蒿本身是一味傳統(tǒng)的中草藥，具有止血陣痛、鎮(zhèn)咳祛痰、防過敏、抗病毒、維護神經(jīng)系統(tǒng)等藥用功效[2]。艾蒿作為一種被廣泛應用的中藥材，其較強的抑菌活性，可用于多種水果和食品防腐，可大大延長食品的儲藏期[3-5]。艾蒿作為一種應用價值極高的藥用植物之一，含有大量揮發(fā)油、多糖、黃酮等多種生物活性成分，不僅可以抗氧化防衰老，還能抑制多種有害細菌生長繁殖[6]。

近年來我國對抗菌植物資源種類進行相關調(diào)查研究，這些植物中提取能防治一些常見的細菌病害和真菌病害，且防治效果好，對環(huán)境無污染。如何從植物體中提取到高效、低毒無殘留的新型植物源農(nóng)藥及新型植物源殺菌劑已經(jīng)成為研究熱點[7-9]。目前研究艾蒿的抑菌主要集中在艾蒿精油方面，對多糖的研究較少。作者旨在研究艾蒿多糖的抑菌作用及各因素對其穩(wěn)定性的影響，為艾蒿植物的開發(fā)利用及新型天然無污染的食品防腐劑的研究提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試菌種和培養(yǎng)基 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：均為東北林業(yè)大學微生物實驗室培養(yǎng)。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（供試驗細菌生長繁殖）

1.1.2 試驗儀器 FJ-200高速萬能粉碎機：天津苔絲特儀器設備有限公司；RE-52E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海榮科設備儀器廠；DK-S12電熱恒溫水浴鍋：天津恒天設備有限公司；721分光光度計：上海光譜儀器設備有限公司；JA2003電子天平：常熟市天圣儀器有限責任公司；恒溫加熱磁力攪拌器：上海思樂儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 艾蒿粗多糖的制備 取干燥艾蒿葉用粉碎機粉碎后，過40目篩，取20 g干粉放入燒杯中，料液比1∶90，置于70～80℃恒溫水浴鍋中攪拌提取2 h，重復3次，提取液混合濃縮，抽濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到艾蒿粗多糖液。

1.2.2 抑菌活性的測定 多糖抑菌活性的測定主要采用濾紙片法，選取圓形滅菌濾紙片直徑為6 mm，將其浸泡質(zhì)量濃度分別為2.5、5、10 mg/mL的艾蒿多糖提取液中，濾紙片浸入多糖溶液中2 h，使其浸泡充分后備用。在無菌環(huán)境中，將以滅菌培養(yǎng)基在溫度60℃左右倒成平板，待完全冷卻后，向培養(yǎng)基中間加入0.1 mL供試菌。用無菌涂布器涂布均勻，使供試菌被培養(yǎng)基吸收后，每個平皿貼3片濾紙片，并以無菌水作為空白對照。每一種菌種做3個平行樣。倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，取出觀察濾紙片周圍抑菌圈大小并測量，計算3個平均值。

1.2.3 最低抑菌濃度（MIC）測定 配置80 mg/mL的艾蒿多糖溶液，用兩倍法稀釋多糖液質(zhì)量濃度為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL 共 7 個 濃度，取0.1 mL的三種菌懸液，滴加于平板培養(yǎng)基中央并涂布均勻，盡量使菌懸液被培養(yǎng)基吸收，在平板上放置浸泡于艾蒿多糖溶液的滅菌濾紙片，每平板分別放3片，倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，觀察3種菌在不同多糖質(zhì)量濃度下的抑菌圈大小，比較抑菌活性，重復3次，無菌水作為對照。

1.2.4 艾蒿多糖穩(wěn)定性研究

1）溫度對艾蒿多糖穩(wěn)定性的影響：用無菌水將艾蒿多糖溶液稀釋成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，分別在水浴溫度 20、40、60、80、100、121 ℃濕熱環(huán)境下各處理30 min，選取常見3種細菌金色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌進行比較分析，處理結(jié)束后，通過測定多糖溶液處理前后抑菌圈大小，比較3種細菌抑菌活性，重復3次試驗，取平均值計算結(jié)果。

2）pH對艾蒿多糖穩(wěn)定性的影響：取不同pH值的緩沖液，將艾蒿多糖用其稀釋成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，各溶液的 pH 值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，并以空白緩沖溶液為對照。選取常見3種細菌金色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌進行比較分析，通過測定多糖溶液處理前后抑菌圈大小，比較3種細菌抑菌活性，重復3次試驗，取平均值計算結(jié)果。

3）紫外對艾蒿多糖穩(wěn)定性的影響：取質(zhì)量濃度為5 mg/mL的多糖溶液，在40 W紫外燈垂直30 cm處下紫外照射 5、10、15、20、25 min， 選取常見 3 種細菌金色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌進行比較分析，通過測定多糖溶液處理前后抑菌圈大小，比較3種細菌抑菌活性，重復3次試驗，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 艾蒿多糖對不同細菌抑菌活性比較分析

采用濾紙片法，試驗研究艾蒿多糖對不同細菌的抑菌活性，選取濃度為2.5、5.0、10 mg/mL的艾蒿多糖溶液，通過抑菌圈直徑大小判定對供試細菌的抑制活性強弱，結(jié)果見表1。

表1 艾蒿多糖對供試細菌的抑菌活性Table 1 Antimicrobial activities of polysaccharide from leaves of Artemisia argyi on tested microbes

通過衡量抑菌圈的直徑大小，比較3種濃度下艾蒿多糖溶液對3種細菌抑菌效果。從表1可知，艾蒿多糖對3種常見細菌的抑菌性均呈陽性。如圖1～3所示，隨多糖質(zhì)量濃度的升高，3種細菌抑菌圈有所擴大，抑菌作用較強，特別是對3種細菌中的枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果最為顯著，表明其對革蘭氏陽性菌抑制效果顯著，對大腸桿菌的抑制作用相對較弱，表明其對革蘭氏陰性菌抑制效果相對較弱。隨著多糖質(zhì)量濃度的升高，分析得到3種細菌抑菌效極顯著增強（p＜0.01）。

圖1 不同艾蒿多糖對枯草芽孢桿菌的抑菌圖Fig.1 Antimicrobial activities of polysaccharide from leaves of Artemisia argyi on Bacillus subtilis

圖2 不同艾蒿多糖對大腸桿菌的抑菌圖Fig.2 Antimicrobial activities of polysaccharide from leaves of Artemisia argyi on Escherichia coli

圖3 不同艾蒿多糖對金黃色葡萄球菌的抑菌圖Fig.3 Antimicrobial activities of polysaccharide from leaves of Artemisia argyi on Staphylococcus aureus

2.2 艾蒿多糖對不同細菌最低抑菌濃度（MIC）

艾蒿多糖對各供試菌均有一定的抑制作用，因此，采用適當?shù)陌锒嗵窍♂対舛葘Ω魇茉嚲M行稀釋敏感實驗，結(jié)果見表2。

應用二倍法稀釋艾蒿多糖溶液，觀察不同質(zhì)量濃度下多糖對3種細菌的抑菌性，以抑菌圈直徑大小的變化來衡量不同細菌的最小抑菌濃度。在一定濃度范圍內(nèi)，艾蒿多糖對3種細菌的最小抑菌濃度有所不同。對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑制質(zhì)量濃度均為0.625 mg/mL，而大腸桿菌的最小抑制質(zhì)量濃度較高，為1.25 mg/mL，試驗結(jié)果顯示，艾蒿多糖對3種常用細菌均有較為顯著的抑菌作用。

表2 艾蒿多糖的最小抑制質(zhì)量濃度（MIC）Table 2 MICs of polysaccharide from leaves of Artemisia argyi

2.3 溫度對艾蒿多糖抑菌活性的影響

溫度是艾蒿多糖抑菌活性的影響因素之一，試驗選取20～121℃共6個溫度，研究不同溫度對艾蒿多糖抑菌活性的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 溫度對艾蒿多糖抑菌效果的影響Fig.4 Effect of temperatures on antibacterial activities of polysaccharide from leaves of Artemisia argyi

由圖4可知，經(jīng)過不同溫度處理的艾蒿多糖對受試菌的抑菌圈直徑?jīng)]有明顯變化，表明艾蒿多糖熱處理后其抗菌成分活性并未受到顯著影響，說明溫度變化的對艾蒿多糖抑菌活性影響不大，具備很好的熱穩(wěn)定性。艾蒿多糖耐熱性可應用于食品保鮮儲藏，對于高溫環(huán)境下食品運輸過程的防腐保鮮具有重要的應用價值，可大大提高食品的儲藏期[13]。

2.4 pH值對艾蒿多糖抑菌活性的影響

pH是影響多糖抑菌活性的重要因素，試驗選取pH 4～10共7個不同酸堿環(huán)境，研究不同pH條件下對艾蒿多糖抑菌活性的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 pH值對艾蒿多糖抑菌效果的影響Fig.5 EffectofpH on antibacterialactivities of polysaccharide from leaves of Artemisia argyi

不同pH對艾蒿多糖抑菌效果影響較大，由圖5可知，在pH 4～10范圍內(nèi)，隨pH值的不斷升高，艾蒿多糖的抑菌能力逐漸減弱。在酸性條件pH 4～6之間變化幅度較大，表明酸性條件有利于多糖溶液對供試菌的抑制，但pH在8之后無抑菌活性，主要由于在堿性條件下，艾蒿多糖中的抑菌物質(zhì)與溶液中的堿相互作用，導致抑菌性減弱甚至消失，但緩沖液自身對3種細菌不具有抑菌活性[14]。試驗結(jié)果表明，酸性條件下有助于抑菌作用的增強。

2.5 紫外線照射對艾蒿多糖抑菌活性的影響

紫外線照射是影響艾蒿多糖抑菌活性的主要因素，將艾蒿多糖經(jīng)紫外光垂直照射一段時間后，試驗選取 5、10、15、20、25、30 min 6 個不同時間，研究不同紫外照射時間對艾蒿多糖抑菌活性的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，隨紫外線照射時間的延長，艾蒿多糖對3種細菌的抑菌活性無明顯變化，始終保持平穩(wěn)趨勢。試驗結(jié)果表明，艾蒿多糖的抑菌活性不受紫外線垂直照射的影響。

圖6 紫外線照射時間對艾蒿多糖抑菌效果的影響Fig.6 Effect of ultraviolet irradiation on antibacterial activities of polysaccharide from leaves of Artemisia argyi

3 結(jié) 語

采用水提法提取艾蒿多糖，因艾蒿多糖有較強的抑菌性，應用濾紙片法對艾蒿多糖的抑菌活性作了研究，發(fā)現(xiàn)艾蒿多糖對細菌抑菌效果較顯著，對常見細菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑菌效果強于大腸桿菌。艾蒿多糖對溫度、紫外線垂直照射都表現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。艾蒿多糖在酸性環(huán)境處理時抑菌活性較強，在堿性下多糖抑菌活性減弱，當pH達到8以后，抑菌活性變?nèi)跎踔料А?/p>

在研究艾蒿多糖抑菌穩(wěn)定性試驗中，酸性條件對艾蒿多糖的抑菌活性影響較大，在酸性環(huán)境下其抑菌活性強，在堿性環(huán)境下抑菌活性弱。在pH較低的情況下，抑菌活性強的原因主要：一方面在酸性條件下，H+的作用使細菌生長繁殖環(huán)境變化，大大降低了細菌的活性，從而抑制細菌繁殖[15]；另一方面，酸性環(huán)境引起非極性酚類物質(zhì)上所帶的酚羥基的電離度變?nèi)?，從而提高了與膜上蛋白質(zhì)的結(jié)合能力，因而pH值降低，抑菌作用增大[16-17]。

鄭煜焱等[18]利用野生軟棗獼猴桃提取的多糖進行抑菌研究，發(fā)現(xiàn)多糖對細菌、霉菌均有抑菌，且多糖質(zhì)量濃度增大，抑制活性增強，溫度和pH對其穩(wěn)定性有所影響；王晶晶等[19]研究無梗五加果多糖抑菌試驗中，發(fā)現(xiàn)這種多糖對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及根霉等幾種常見菌抑制作用顯著；孫茜等[20]利用勻漿熱水提法提取蜀本草多糖，研究表明大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等細菌均有不同程度抑制作用，在100℃及以下穩(wěn)定性良好。本試驗研究表明，艾蒿多糖具有較強的抑菌活性，可作為食品防腐劑來提高食品儲藏期，為艾蒿多糖的開發(fā)應用奠定基礎。

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科技信息

歐盟批準氯化錳、二氧化錳等作為動物飼料添加劑

2017年8月21日歐盟發(fā)布 （EU）2017/1490號條例，批準氯化錳、二氧化錳、一水硫酸錳、氨基酸水合物螯合錳、水解蛋白螯合錳、甘氨酸水合物螯合錳、三水氯化錳作為動物飼料添加劑。

按照新條例要求，以上7種錳化合物在添加劑類別組屬于“營養(yǎng)添加劑”、在功能組類別屬于“微量元素”。

另外，以上7種錳化合物不能用于動物飲用水，將其用于動物飼料時，在水分含量12%的飼料中的添加限量為：魚飼料100 mg/kg，其他動物飼料150 mg/kg。

新條例還規(guī)定，在2018年3月11日之前，按照原來規(guī)定生產(chǎn)和標注的飼料、錳化合物可以繼續(xù)使用至庫存用完。

［信息來源］食品伙伴網(wǎng).歐盟批準氯化錳、二氧化錳等作為動物飼料添加劑 [EB/OL].(2017-8-23).http://news.foodmate.net/2017/08/440868.html.

Study on Antimicrobial Activities of Polysaccharides from Artemisia argyi and Its Stability

SUN Yixuan，BAO Yihong*
（College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

Artemisia argyi polysaccharide extracted by hot water and measurement the antibacterial activity and minimum inhibitory concentration （MIC）of polysaccharides by using the filter paper method，also studied the pH stability，thermal stability，UV stabilizers stability of Artemisia polysaccharide antibacterial activity.The results showed that：Artemisia argyi polysaccharides have a certain inhibitory effect on three common bacteria，and have strong effect on gram-positive bacteria Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis，but the effect on gram-negative bacteria E.coli is weak.The MICs of the polysaccharide agaginst Bacillus subtilis，Staphylococcus aureus and Escherichia coli were 0.625、0.625、1.25 mg/mL respectively.The antimicrobial activities of the polysaccharide were stable under the conditions of heat and ultraviolet ray，but were unstable under different pH values，strong in acid and weak in base.Artemisia argyi polysaccharide has good antibacterialactivity，it can be used for the development and utilization of natural food preservatives.

Artemisia argyi，polysaccharide，antimicrobial activity，stability

TS 201

A

1673—1689（2017）09—0990—06

2015-04-18

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項項目（2572014EA02）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項目（2015RAXXJ010）。

*通信作者：包怡紅（1970—），女，黑龍江哈爾濱人，工學博士，教授，博士研究生導師，主要從事食品生物技術(shù)與功能食品方面的研究。E-mail：baoyihong@163.com

孫義玄，包怡紅.艾蒿多糖抑菌活性及穩(wěn)定性[J].食品與生物技術(shù)學報，2017，36（09）：990-995.