利用麩皮和木薯渣生產(chǎn)飼用木聚糖酶的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

王鳳林，袁昕昕，田亞茹，黃增飛，王 坤，陳 海，呂文竹，溫榮輝

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005)

利用麩皮和木薯渣生產(chǎn)飼用木聚糖酶的黑曲霉固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

王鳳林，袁昕昕，田亞茹，黃增飛，王 坤，陳 海，呂文竹，溫榮輝

(廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530005)

利用產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉(Aspergillusniger)GXH-1菌株對(duì)木薯渣和麩皮發(fā)酵，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)酶條件。最佳發(fā)酵條件為15.99%的木薯渣與84.01%的麩皮組成發(fā)酵基料；以1.60%的(NH4)2SO4為氮源；含水量為56.27%，KH2PO4和NaOH質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.12%和0.20%，接種量為4.0%；36.23℃發(fā)酵68 h。在此條件下，木聚糖酶酶活力最高為1 258.74 U/g，是優(yōu)化前的3.26倍，優(yōu)化效果顯著。

飼料添加劑；麩皮；木薯渣；木聚糖酶；黑曲霉；發(fā)酵

木薯(Manihotesculentacrantz)是我國(guó)南方地區(qū)的主要農(nóng)作物之一，全國(guó)年產(chǎn)量約800多萬(wàn)t。木薯加工過(guò)程中每年會(huì)產(chǎn)生100多萬(wàn)t的木薯渣[1]，其主要成分為粗纖維，還含有少量可溶性糖和蛋白質(zhì)，被視為沒(méi)有利用價(jià)值的廢品[2,3]。目前養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，飼料需求量巨大，原料短缺。隨著新飼料資源開發(fā)與利用的興起，將木薯渣用于飼料生產(chǎn)已成為研究熱點(diǎn)[4-6]。木薯渣含有豐富的銅、錳、鋅等有利于動(dòng)物健康的微量元素[7]，適于飼料生產(chǎn)，并且加入適量的木薯渣可以降低飼料成本；但木薯渣中富含木聚糖，木質(zhì)化程度高，適口性差，動(dòng)物難以消化吸收[8]。經(jīng)產(chǎn)木聚糖酶菌株發(fā)酵可以解決木薯渣的以上缺點(diǎn)，還能消除木聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用。將具木聚糖酶活性的飼料添加劑加入飼料使其發(fā)揮木聚糖酶作用，可極大的縮短發(fā)酵時(shí)間，因此具木聚糖酶活性的飼料添加劑有極大的研究?jī)r(jià)值。本研究用產(chǎn)木聚糖酶的黑曲霉菌株固態(tài)發(fā)酵麩皮和木薯渣，制備具有木聚糖酶活性的飼料添加劑，使木薯渣進(jìn)一步得到開發(fā)利用，也為木薯渣大量應(yīng)用于飼料生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種以及孢子懸液的制備

發(fā)酵菌種黑曲霉GXH-1菌株為廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

孢子懸液的制備：黑曲霉GXH-1在YPD平板上37℃培養(yǎng)4 d，用5 ml無(wú)菌水洗滌，制成108個(gè)/ml的孢子懸液。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

樺木木聚糖和木糖購(gòu)于Sigma公司；木薯渣和麩皮購(gòu)于市場(chǎng)；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1粗酶液的制備

稱取0.25 g干燥的發(fā)酵產(chǎn)物加入25 ml乙酸-乙酸鈉緩沖液中，置于搖床(120 r/min，30℃)中浸提30 min，4℃放置1 h，上清液即為粗酶液。

1.2.2木聚糖酶酶活力測(cè)定方法

木聚糖酶活力的測(cè)定采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法[9]，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB/T 23874-2009。在0.4 ml 1%的木聚糖溶液(37℃保溫5 min)中加入0.4 ml適當(dāng)稀釋的粗酶液，混勻后37℃反應(yīng)30 min，再加入1 ml DNS終止反應(yīng)，然后沸水浴5 min顯色，蒸餾水定容至5 ml。以加入失活酶液為對(duì)照組，測(cè)定OD540。酶活力單位(UI)定義：在上述條件下，每1 min產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量。

1.2.3單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在發(fā)酵培養(yǎng)基中接種5.0%的孢子懸液，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的NH4Cl為氮源，含水量為50%，37℃發(fā)酵72 h，其間翻曲1～2次。分別考察木薯渣含量、氮源、培養(yǎng)條件和KH2PO4含量等因素對(duì)產(chǎn)酶的影響。優(yōu)化時(shí)只改變發(fā)酵培養(yǎng)基成分或發(fā)酵條件。

1.2.4響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇單因素中對(duì)產(chǎn)酶影響最大的木薯渣含量、含水量和發(fā)酵溫度三個(gè)因素，利用Design Expert 8.0設(shè)計(jì)三因素三水平實(shí)驗(yàn)。以木聚糖酶活力為響應(yīng)值，通過(guò)數(shù)據(jù)分析獲得固態(tài)發(fā)酵的最佳條件和模擬回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1木薯渣含量對(duì)產(chǎn)酶的影響

木聚糖酶是一種誘導(dǎo)酶，以含木聚糖豐富的麩皮、玉米芯粉、稻草等為碳源時(shí)可促進(jìn)產(chǎn)酶，固態(tài)發(fā)酵常以成本低的麩皮為主要碳源[10]。本研究以麩皮和木薯渣混合物為碳源，每個(gè)水平重復(fù)3次，由表1可知木薯渣含量為15%時(shí)酶活力最高。

表1 木薯渣含量對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.2氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響

一般而言，有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更適合菌體吸收利用[11]，但有的微生物利用無(wú)機(jī)氮源的能力比有機(jī)氮源高很多[12]。圖1表明，(NH4)2SO4為最佳氮源；圖2表明，(NH4)2SO4的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.6%。

圖1 氮源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響

圖2 (NH4)2SO4含量對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.3含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響

含水量是影響固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的主要因素之一，合適的含水量有利于菌體產(chǎn)酶[13]。由圖3可知，含水量為55%時(shí)產(chǎn)酶量最高為596.56 U/g。

圖3 含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.4溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

發(fā)酵溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢、發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)且產(chǎn)酶量低；而溫度過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致菌絲體老化[14]。如圖4所示，發(fā)酵溫度為36℃時(shí)最適于產(chǎn)酶。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.5其他因素對(duì)產(chǎn)酶的影響

除以上因素外，還有許多因素也會(huì)影響木聚糖酶的產(chǎn)量，具體情況見(jiàn)表2。

表2 最適產(chǎn)酶條件及相應(yīng)酶活力

注：各優(yōu)化均是在前一次優(yōu)化基礎(chǔ)上進(jìn)行。

2.6響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

采用Design Expert 8.0軟件，設(shè)計(jì)Box Behnken實(shí)驗(yàn)，其中有12個(gè)析因?qū)嶒?yàn)，5個(gè)中心實(shí)驗(yàn),以木聚糖酶酶活力為響應(yīng)值，見(jiàn)表3。分析表3的結(jié)果可得到酶活力(Y)與木薯渣含量(A)、含水量(B)和發(fā)酵溫度(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=+1255.10+10.67A+14.87B+11.73C+20.98AB-2.27AC-5.52BC-39.64A2-36.09B2-42.24C2

表3 Box Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和模型方差，見(jiàn)表4。由表4可知，GXH-1菌株產(chǎn)木聚糖酶響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷幕貧w顯著性好(0.000 1<0.05)，且失擬誤差不顯著(0.270 9>0.05)，此回歸模型較為理想。

表4 Box Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.001)。

當(dāng)發(fā)酵溫度為36℃時(shí)，等高線呈橢圓形，說(shuō)明木薯渣含量與含水量交互作用明顯。沿含水量方向的等高線密度大于沿木薯渣含量方向的，說(shuō)明含水量對(duì)產(chǎn)酶量的影響大于木薯渣含量，見(jiàn)圖5。同理，木薯渣含量與發(fā)酵溫度交互作用不明顯，二者對(duì)產(chǎn)酶量的影響差不多，見(jiàn)圖6。含水量與發(fā)酵溫度交互作用也不明顯，含水量對(duì)產(chǎn)酶量的影響略大于發(fā)酵溫度，見(jiàn)圖7。

圖5 木薯渣含量與含水量的交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖

圖6 木薯渣含量與溫度的交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖

圖7 含水量與溫度的交互作用響應(yīng)面圖和等高線圖

通過(guò)響應(yīng)面圖和等高線圖以及表4可知，在木薯渣含量、含水量、發(fā)酵溫度三因素中木薯渣含量、含水量和發(fā)酵溫度以及木薯渣含量與含水量的交互項(xiàng)均對(duì)產(chǎn)酶具有顯著性影響，并且對(duì)產(chǎn)酶的影響順序從大到小依次為：含水量、發(fā)酵溫度、木薯渣含量。

通過(guò)分析回歸方程，得到最佳產(chǎn)酶方案為：木薯渣質(zhì)量分?jǐn)?shù)15.99%；含水量56.27%；發(fā)酵溫度36.23℃，最高產(chǎn)酶量為1 258.74 U/g。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶驗(yàn)證試驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)的平均值為1 249.37 U/g與預(yù)測(cè)值1 258.74 U/g相差0.74%，說(shuō)明此響應(yīng)面模型可靠性高，所得產(chǎn)酶條件可用于指導(dǎo)實(shí)際發(fā)酵。

3 討論

本研究以木薯渣和麩皮混合物為碳源產(chǎn)木聚糖酶，不僅能充分合理的利用木薯渣和麩皮，還能制成具木聚糖酶活力的飼料添加劑，從而提高飼料利用率、促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展。相對(duì)于以玉米粉、豆粕等為碳源，則較大的降低了成本。

本研究以木薯渣和麩皮為基料，黑曲霉為菌種固態(tài)發(fā)酵，經(jīng)過(guò)一系列的條件優(yōu)化木聚糖酶活力最高為1 258.74 U/g，是優(yōu)化前的3.26倍，優(yōu)化效果顯著。以黑曲霉為菌種產(chǎn)木聚糖酶的研究很多，如李愛(ài)軍等[15]以黑曲霉固態(tài)發(fā)酵豆皮，最高酶活力為366.29 U/g，本研究酶活力是其3.44倍。閆振麗等[16]以黑曲霉固態(tài)發(fā)酵麩皮，最高酶活力為200.34 U/g，本研究是其6.28倍。但與周晨妍等[11]的14 698.21 U/g相比本研究的酶活力仍然很低，有待提高。

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Optimizedsolid-statefermentationofAspergillusnigerforproductionofxylanaseusingcassavadregsandbran

WANG Feng-lin,YUAN Xin-xin,TIAN Ya-ru, HUANG Zeng-fei,WANG Kun,CHEN Hai,LV Wen-zhu,WEN Rong-hui

(College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530005，China)

The cassava dregs and bran were fermented byAspergillusnigerGXH-1 strain to produce xylanase. Xylanase production conditions were optimized by single factor and response surface experiments. The optimum conditions for producing xylanase were as follows: the composition of culture medium was 15.99% cassava dregs and 84.01% bran, the nitrogen source was 1.60% (NH4)2SO4, the water content was 56.27%, the content of KH2PO4and NaOH were 0.12% and 0.20%, respectively, the inoculum was 4.0%, the fermentation temperature was 36.23℃ and the time was 68 h. Under the conditions, the enzyme activity of xylanase produced reach 1 258.74 U/g, which was 3.26 times higher than that before optimization.

feed additives; bran;cassava dregs;xylanase enzyme;Aspergillusniger;fermentation

2017-07-18；

2017-07-30

2015年南寧市西鄉(xiāng)塘區(qū)科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項(xiàng)目。

王鳳林(1989-)，男，碩士,研究方向?yàn)閯?dòng)物飼料發(fā)酵。

溫榮輝(1973-)，男，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué)。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.10.011

S816.6

A

1003-6202(2017)10-0049-05

(責(zé)任編輯舒蓮梅)