花生雜種分子鑒定和ahFAD2基因分型技術(shù)研究進(jìn)展

袁美，王傳堂，韓鎖義，任艷，尹亮，石延茂，徐平，王效華，李雙鈴，鄭奕雄

(1. 山東省花生研究所/山東省花生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部花生生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100；2. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510225；3. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州 450002)

花生雜種分子鑒定和ahFAD2基因分型技術(shù)研究進(jìn)展

袁美1，王傳堂1，韓鎖義3，任艷1，尹亮1，石延茂1，徐平1，王效華1，李雙鈴1，鄭奕雄2

(1. 山東省花生研究所/山東省花生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部花生生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100；2. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510225；3. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，河南 鄭州 450002)

雜種真實(shí)性鑒定是花生雜交育種及遺傳學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)。本研究綜述了花生雜種F1真實(shí)性鑒定的分子標(biāo)記方法，詳述了控制花生高油酸性狀(F435型)的ahFAD2基因的檢測(cè)方法及其在雜種鑒定和高油酸育種中的應(yīng)用。

花生；雜種鑒定；高油酸含量；ahFAD2；SNP；AhMITE；SSR

花生是一種嚴(yán)格的自花授粉作物。截至目前，雜交育種依然是花生育種的主要方法。花生雜交過(guò)程包括前一天下午的去雄和第二天早晨的授粉。理想情況下，來(lái)自雜交花的果應(yīng)是真正的雜種。但在實(shí)際操作中，去雄不徹底、雜交開(kāi)始前或雜交結(jié)束后的摘花不合適等因素都會(huì)導(dǎo)致假雜種的產(chǎn)生?；ㄉs交F1代真實(shí)性鑒定常用的方法有形態(tài)學(xué)鑒定法和分子鑒定法。形態(tài)學(xué)鑒定法是觀察株高、分枝數(shù)量及類型、葉片形狀及顏色、莢果形狀及大小等性狀在雙親間的表型差異，依據(jù)各相對(duì)性狀在F1代的顯隱性特征進(jìn)行雜種鑒定，這是花生育種家長(zhǎng)期沿用的方法，也是目前應(yīng)用最多的方法。形態(tài)學(xué)鑒定法的顯著特點(diǎn)是簡(jiǎn)便、直觀，但存在鑒定周期長(zhǎng)、標(biāo)記數(shù)量不足的缺點(diǎn)，且有些形態(tài)特征易受環(huán)境條件的影響，特別是親緣關(guān)系近、性狀相似的雙親間的組合很難通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定進(jìn)行辨別。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，各種分子鑒定法應(yīng)運(yùn)而生。

隨著花生基因組學(xué)的發(fā)展，各種分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于花生的遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等方面，其中，SSR分子標(biāo)記是重復(fù)性最好、在花生中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記之一[1-12]。本研究綜述了分子標(biāo)記用于花生雜種鑒定和高油酸性狀鑒定的研究進(jìn)展，以期為花生雜交育種和分子標(biāo)記輔助高油酸花生的選育提供參考。

1 普通油酸親本雜交組合的F1鑒定

根據(jù)所用的標(biāo)記種類，花生雜種的分子鑒定法包含種子貯藏蛋白鑒別法、SSR分子標(biāo)記法、AhMITE分子標(biāo)記法和SNP標(biāo)記法等4種(見(jiàn)表1)。因種子貯藏蛋白在花生材料間有限的多態(tài)性，僅見(jiàn)1例報(bào)道使用該方法[13]。Gomez等[14]于2008年率先報(bào)道了利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合水平PAGE電泳法鑒定來(lái)自8個(gè)組合共179個(gè)單株的雜合性，真雜種比率介于50%～100%。在隨后的10年間，越來(lái)越多的報(bào)道使用SSR分子標(biāo)記鑒定F1雜種[15-17,19,21-23,25,27,31-33]。AhMITE(花生微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座子標(biāo)記)因操作性強(qiáng)、多態(tài)性高、帶型簡(jiǎn)單、重復(fù)性高等特點(diǎn)應(yīng)用于花生真?zhèn)蜦1雜種的鑒定[20,26,33]。目前花生SNP標(biāo)記在雜種鑒定上的應(yīng)用較少。韓燕等[28]利用3親本間(Tifrunner、四粒紅和魯花14)的1個(gè)SNP位點(diǎn)差異開(kāi)發(fā)成CAPS標(biāo)記，鑒定了來(lái)自4個(gè)組合的139個(gè)F1單株，發(fā)現(xiàn)真雜種比率在10.5%～36.7%之間。其他用于雜種鑒定的SNP位點(diǎn)均是基于控制花生高油酸性狀的ahFAD2基因[18,24,29,34-36]。

2 高油酸親本雜交組合的F1鑒定

自從1987 年美國(guó)的Norden等[37]篩選出油酸含量高達(dá)80%的高油酸花生自然突變體F435后，學(xué)者們圍繞花生油酸、亞油酸含量的遺傳規(guī)律及其分子基礎(chǔ)、高油酸品種的選育進(jìn)行了大量研究并取得了顯著進(jìn)展[38-48]。研究表明，花生高油酸性狀受兩個(gè)主效基因ahFAD2A、ahFAD2B控制。與普通油酸花生材料相比，屬于F435型的高油酸花生的ahFAD2A基因編碼區(qū)448 nt處堿基由G向A的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致編碼氨基酸由天冬氨酸D變?yōu)樘於０種，ahFAD2A酶活性大幅降低；同時(shí)ahFAD2B基因編碼區(qū)442 nt處插入1個(gè)A堿基，導(dǎo)致編碼蛋白提前終止，從而導(dǎo)致ahFAD2B酶活性降低(圖1)。基于上述2個(gè)SNP位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)[40]、PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法[18,54,56]、TaqMan探針?lè)╗49,50]、AS-PCR(Allele-Specific PCR)[51,52]、KASP[30,36]等方法，并用于花生雜交后代F1的真假鑒定、高油酸品種的分子輔助選擇和新種質(zhì)創(chuàng)制(見(jiàn)表1、表2)。而Patel等[53]的研究發(fā)現(xiàn)，花生高油酸化學(xué)突變體M2-225 和C458 分別是在ahFAD2B基因起始密碼子后997 bp和665 bp處存在微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件插入，導(dǎo)致基因功能喪失。

表1 分子鑒定法在花生雜種F1鑒定上的應(yīng)用匯總

注：NA表示數(shù)據(jù)不詳。

2.1 CAPS法

酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列法(CAPS法)由Chu等[40]最先提出并使用，先分別用ahFAD2A、ahFAD2B的特異引物aF19f/1056r、bF19f/FADR1(引物序列見(jiàn)表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,隨后分別用限制性內(nèi)切酶Hpy99Ⅰ和Hpy188Ⅰ酶切。ahFAD2A基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)Hpy99Ⅰ酶切后，普通油酸型(野生型，448G)可檢測(cè)出598 bp和228 bp兩個(gè)片段，而高油酸型(突變型，448A)不能被酶切，只有一個(gè)826 bp片段；ahFAD2B基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)Hpy188Ⅰ酶切后，野生型可檢測(cè)到736、263、171 bp三個(gè)片段，而高油酸型(突變型，442A插入)可檢測(cè)出550、263、213 bp 和171 bp四個(gè)片段(圖1、表2)。CAPS法被成功地用于高油酸種質(zhì)的突變類型檢測(cè)及高油酸雜交組合F1的鑒定。陳靜等[55]利用此法對(duì)5個(gè)高油酸含量花生品種(系)和2個(gè)普通油酸含量花生品種的ahFAD2 位點(diǎn)基因型進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高油酸品系材料06B16的ahFAD2B基因不是野生型但也不符合441_442insA突變類型這一特殊類型。趙術(shù)珍等[34]采用此法對(duì)來(lái)自3個(gè)雜交組合的85粒F1種子進(jìn)行分子鑒定，其中33粒種子的基因型為AaBb，平均真雜種率為33%。

圖1ahFAD2基因的結(jié)構(gòu)和ahFAD2A和ahFAD2B的突變位點(diǎn)[40]

2.2 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法

依據(jù)高油酸突變體的ahFAD2B基因編碼區(qū)442 nt處插入1個(gè)A堿基的特征(ahFAD2B441_442insA)，雜交F1真雜種應(yīng)同時(shí)具有ahFAD2B野生型及突變型基因，因此采用bF19/R1引物擴(kuò)增ahFAD2B基因，F(xiàn)1真雜種ahFAD2B野生型及突變型基因均得到擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測(cè)序峰圖上從某處開(kāi)始顯示一連串套峰，偽雜種則否。Wang等[18]應(yīng)用該種方法對(duì)來(lái)自4個(gè)組合的40個(gè)F1種子進(jìn)行分析，鑒定出了15個(gè)真雜種(圖2)。雷永等[54]利用花生ahFAD2A特異性PCR引物aF19/R3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序法調(diào)查ahFAD2A等位基因在中國(guó)花生小核心種質(zhì)中的分布，發(fā)現(xiàn)ahFAD2A突變型(ahFAD2A-m, 448bpA)的存在與其花生種仁中相對(duì)較高的油酸含量密切相關(guān)。廖伯壽等[56]使用F0.7/R3引物PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序可同時(shí)檢測(cè)ahFAD2A、ahFAD2B兩個(gè)位點(diǎn)的基因型。趙術(shù)珍等[34]、于明洋等[35]用F0.7/R3引物對(duì)大量的回交組合BCF1種子進(jìn)行鑒定。

2.3 TaqMan探針?lè)?/p>

TaqMan探針?lè)ㄊ歉叨忍禺惖亩縋CR技術(shù)，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)。2010年，Barkley等[49]報(bào)道了用TaqMan探針?lè)z測(cè)ahFAD2B基因442 bp位置堿基A的缺失插入(442delA與442insA)。隨后，報(bào)道了ahFAD2A448 bp位置G/A的TaqMan探針檢測(cè)法[50]。在一個(gè)熒光定量PCR反應(yīng)中，包含一對(duì)特異引物以及針對(duì)SNP位點(diǎn)的兩種不同熒光標(biāo)記的探針。如對(duì)ahFAD2B基因的分型，采用的熒光探針為442delA-VIC和442insA-6FAM，高油酸材料中可檢測(cè)到兩種熒光信號(hào)，但藍(lán)色熒光信號(hào)非常強(qiáng)(圖3a)，而普通油酸材料中只有綠色熒光信號(hào)(圖3b)，雜合型材料中兩種信號(hào)強(qiáng)度相似(圖3c)。在ahFAD2A的G/A分型檢測(cè)中，G448-VIC、448A-6FAM分別為檢測(cè)ahFAD2A448 bp的G(普通油酸型)和A(高油酸型)探針。在普通油酸材料(基因型Ol1Ol1)中，可檢測(cè)綠色VIC熒光信號(hào)(圖3d)，高油酸材料(ol1ol1)可檢測(cè)藍(lán)色6FAM熒光信號(hào)(圖3e)，雜交種(Ol1ol1)可檢測(cè)到兩種熒光信號(hào)(圖3f)。Mienie等[57]利用此法成功檢測(cè)了南非商業(yè)化花生品種(回交親本)和500個(gè)回交后代群體中ahFAD2基因的基因型。

注：從陰影堿基處開(kāi)始出現(xiàn)重疊峰。

圖2ahFAD2B基因的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序鑒定花生F1真雜種的峰圖[18]

注：a～c分別為ahFAD2B基因分型中的高油酸材料、普通油酸材料和雜合型材料的擴(kuò)增結(jié)果；d～f分別為ahFAD2A基因分型中的普通油酸材料、高油酸材料和雜合型材料的擴(kuò)增結(jié)果。

2.4 AS-PCR法

等位基因特異性PCR(AS-PCR)又稱為擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)PCR(ARMS-PCR，Amplication refractory mutation system PCR), 其檢測(cè)SNP的原理是Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，引物3′端最末一個(gè)堿基與目標(biāo)片段的堿基錯(cuò)配時(shí)，鏈延伸反應(yīng)就會(huì)因3′,5′磷酸二酯鍵形成的障礙而擴(kuò)增受阻，只有與SNP位點(diǎn)堿基互補(bǔ)的特異PCR引物有擴(kuò)增產(chǎn)物。Chen等[51]針對(duì)ahFAD2A的448 bp位置的G/A設(shè)計(jì)的特異引物分別為F435WT-R和F435SUB-R，ahFAD2B的442 bp位置的A插入設(shè)計(jì)引物為F435INS-R。每個(gè)PCR反應(yīng)包含3個(gè)引物，F(xiàn)435-F、 F435IC-R和一特異位點(diǎn)引物，F(xiàn)435-F/F435IC-R為一對(duì)內(nèi)對(duì)照引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物大小為250 bp,作為PCR反應(yīng)是否成功的檢測(cè)；同時(shí)F435-F為通用引物，可與任意特異SNP位點(diǎn)引物配對(duì)，如F435-F/F435WT-R的擴(kuò)增片段大小為193 bp，說(shuō)明448 bp位置為堿基G(野生型)，F(xiàn)435-F/F435SUB-R的擴(kuò)增片段大小為203 bp，則448 bp位置為堿基A(突變型)，F(xiàn)435-F/F435INS-R的擴(kuò)增產(chǎn)物為大小為195 bp或無(wú)產(chǎn)物則表明ahFAD2B的442 bp位置有A堿基的插入(突變型)或無(wú)插入(野生型)。運(yùn)用這種方法綜合3個(gè)PCR反應(yīng)結(jié)果可明確鑒別兩種基因型，普通油酸型(Ol1Ol1Ol2Ol2)和高油酸型(ol1ol1ol2ol2)。由于栽培種花生兩個(gè)亞基因組A和B高度同源，擴(kuò)增子可來(lái)自任意一種拷貝，因此這種方法存在不能區(qū)分很多基因型的缺點(diǎn)，如Ol1ol1/Ol2Ol2與ol1ol1/Ol2Ol2、Ol1Ol1/Ol2ol2與Ol1Ol1/ol2ol2。為了解決這些問(wèn)題，Yu等[52]通過(guò)在等位特異引物3′端添加錯(cuò)配堿基提高反應(yīng)的特異性，針對(duì)每個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一條特異引物，組成一套AS-PCR引物(序列見(jiàn)表2)，每個(gè)PCR反應(yīng)包含一對(duì)通用引物和一個(gè)位點(diǎn)特異引物，綜合4個(gè)反應(yīng)的結(jié)果可準(zhǔn)確判斷所有的9種基因型(表3)。孟碩等[24]用ahFAD2B442nt A插入的特異引物組合FAD2B-F+FAD2B-A/FAD2-R擴(kuò)增4個(gè)雜交組合的330個(gè)后代，230個(gè)獲得539 bp特異擴(kuò)增帶，平均真雜種率為62.16%。

2.5 KASP法

競(jìng)爭(zhēng)特異性等位基因PCR法(Kompetitive allele specific PCR ，KASP)是由英國(guó)LGC (Laboratory of the Government Chemist 政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室)有限公司推出的, 可以在單個(gè)反應(yīng)中檢測(cè)兩個(gè)等位基因。在該方法中，使用等位基因特異性引物用熱循環(huán)儀擴(kuò)增樣品DNA。等位基因特異性引物分別在其5′端與熒光染料HEX和FAM綴合。當(dāng)FRET盒引物與DNA雜交時(shí)，熒光染料和淬滅劑分離，導(dǎo)致相應(yīng)的熒光的發(fā)射，通過(guò)讀取熒光信號(hào)容易檢測(cè)基因型。KASP反應(yīng)及其組分描述于http://www.lgcgenomics.com/genotyping/kasp-genotyping-reagents/how-does-kasp-work。徐平麗等[30]設(shè)計(jì)ahFAD2A的448 bp位置的G/A特異引物分別為kFAD2A-F/A、 kFAD2A-F/G，ahFAD2B的442 bp位置的A插入或缺失的特異引物分別為kFAD2B-F/AI、kFAD2B-F/-D(表2)，這些SNP位點(diǎn)特異引物的5′端帶有LGC公司的等位基因1或2標(biāo)簽序列。每個(gè)PCR反應(yīng)包含1個(gè)通用引物和2個(gè)5′端帶等位基因1或2標(biāo)簽序列的SNP特異引物，以及公司提供的Master Mix，最后通過(guò)檢查熒光信號(hào)就可判斷SNP類型。在檢測(cè)ahFAD2B442nt A/-InDel上，KASP與TaqMan探針?lè)ǖ囊恢侣矢哌_(dá)96.7%；而針對(duì)ahFAD2A448nt G/A 差異位點(diǎn)檢測(cè)一致率僅為 71.7%。Zhao等[36]利用相同的KASP技術(shù)基于野生型和突變體ahFAD2A和ahFAD2B基因的序列設(shè)計(jì)了等位基因特異性引物(表2)，可準(zhǔn)確區(qū)分FAD2A/FAD2B野生型、突變型和雜合型三種基因型。

表2高油酸親本雜交后代的鑒定方法匯總

方法基因引物名稱及序列(5'-3')野生型擴(kuò)增片段大小(bp)或特征突變型擴(kuò)增片段大小(bp)或特征文獻(xiàn)來(lái)源CAPS法ahFAD2AaF19f:GATTACTGATTATTGACTT1056r:CCAACCCAAACCTTTCAGAG598,228826[39]ahFAD2BbF19f:CAGAACCATTAGCTTTGFADR1:CTCTGACTATGCATCAG736,263,171550,263,213和171[40]PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法ahFAD2BbF19f:CAGAACCATTAGCTTTGFADR1:CTCTGACTATGCATCAG[18]ahFAD2AaF19f:GATTACTGATTATTGACTTR3:CCCTGGTGGATTGTTCA[54]ahFAD2AahFAD2BF0.7:CACTAAGATTGAAGCTCR3:CCCTGGTGGATTGTTCA[56]TaqMan探針?lè)╝hFAD2BFAD2Bf:GCCGCCACCACTCCAACFAD2Br:TGGTTTCGGGACAAACACTTC442delA-probe:VIC-ACAGGTTC-CCTCGAC-MGBNFQ442insA-probe:6FAM-ACAGGTTCCCT-CAGAC-MGBNFQ59/6FAM60/VIC[49]ahFAD2AFAD2Af:GCCGCCACCACTCCAACACFAD2Ar:GTTATACCATGATACCTTT-GATTTTGGTTTTGProbe-448A:6FAM-CCTCGACCG-CAACG-MGBNFQProbe-G448:VIC-CCTCGACCGCGACG-MGBNFQ83/VIC83/VIC[50]ahFAD2AqFAD2A-F:GCCGCCACCACTCCAACACCqFAD2A-R:TGAGTGTGATGAAGAGG-GAGTAMRAqFAD2A-pA:TCTCTCGACCG-CAACGAAGTGTCY5-qFAD2A-pG:TTCTCTCGAC-CGCGACGAAGTGTTAMRACY5[30]ahFAD2BqFAD2B-F:GCCGCCACCACTCCAACACAqFAD2B-R:TGAGTGTGATGAAAAGG-GAAFAM-qFAD2B-p0:CCTCGAC-CGCGACGAAGTGTHEX-qFAD2B-pA442:GGTTCCCT-CAGACCGCGACGAHEXFAMAS-PCR法ahFAD2AF435-F:ATCCAAGGCTGCATTCTCACF435SUB-R:TGGGACAAACACTTCGTTF435IC-R:CTCCCTGGTGGATTGTTCAT-GT-203[51]ahFAD2BF435-F:ATCCAAGGCTGCATTCTCACF435INS-R:AACACTTCGTCGCGGTCT-195ahFAD2AFAD2A-F:GATTACTGATTATTGACTT-GCTTTGFAD2A-G:GTTTTGGGACAAACACT-TCTTCFAD2A-A:GTTTTGGGACAAACACT-TCTTTFAD2-R:CTCTGACTATGCATCAGAACT-TGT557[52]ahFAD2BFAD2B-F:CAGAACCATTAGCTTTGTAG-TAGTGFAD2B-C:AACACTTCGTCGCGGTTGFAD2B-A:AACACTTCGTCGCGGTTTFAD2-R:CTCTGACTATGCATCAGAACT-TGT539

續(xù)表2

方法基因引物名稱及序列(5'-3')野生型擴(kuò)增片段大小(bp)或特征突變型擴(kuò)增片段大小(bp)或特征文獻(xiàn)來(lái)源KASPahFAD2AkFAD2A-F/A:1_tail+TTTGGTTTTGG-GACAAACACTTCGTTkFAD2A-F/G:2_tail+GGTTTTGGGA-CAAACACTTCGTCkFAD2A-R:CCACCACTCCAACACCG-GTTCTHEXFAM[30]ahFAD2BkFAD2B-F/-D:1_tail+ACAAACACT-TCGTCGCGGTCGkFAD2B-F/AI:2_tail+GACAAACACT-TCGTCGCGGTCTkFAD2B-R:CGCCACCACTCCAACACAG-GTTHEXFAMahFAD2AAhFAD2A-Allele-l:GTTTTGGGA-CAAACACTTCGTTAhFAD2A-Allele-2:GTTTTGGGA-CAAACACTTCGTCAhFAD2A-common:CGCCACCACTC-CAACACCAllele-lTail(FAMtail):GAAGGTGAC-CAAGTTCATGCTAllele-lTail(FAMtail):GAAGGTCG-GAGTCAACGGATTHEXFAM[36]ahFAD2BAhFAD2B-Allele-l:CAAACACT-TCGTCGCGGTCTAhFAD2B-Allele-2:CAACACT-TCGTCGCGGTCGAhFAD2B-common:CCGCCACCACTC-CAACACAAllele-lTail(FAMtail):GAAGGTGAC-CAAGTTCATGCTAllele-lTail(FAMtail):GAAGGTCG-GAGTCAACGGATTHEXFAM

表3 用于ahFAD2A/ahFAD2B基因分型的4個(gè)反應(yīng)的引物組合[52]

注：每個(gè)反應(yīng)的總體積是20 μL，引物原始濃度為10 μmol/L。

3 小結(jié)

雜種F1真實(shí)性的分子鑒定是構(gòu)建遺傳研究群體的重要環(huán)節(jié)。從花生雜種真實(shí)性分子鑒定的報(bào)道來(lái)看，獲得花生真雜種F1的比率變幅很大，效果好時(shí)可達(dá)到100%，不理想時(shí)得不到真雜種。因此，對(duì)構(gòu)建遺傳研究群體的雜交組合F1的分子鑒定顯得非常必要。對(duì)雜交組合F1的分子鑒定，建議優(yōu)先選用AhMITE標(biāo)記。而對(duì)以高油酸為目標(biāo)性狀的回交BCF1的分子鑒定，可根據(jù)具體情況選擇鑒定方法。①CAPS法和TaqMan探針?lè)?zhǔn)確，但限制性內(nèi)切酶和熒光探針的合成費(fèi)較昂貴，而且后者還需熒光定量PCR儀等貴重的儀器。②與CAPS法和TaqMan探針?lè)ㄏ啾?，改進(jìn)的AS-PCR法[52]更經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)單，不需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，普通的分子實(shí)驗(yàn)室就可以開(kāi)展。③以F0.7/R3為引物的PCR產(chǎn)物測(cè)序法(一次PCR反應(yīng)和一次測(cè)序反應(yīng)，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物是一個(gè)同時(shí)包含F(xiàn)AD2A/FAD2a及FAD2B/FAD2b的混合產(chǎn)物)可同時(shí)檢測(cè)2個(gè)突變位點(diǎn)，具有經(jīng)濟(jì)、快速的優(yōu)點(diǎn)，不同產(chǎn)物的擴(kuò)增量的差別必然會(huì)在一定程度上干擾讀取結(jié)果, 因此利用測(cè)序法檢測(cè)FAD2a和FAD2b位點(diǎn)也存在一定的誤差, 雖然這種誤差很小[35]。④最近發(fā)展起來(lái)的KASP法基于自己獨(dú)特的ARM PCR原理，讓所有的位點(diǎn)檢測(cè)最終都使用通用熒光引物擴(kuò)增，這大大降低了LGC KASP的試劑成本，既有金標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確，又降低了使用成本，比TaqMan還具有更好的位點(diǎn)適應(yīng)性。而且，利用LGC公司推出的SNPline平臺(tái)可進(jìn)行高通量的檢測(cè)，因此具有高通量、高效性和低成本的優(yōu)點(diǎn)，比較適合大量樣品的快速鑒定。

[1] 王傳堂. DNA分子標(biāo)記技術(shù)在花生上的應(yīng)用研究[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 1999, 21(4): 72-76.

[2] 王傳堂, 楊新道, 于翔, 等. DNA分子標(biāo)記技術(shù)在花生品種鑒定上的應(yīng)用研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào), 2006, 21(S2): 110-113.

[3] 任小平, 姜慧芳, 廖伯壽, 等. 花生分子標(biāo)記的研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2006, 7(3): 368-371.

[4] 蘇君偉, 于樹(shù)濤, 史普想, 等. 花生分子標(biāo)記的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 39(10): 5704-5705,5710.

[5] 趙婷, 王俊宏, 徐國(guó)忠, 等. 花生高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)育種與生物技術(shù)應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2011, 32 (11): 2187-2195.

[6] 江建華, 倪皖莉, 肖美華, 等. 花生SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用現(xiàn)狀和前景 [J]. 花生學(xué)報(bào), 2012, 41 (2): 39-45.

[7] 李潔, 馬金娜, 谷獻(xiàn)鋒, 等. 分子標(biāo)記技術(shù)在花生上的應(yīng)用研究[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊, 2016(5): 17-22.

[8] 尹亮, 李雙鈴, 任艷, 等. 42個(gè)花生品種的SSR標(biāo)記指紋圖譜構(gòu)建[J]. 花生學(xué)報(bào), 2017, 46 (1): 8-13.

[9] Stalker H T, Weissinger A K, Milla-Lewis S, et al. Genomics: an evolving science in peanut [J]. Peanut Science, 2009, 36(1): 2-10.

[10] Varshney R K, Kudapa H, Roorkiwal M, et al. Advances in genetics and molecular breeding of three legume crops of semi-arid tropics using next-generation sequencing and high-throughput genotyping technologies [J]. J. Biosci., 2012, 37(5): 811-820.

[11] Pandey M K, Monyo E, Ozias-Akins P, et al. Advances inArachisgenomics for peanut improvement [J]. Biotechnology Advances, 2012, 30(3): 639-651.

[12] Guo B Z, Pandey M K, He G H, et al. Recent advances in molecular genetic linkage maps of cultivated peanut [J]. Peanut Science, 2013, 40(2): 95-106.

[13] 吳蘭榮, 陳靜, 胡文廣, 等. 利用貯藏蛋白PAGE電泳鑒定花生遠(yuǎn)緣雜種的研究[J]. 花生學(xué)報(bào), 2003, 32(1): 12-16.

[14] Gomez S M, Denwar N N, Ramasubramanian T, et al. Identification of peanut hybrids using microsatellite markers and horizontal polyacrylamide gel electrophoresis [J]. Peanut Science, 2008, 35(2): 123-129.

[15] 陳靜, 胡曉輝, 石運(yùn)慶, 等. 花生品種間雜種F1代的SSR標(biāo)記分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2009, 23(4): 617-620,625.

[16] 李雙鈴, 王輝, 任艷, 等. 利用熒光標(biāo)記SSR技術(shù)鑒定花生F1代雜交種[J]. 花生學(xué)報(bào), 2009, 38(4): 35-38.

[17] 張平湖, 劉冠明. 花生雜交F1代真假雜種SSR標(biāo)記鑒定體系的建立[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009(10): 49-51.

[18] Wang C T, Yu S L, Zhang S W, et al. Novel protocol to identify true hybrids in normal oleate×high oleate crosses in peanut [J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2010, 13(5): 18-19.

[19] 胡東青, 王秀貞, 唐月異, 等. 利用SSR標(biāo)記鑒定花生真雜種[J]. 花生學(xué)報(bào), 2012, 41(4): 22-25.

[20] 王潔, 李雙鈴, 王輝, 等. 利用AhMITE1轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記鑒定花生F1代雜種[J]. 花生學(xué)報(bào), 2012,41(2): 8-12.

[21] 洪彥彬, 李少雄, 李杏瑜, 等. 利用SSR快速鑒別花生雜交F1真?zhèn)蝃J]. 分子植物育種, 2012, 10(1): 110-114.

[22] 王瑾, 李玉榮, 張嘉楠, 等. 花生雜交種F1真?zhèn)蔚腟SR標(biāo)記檢測(cè)[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2013, 35(增刊): 171-175.

[23] Meng S, Wang X Z, Tang Y Y, et al. Identification of peanut intersectional hybrids with SSR markers [M]// Zhang T C, Nakajima M. Advances in applied biotechnology, lecture notes in electrical engineering 333. Springer-Verlag Berlin Heidellberg, 2015. DOI: 10.1007/978-3-662-46318-5_60.

[24] 孟碩, 李麗, 何美敬, 等. 高油酸花生(ArachishypogaeaL.)雜交后代ahFAD2B基因的分子標(biāo)記輔助選擇[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2015, 16(1): 142-146.

[25] 王輝, Khera P, 李雙鈴, 等. SSR分子標(biāo)記在花生雜種鑒定中的應(yīng)用[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015,44 (4): 350-354.

[26] 尹亮, 任艷, 石延茂, 等. 利用AhMITE1轉(zhuǎn)座子分子標(biāo)記鑒定栽培花生雜交F1代種子真?zhèn)蝃J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 47(12): 1-5.

[27] 曹廣英, 吳琪, 王云云, 等. 利用SSR標(biāo)記鑒定花生雜交F1代真假雜種[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 48(1): 7-10,15.

[28] 韓燕, 馬登超, 劉譯陽(yáng), 等. 利用特異性SNP位點(diǎn)鑒定花生雜交F1代真假雜種[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 48(4): 14-17.

[29] Janila P, Pandey M, Shasidhar Y, et al. Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2AandahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes [J]. Plant Science, 2016, 242: 203-213.

[30] 徐平麗, 唐桂英, 付春, 等. 高通量檢測(cè)花生油酸含量相關(guān)基因AhFAD2等位變異的方法 [J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2016,24(9): 1364-1373.

[31] 付留洋, 李麗娜, 李文靜, 等. 花生栽培種(ArachishypogaeaL.)與野生種Arachismacedoi雜種F1細(xì)胞遺傳分析[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2016, 38 (3): 300-306.

[32] 李麗娜, 杜培, 付留洋, 等. 花生栽培種與野生種(Arachisoteroi)人工雜交雙二倍體的創(chuàng)制和鑒定[J]. 作物學(xué)報(bào), 2017, 43 (1): 133-140.

[33] 李麗娜, 付留洋, 秦利, 等. 花生栽培種與野生種(Arachisstenosperma)種間雜種的創(chuàng)制、鑒定與遺傳分析[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2017, 39(2): 137-144.

[34] 趙術(shù)珍, 侯蕾, 李長(zhǎng)生, 等. 分子標(biāo)記輔助回交選育高油酸花生新種質(zhì)[J]. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2017, 39(1):30-36.

[35] 于明洋, 孫明明, 郭悅, 等. 利用回交法快速選育高油酸花生新品系[J]. 作物學(xué)報(bào), 2017, 43(6): 855-861.

[36] Zhao S Z，Li A Q，Li C S, et al. Development and application of KASP marker for high throughput detection ofAhFAD2 mutation in peanut [J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2017, 25:9-12.

[37] Norden A J，Gorbet D W，Knauft D A，et al. Variability in oil quality among peanut genotypes in the Florida breeding program[J]. Peanut Science, 1987, 14(1): 7-11.

[38] Moore K, Knauft D. The inheritance of high oleic acid in peanut [J]. J. Hered., 1989, 80: 252-253.

[39] Chu Y, Ramos L, Holbrook C C, et al. Frequency of a loss-of-function mutation in oleoyl-PC desaturase (ahFAD2A) in the mini-core of the U.S. peanut germplasm collection [J]. Crop Science, 2007, 47(6): 2372-2378.

[40] Chu Y, Holbrook C C, Ozias-Akins Peggy. Two Alleles ofahFAD2Bcontrol the high oleic acid trait in cultivated peanut [J]. Crop Science, 2009, 49(6): 2029-2036.

[41] 陳靜. 高油酸花生遺傳育種研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2011, 12(2): 190-196.

[42] 王傳堂, 王秀貞, 唐月異, 等. 中國(guó)高油酸花生種質(zhì)創(chuàng)制、品種選育進(jìn)展與建議[J]. 花生學(xué)報(bào), 2015, 44 (2): 49-53.

[43] 王傳堂, 王秀貞, 唐月異, 等. 花生屬區(qū)組間雜種高油酸自然突變體的結(jié)實(shí)特性和脂肪酸成分分析[J]. 花生學(xué)報(bào), 2016, 45(1): 48-52.

[44] 王傳堂, 王秀貞, 唐月異, 等. 高油酸大花生新品種花育961的選育[J]. 花生學(xué)報(bào), 2014, 43(4): 60-62.

[45] 遲曉元,陳明娜,潘麗娟,等. 花生高油酸育種研究進(jìn)展[J]. 花生學(xué)報(bào), 2014, 43(4): 32-38.

[46] 任麗, 谷建中, 鄧麗, 等. 高產(chǎn)高油酸花生品種開(kāi)農(nóng)176的選育[J]. 中國(guó)種業(yè), 2016(4): 59-60.

[47] 王傳堂, 唐月異, 王秀貞, 等. 7個(gè)高油酸花生新品種的豐產(chǎn)性和脂肪酸成分評(píng)價(jià)[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016,48(5): 31-34.

[48] 李栓柱,宋江春,王建玉,等. 高油酸花生遺傳育種研究進(jìn)展[J]. 作物雜志, 2017(3): 6-12.

[49] Barkley N A, Chamberlin K, Wang M L, et al. Development of a real-time PCR genotyping assay to identify high oleic acid peanuts(ArachishypogaeaL.) [J]. Molecular Breeding, 2010, 25(3): 541-548.

[50] Barkley N A, Wang M L , Pittman R N. A real-time PCR genotyping assay to detectFAD2ASNPs in peanuts (ArachishypogaeaL.) [J]. Electronic Journal of Biotechnology, 2011, 14(1): 9-10.

[51] Chen Z B, Wang M L, Barkley N A, et al. A simple allele-specific PCR assay for detectingFAD2 alleles in both A and B genomes of the cultivated peanut for high-oleate trait selection [J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2010, 28(3): 542-548.

[52] Yu H T, Yang W Q, Tang Y Y, et al. An AS-PCR assay for accurate genotyping ofFAD2A/FAD2Bgenes in peanuts (ArachishypogaeaL.) [J]. Grasas Y Aceites, 2013, 64(4): 395-399.

[53] Patel M, Jung S, Moore K et al. High-oleate peanut mutants result from a MITE insertion into theFAD2 gene[J]. Theoretical and Applied Genetics, 2004, 108(8): 1492-1502.

[54] 雷永,姜慧芳,文奇根,等.ahFAD2A等位基因在中國(guó)花生小核心種質(zhì)中的分布及其與種子油酸含量的相關(guān)性分析[J]. 作物學(xué)報(bào), 2010, 36(11): 1864-1869.

[55] 陳靜, 白鑫, 胡曉輝,等.利用CAPS標(biāo)記推測(cè)花生品種(系)FAD2位點(diǎn)基因型的研究[J]. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2013, 27(1): 28-32.

[56] 廖伯壽,雷永,姜慧芳,等. 一種花生高油酸回交育種后代基因型的快速精準(zhǔn)鑒定方法:中國(guó), CN 105200142 A. 201510675886.4[P].

[57] Mienie C M S, Pretorius A E. Application of marker-assisted selection forahFAD2AandahFAD2Bgenes governing the high-oleic acid trait in South African groundnut cultivars (ArachishypogaeaL.) [J]. African Journal of Biotechnology, 2013, 12(27): 4283-4289.

AdvancesonIdentificationofTrueF1HybridsandahFAD2GenotypingTechniqueinPeanut

Yuan Mei1, Wang Chuantang1, Han Suoyi3, Ren Yan1,Yin Liang1, Shi Yanmao1, Xu Ping1, Wang Xiaohua1, Li Shuangling1, Zheng Yixiong2

(1.ShandongPeanutResearchInstitute/ShandongProvincialKeyLaboratoryofPeanut/KeyLaboratoryofPeanutBiologyandGeneticImprovement,MinistryofAgriculture,Qingdao266100,China; 2.SchoolofAgronomy,ZhongkaiUniversityofAgricultureandEngineering,Guangzhou510225,China; 3.InstituteofEconomicalCrops,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou450002,China)

The identification of true F1hybrids is critical for peanut genetics and crossing breeding. The molecular marker methods for identification of true F1hybrids were summarized. The identification methods onahFAD2 gene conferring high oleic acid content in peanut and their application in identification of F1hybrids and high oleic acid breeding were detailed.

Peanut; Hybrid identification; High oleic acid content;ahFAD2；SNP；AhMITE；SSR

S565.203.53

A

1001-4942(2017)10-0143-08

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.031

2016-11-18；

2017-09-25

科技部“863”計(jì)劃子課題(2013AA102602)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31471533)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新重點(diǎn)項(xiàng)目(CXGC2016B02)；國(guó)家花生產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-14)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目(2015YQN21)

袁美(1972—)，女，博士，研究員，研究方向：花生生物技術(shù)育種。E-mail: yuanbeauty@126.com

李雙鈴(1971—)，男，副研究員，研究方向：花生育種與科研管理。E-mail:lisl7105@163.com 鄭奕雄(1962—)，男，博士，教授，研究方向：花生遺傳育種。E-mail: gdsscqs@163.com