HPLC-MS/MS法測定設施甜櫻桃果實中的赤霉素含量

張倩，杜海云，賈厚振，王明林，辛力

(1. 山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271000；3.泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東 泰安 271000)

HPLC-MS/MS法測定設施甜櫻桃果實中的赤霉素含量

張倩1，2，杜海云3，賈厚振1，王明林2，辛力1

(1. 山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2. 山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271000；3.泰安市食品藥品檢驗檢測中心，山東 泰安 271000)

為了測定設施甜櫻桃果實中的赤霉素含量，建立了甜櫻桃果實中赤霉酸的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)定性定量檢測方法。樣品經(jīng)乙腈提取，液-液分配法進行凈化，在SIM模式下對目標物質(zhì)進行定性和定量檢測，同時對設施甜櫻桃激素坐果果實中赤霉酸含量進行測定。結果表明，赤霉酸的定量限為4.03 μg·kg-1，在5.0～100.0 μg·L-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系，相關系數(shù)R為0.9996。方法的加標回收率為87.64%～91.75%，相對標準偏差為8.9%～13.5%，5份設施甜櫻桃樣品中赤霉酸含量在21.3～71.1 μg·kg-1。本試驗建立的方法操作簡單，靈敏度和重復性好，可用于甜櫻桃果實中赤霉酸含量檢測。

設施甜櫻桃；赤霉素；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

赤霉素(Gibberellins)是指具有赤霉烷骨架，能剌激細胞分裂和伸長的一類化合物的總稱，屬于雙萜類的植物內(nèi)源激素，由四個異戊二烯單位組成，有四個環(huán)，環(huán)上各基團的變化組合形成了各種不同活性的赤霉素[1]，現(xiàn)已分離鑒定的有100余種。赤霉素是一種高效能的廣譜性植物生長促進物質(zhì)，在落葉果樹上應用廣泛，具有誘導無子果實的形成、提高坐果率、防止落花落果、促進果實早熟和打破休眠的調(diào)控作用；還能改變一些植物雌雄比率，并使某些二年生植物在當年開花[2]。

甜櫻桃設施栽培實際生產(chǎn)過程中，由于設施內(nèi)生長環(huán)境的改變，果實成熟期提前，營養(yǎng)生長期拉長，加上管理不及時，低溫傷害、授粉受精不良、落花落果、隔年結果等現(xiàn)象時而發(fā)生，不能保證其安全生產(chǎn)，嚴重影響到果農(nóng)的經(jīng)濟收入。因此，在有些地區(qū)，果農(nóng)通過使用以赤霉素為主的復合坐果劑替代授粉，輔助果實發(fā)育。赤霉素是一種低毒的植物激素類農(nóng)藥，盡管毒性不大，但是長期、大量、不合理使用也會對人類身體健康產(chǎn)生不利影響，目前我國尚未出臺農(nóng)產(chǎn)品中赤霉素殘留檢測的國家標準。因此，開展農(nóng)產(chǎn)品如水果、蔬菜中赤霉素殘留量檢測方法的研究具有重要意義[3]。

目前赤霉素的檢測方法有毛細管氣相色譜法[4]、高效液相色譜法[5]、氣質(zhì)聯(lián)用法[6]、毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]和酶聯(lián)免疫法[8]等，有些前處理步驟較為繁瑣，有些方法靈敏度低。本研究建立了甜櫻桃果實赤霉素含量的HPLC-MS/MS定性定量檢測方法，并測定了5份設施甜櫻桃樣品中的含量，為開展赤霉素的安全性研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

供試樣品采自山東某設施甜櫻桃主產(chǎn)區(qū)5處大棚，品種均為‘紅燈’，樹齡5～7年，管理水平中等。每棚隨機選取生長勢基本一致、結果量較多、無病蟲害的植株采樣，選取大小均一、成熟度一致的果實樣品于-20℃冷凍保存待測。

1.2儀器與試劑

電子天平，粉碎機，高速臺式冷凍離心機，旋轉蒸發(fā)儀，漩渦振蕩儀，HPLC-MS/MS(TSQ Quantum Access MAX，Thermo)。

乙腈，甲醇，乙酸乙酯，氯化鈉，98%濃硫酸，去離子化純凈水，硫酸水溶液(pH=2.5)，磷酸緩沖溶液(pH=7)。

1.3液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：C18柱，150 mm×4.6 mm，5 μm；流動相：0.15%乙腈-甲酸水溶液(35∶65，V/V)，流速：0.4 mL·min-1；進樣量：30 μL。

電噴霧ESI離子源，離子源溫度：350℃；反應監(jiān)測模式SRM；脫溶劑溫度：300℃；毛細管電壓2.5 kV；輔助氣壓力2 kV；霧化氣、氣簾氣、輔助氣均為高純氮氣，碰撞氣為氬氣，使用前調(diào)節(jié)各氣體流量以使質(zhì)譜靈敏度達到檢測要求。

1.4樣品前處理

稱取5.0 g勻漿甜櫻桃果肉樣品至50 mL離心管中，加入25 mL乙腈和2.0 g氯化鈉，渦旋震蕩1 min后4 000 r/min離心10 min,下層用乙腈重復提取兩次，合并提取液45℃旋轉蒸干。用10 mL硫酸-水(pH 2.5)溶液溶解后加20 mL乙酸乙酯，渦旋混合1 min，4 000 r/min離心10 min。乙酸乙酯層轉移到燒瓶中，重復提取兩次，合并提取液。加10 mL磷酸緩沖溶液(pH 7)于提取液中，渦旋震蕩1 min，4 000 r/min離心10 min，磷酸緩沖液層轉移到離心管中，重復提取兩次，合并磷酸緩沖溶液，用硫酸-水(1∶1)調(diào)整提取物pH 2.5，然后加20 mL乙酸乙酯，渦旋1 min，4 000 r/min離心10 min，將乙酸乙酯層轉移到燒瓶中，重復提取兩次，合并提取物，45℃旋轉蒸發(fā)近干。加甲醇-水(1∶1)10 mL，渦旋混合60 s ，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾到玻璃LC小瓶中，濾液進行HPLC-MS/MS分析。

2 結果與分析

2.1赤霉素GA3的定性和定量檢測

以保留時間和離子對進行赤霉素GA3定性檢測。樣品保留時間為3.67 min。由表1可知，樣品中選擇的3個離子豐度和標準品離子豐度比基本一致，則判斷該樣品中含有GA3。

表1 離子豐度比判定標準 (%)

圖1 GA3標準品總離子流色譜圖

圖2 GA3的3個碎片離子豐度信息

表2 GA3的HPLC-MS/MS測定參數(shù)

注：“*”定量離子。

圖1和圖2分別為GA3標準品的總離子流色譜圖和碎片離子豐度信息，可看出在所采用的色譜條件下，分析物可以得到很好的分離，未發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)峰的干擾。表2為GA3的LC-MS/MS測定參數(shù)。綜合圖2和表2結果，選擇m/z=239為定量離子，采用外標法定量，在5.0 ～100.0 μg·L-1范圍內(nèi)，工作曲線線性方程為Y=2441.95X，線性相關系數(shù)R=0.9996，方法檢出限為1.21 μg·kg-1，定量限為4.03 μg·kg-1；選擇3個濃度做添加回收率試驗，回收率為87.64%～91.75%，相對標準偏差為8.9%～13.5%。

2.2甜櫻桃樣品的GA3含量

由表3可看出，5份設施甜櫻桃樣品中均檢出GA3，含量在21.3～71.1 μg·kg-1范圍內(nèi)。

表3 5份設施甜櫻桃樣品中的GA3測定結果(n=3)

3 討論

目前歐盟、日本和加拿大等組織和國家已制定了赤霉素的最大殘留限量(Maximum Residue Limit，MRL)，歐盟規(guī)定赤霉素在58種水果上的MRL為5.0 mg·kg-1，日本規(guī)定赤霉素(GA3)在42種水果中的MRL為0.2 mg·kg-1[9，10]，我國目前尚未出臺赤霉素限量標準，對照歐盟和日本限量標準，本試驗5份甜櫻桃樣品中的赤霉素含量未超標。

近年來，水果中植物生長激素的殘留問題已引起社會的廣泛關注。據(jù)報道，廣東地區(qū)330份市售水果和蔬菜中植物生長調(diào)節(jié)劑的檢出率為55.5%，赤霉素檢出數(shù)為24個，含量在0.996 ～54.6 μg·kg-1[11]；吉林省75份市售水果赤霉素檢出率為10.67%，含量為2.77～506 μg·kg-1[12]。目前我國標準化規(guī)模種植果園所占比例較少，仍以小農(nóng)散戶為主，部分果農(nóng)對于植物生長調(diào)節(jié)劑認識不足，盲目增加植物生長調(diào)節(jié)劑的使用濃度和使用次數(shù)等情況還難以完全杜絕，果品存在一定的食用安全風險。因此，建議國家加強安全標準研究，完善植物生長調(diào)節(jié)劑檢測標準體系，規(guī)范果品的標準化生產(chǎn)。

4 結論

本試驗主要圍繞甜櫻桃果實中赤霉素GA3的檢測方法展開，目標是滿足實際樣品分析需要的前提下，建立簡便、快速、高效的植物樣品中GA3檢測方法。在此基礎上，建立了GA3的液液分配提取、凈化前處理方法和HPLC-MS/MS分析方法，并將其應用于實際甜櫻桃樣品的分析中。添加回收試驗結果表明該方法重現(xiàn)性好、靈敏度高，具有較高的應用價值，5份設施甜櫻桃樣品中GA3含量為21.3～71.1 μg·kg-1。

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DeterminationofGibberellinContentinSweetCherryFruitunderProtectedCultivationbyHPLC-MS/MS

Zhang Qian1,2, Du Haiyun3, Jia Houzhen1, Wang Minglin2, Xin Li1

(1.ShandongInstituteofPomology,Taian271000,China; 2.DepartmentofFoodScienceandEngineering,ShandongAgriculturalUniversity,Taian271000,China;3.TaianCenterforFoodandDrugControl,Taian271000,China)

A qualitative and quantitative determination method for gibberellin content in sweet cherry fruit was developed by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The sample was extracted by acetonitrile, and purified by liquid-liquid distribution method, then the sample solution was qualitatively and quantitatively detected by HPLC-MS/MS with SIM mode. The results showed that the quantification limit for gibberellin was 4.03 μg·kg-1, the gibberellin standard showed a good linearity in the range of 5.0～100.0 μg·L-1with the correlation coefficient of 0.9996.The average recovery of gibberellin was 87.64%～91.75%, and the relative standard deviations was 8.9%～13.5%. The gibberellin contents in 5 samples were 21.3～71.1 μg·kg-1. This method was simple to operate with high sensitivity and good reproducibility. It could be used to determinate the gibberellin content in sweet cherry fruit.

Sweet cherry under protected cultivation; Gibberellin; High performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

S662.5

A

1001-4942(2017)10-0117-04

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.025

2017-08-29

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系水果創(chuàng)新團隊建設項目(SDAIT-06-13);山東省農(nóng)業(yè)重大應用技術創(chuàng)新項目——櫻桃采后商品化處理設備研制與試驗示范;泰安市科技計劃重大專項(201340629)

張倩,山東淄博人,在讀博士，從事果品貯藏加工方面的研究。E-mail:cherryzhang2006@126.com

辛力，研究員，主要從事果品貯藏保鮮與加工利用研究。E-mail：sdxinl：@foxmail.com