杏鮑菇的培養(yǎng)及菌種鑒定

□ 帖衛(wèi)芳 河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系 賈俊忠 巴彥淖爾市醫(yī)院 張 葉 河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系

杏鮑菇的培養(yǎng)及菌種鑒定

□ 帖衛(wèi)芳 河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系 賈俊忠 巴彥淖爾市醫(yī)院 張 葉 河套學(xué)院醫(yī)學(xué)系

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）是近年來(lái)開(kāi)發(fā)栽培成功的集食用、藥用于一體的珍稀食用菌新品種。本實(shí)驗(yàn)對(duì)市售杏鮑菇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)并進(jìn)行菌種鑒定。選用改良CYM真菌培養(yǎng)基，對(duì)其進(jìn)行菌種分離及純化培養(yǎng)，并提取總DNA進(jìn)行18S rDNA保守序列的測(cè)定，將結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，確定其菌種，為進(jìn)一步研究其營(yíng)養(yǎng)成分奠定基礎(chǔ)。

杏鮑菇；食用菌；菌種鑒定

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側(cè)耳，隸屬于擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina）， 層 菌 綱（Hymenomycetes），無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱（Homobasidiomycetidae），傘菌目（Agaricales），側(cè)耳科（Pleurotaceae），側(cè)耳屬（Pleurotus）。因其具有杏仁的香味和菌肉肥厚如鮑魚(yú)的口感而得名。其菇體具有杏仁香味，口感鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，而且還具有降血脂、降膽固醇、促進(jìn)胃腸消化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、防止心血管疾病[1-2]等功效。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究，可以為從分子水平研究杏鮑菇的營(yíng)養(yǎng)成分打下基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），購(gòu)買(mǎi)于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。DNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA 的 Fungal DNA Mini Kit， 引物的合成及測(cè)序由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 培養(yǎng)基

改良CYM培養(yǎng)基[3-4]，每升培養(yǎng)基含麥芽糖10 g，葡萄糖15 g，酵母粉2 g，蛋白胨 2 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO44.6 g，維生素B10.3 g，pH自然，固體培養(yǎng)基含0.8%瓊脂。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 杏鮑菇的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)及純化

2.1.1 杏鮑菇的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

選取菇體較肥厚的杏鮑菇用蒸餾水清洗，瀝干水分，將高溫高壓滅菌的鑷子剖開(kāi)子實(shí)體的表面，另取滅菌鑷子插入子實(shí)體中部取出部分子實(shí)體，接種于改良CYM培養(yǎng)基上。菌種于一般于接種兩周后長(zhǎng)出。

2.1.2 杏鮑菇的純化

待菌絲長(zhǎng)出后連續(xù)轉(zhuǎn)接5次以上進(jìn)行純化。純化好的菌絲置于4 ℃及28 ℃培養(yǎng)箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 杏鮑菇基因組DNA的提取

稱取菌絲體2 g，液氮研磨至粉末狀。之后提取過(guò)程按照DNA提取試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

2.3 杏鮑菇的18S rDNA的鑒定及測(cè)序

根據(jù)真核生物18S rDNA保守序列設(shè)計(jì)引物18S rDNA（up）和18S rDNA（down）[5]。

引物的設(shè)計(jì)用DNAMAN生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)引物

18SrDNA（up）：5’-AGCGAAAC TGCGAATGGC -3’

18SrDNA（up）：5’-CATCCTTG GCAAATGCTTTC -3’

在25 mL的PCR反應(yīng)體系中加入：DNA模 板 2 mL，2╳ Es Taq Master-Mix 12.5 mL，相應(yīng)的引物（10 μmol/L）各1 mL，ddH2O 8.5 mL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保溫1 min。

以上PCR結(jié)果送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 杏鮑菇的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

分離純化后在實(shí)驗(yàn)條件下，以改良CYM為培養(yǎng)基，20 ℃培養(yǎng)約兩周后長(zhǎng)出的純化杏鮑菇菌落。邊緣有較粗糙的白色突起，如圖1所示。

3.2 杏鮑菇基因組DNA的提取及18S rDNA的鑒定

3.2.1 杏鮑菇基因組DNA的提取

杏菇鮑總DNA的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。由圖2可見(jiàn)，DNA條帶清晰，點(diǎn)樣孔中無(wú)蛋白等殘留，可以用于進(jìn)一步的PCR鑒定。

表1 杏鮑菇基因組DNA 18S保守序列表

圖1 在改良CYM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的杏鮑菇菌落

圖2 杏鮑菇基因組DNA電泳圖M：λDNA/HindIII＋ EcoRI Marker；CK：負(fù)對(duì)照（ddH2O）；1、2：杏鮑菇基因組DNA

圖3 杏鮑菇18SrDNA PCR電泳圖M：λDNA/HindIII＋ EcoRI Marker；CK： 負(fù) 對(duì) 照（ddH2O）；1、2：杏鮑菇18S rDNA

3.2.2 杏鮑菇18SrDNA的鑒定

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，杏鮑菇18S rDNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示，其長(zhǎng)度大約0900 bp。

3.3 測(cè)序結(jié)果分析

對(duì)照真核生物rDNA 18S保守序列設(shè)計(jì)引物18S rDNA（up）和18S rDNA（down），以杏鮑菇基因組DNA為模板擴(kuò)增到長(zhǎng)度1847 bp的序列，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表1。

將測(cè)序所得的杏鮑菇18S rDNA序列在NCBI上進(jìn)行比對(duì)確定其為Pleurotus屬的雙芹側(cè)耳Pleurotus eryngii。

4 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)上采買(mǎi)的杏鮑菇進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件下的培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)反復(fù)純化確定其最適生長(zhǎng)環(huán)境，并對(duì)純化后的真菌提取了基因組DNA，通過(guò)DNAMAN軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物合成后進(jìn)行了18S rDNA序列的PCR，結(jié)果顯示得到的真菌保守序列為847 bp的堿基。將測(cè)序結(jié)果放在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)確定其為側(cè)耳屬的杏鮑菇。以上工作為下一步在分子水平研究杏鮑菇的營(yíng)養(yǎng)成分奠定了基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)

[1]馬璐,杜雙田,金凌云,等.杏鮑菇營(yíng)養(yǎng)生理[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào),2010(9):129-134.

[2]張化朋,張靜,劉阿娟,等.杏鮑菇營(yíng)養(yǎng)成分及生物活性物質(zhì)分析[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2013(3):307-309.

[3]趙潤(rùn),郭成金.冬蟲(chóng)夏草菌絲體液體培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2008(1):8-11.

[4]陸文梁,林忠平,林志彬.靈芝[M].北京:科學(xué)出版社,1985.

[5]Noriko Kinjo, Mu Zang.Morphological and phylogenetic studies on Cordyceps sinensis distributed in southwestern China[J].Mycoscience,2001(42):567-574.

河套學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目自然科學(xué)青年項(xiàng)目（編號(hào)：HTXYZQ13010）。

帖衛(wèi)芳（1984—），女，山西大同人，碩士，講師。研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。