TLC法快速辨別與真?zhèn)舞b定川黃柏和關黃柏

梁鳳蘭,趙海洲,練益成,黃政貴

（1.肇慶學院生命科學學院，廣東肇慶526061；2.肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶526061；3.廣東省湛江市食品藥品檢驗所，廣東湛江524022）

TLC法快速辨別與真?zhèn)舞b定川黃柏和關黃柏

梁鳳蘭1,趙海洲1,練益成2,黃政貴3

（1.肇慶學院生命科學學院，廣東肇慶526061；2.肇慶學院食品與制藥工程學院，廣東肇慶526061；3.廣東省湛江市食品藥品檢驗所，廣東湛江524022）

為了建立中藥材川黃柏(Phellodendri Chinense)和關黃柏(Cortex Phellodendri Amurensis)的快速辨別和真?zhèn)舞b定方法，基于川黃柏含極少量黃柏酮而關黃柏含大量黃柏酮，同時川黃柏和關黃柏兩者均含有鹽酸小檗堿，用薄層色譜法中的分級展開法，在日光燈下將樣品與黃柏酮標準品對照，通過兩者顯著差異性快速辨別川黃柏和關黃柏，同時在紫外燈下與鹽酸小檗堿標準品對照實現(xiàn)真?zhèn)舞b定.該方法操作簡單，具有快速，分離效果和重現(xiàn)性好的優(yōu)點.薄層色譜法能夠應用于川黃柏與關黃柏的快速辨別和真?zhèn)舞b定，有助于該類中藥材的質量控制.

川黃柏；關黃柏；薄層色譜法；差異性辨別；真?zhèn)舞b定

黃柏為蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮，習稱“川黃柏”.關黃柏為蕓香科植物黃檗的干燥樹皮[1].川黃柏和關黃柏是臨床常用中藥，味苦性寒，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡等作用[2].川黃柏與關黃柏的成份有較大的區(qū)別，脂肪酸的組成有比較大的差異[3].《中國藥典》將川黃柏與關黃柏分列為兩種藥材，但沒有記載川黃柏與關黃柏的快速辨別和真?zhèn)舞b定方法[3]，只有少數(shù)文獻報道了有關川黃柏或關黃柏的鑒別研究[4-11].基于薄層色譜法對市場上流通的川黃柏、關黃柏中藥材進行快速辨別和真?zhèn)舞b定，目前還未有報道.

薄層色譜法是根據(jù)同種吸附劑對各種成分的吸附能力不同，使移動相(溶劑)流過固定相（吸附劑）的過程中，連續(xù)不斷地重復吸附和解吸附，以完成各種成分互相分離，定性分析物質成分的實驗技術，在醫(yī)學、藥學、生化、衛(wèi)生、環(huán)境、食品、化工等領域被廣泛應用.薄層色譜法的展開方法分為多級展開、分級展開和雙向展開，本研究采用分級展開方法，以同塊硅膠板沿同方向，依次使用2種展開劑進行展開，從而達到對吸附性質或分配性質存在著明顯區(qū)別的組分進行分離[12-16].

由于川黃柏含極少量黃柏酮而關黃柏含大量黃柏酮，且川黃柏和關黃柏均含有鹽酸小檗堿，而偽品不含鹽酸小檗堿，用薄層色譜法中的分級展開法，在第一級展開時在紫外燈下與鹽酸小檗堿對照品對照實現(xiàn)真?zhèn)舞b定.在第二級展開后噴以質量分數(shù)10%硫酸乙醇溶液顯色劑顯色，并與黃柏酮對照品對照，通過差異性來快速辨別川黃柏和關黃柏.為建立快速鑒定藥材真?zhèn)危鎰e川黃柏與關黃柏的技術標準提供依據(jù)，有利于該類中藥材的質量控制.

1 儀器與藥品

1.1 儀器

WFH-201B紫外透射反射儀（上海精科實業(yè)有限公司）；定量毛細管（1 μL和2 μL）.

1.2 樣品

川黃柏（四川），川黃柏（四川，批號：D1409030），川黃柏（四川,批號：150701），川黃柏（四川，帶皮），川黃柏（廣西），關黃柏（吉林），關黃柏（內蒙古），關黃柏（正品）.桐樹皮染色川黃柏偽品，楊樹皮染色川黃柏偽品.

1.3 對照品

川黃柏對照藥材（批號：12150-201105），關黃柏對照藥材（批號：120937-200506），黃柏酮對照品（批號：111923-201303），鹽酸小檗堿對照品（批號：200210）.

1.4 試劑和藥品

硅膠G板和H板（青島海洋化工集團公司），其他試劑均為分析純.

2 方法與結果

2.1 薄層板制備

將硅膠G板和H板置于105°C烘箱內進行30 min活化.

2.2 樣品溶液的配制

分別取1.2中的樣品各0.2 g置于100 mL錐形瓶中，加入20 mL乙酸乙酯，超聲處理30 min，過濾，水浴濃縮至1 mL，即得樣品溶液，備用.

2.3 對照品的配制

取0.2 g的川黃柏與關黃柏對照藥材分別置于2個100 mL錐形瓶中，加入20 mL乙酸乙酯，超聲處理30 min，過濾，水浴濃縮至1 mL，即得對照藥材溶液，備用.

取黃柏酮對照品適量，加入甲醇配制成1 mL含1 mg黃柏酮的對照品溶液，備用.

取鹽酸小檗堿對照品適量，加入甲醇配制成1 mL含1 mg鹽酸小檗堿的對照品溶液，備用.

2.4 薄層鑒別方法的建立

2.4.1 展開劑的選擇

取活化后的商品硅膠G板，點樣(點樣量均為2 μL)，在展開劑中分別展開（圖1）.

由圖1所示，展開劑b和e的分離效果較好，清晰且無拖尾，Rf值約為0.6.因此選用氯仿-甲醇（體積比7:1）展開劑為一級展開劑，石油醚（60-90）-乙酸乙酯（體積比4:3）展開劑為二級展開劑.

圖1 不同展開劑展開效果對比

2.4.2 顯色方法的選擇

試驗對于川黃柏與關黃柏的分辨以及真?zhèn)舞b別，基于是否含有鹽酸小檗堿和黃柏酮含量，因此，如何選擇這兩種物質的顯色方法十分重要.鹽酸小檗堿可以用活化后的硅膠G板點樣，選用氯仿-甲醇（體積比7:1）為一次展開劑展開晾干后，通過觀察365 nm波長處紫外光斑點來判定結果.黃柏酮的顯色方法有：用活化后的硅膠G板點樣，選用氯仿-甲醇（體積比7:1）為一級展開劑展開晾干后，再以石油醚（60-90）-乙酸乙酯（體積比4:3）為二級展開劑展開后晾干，噴以質量分數(shù)10%硫酸乙醇顯色劑在110°C下加熱至斑點清晰（圖2a），或者噴以質量分數(shù)5%香草酫溶液，置于110°C下加熱，直至斑點清晰（圖2b）.

圖2 顯色劑顯色效果對比

由圖2可見，a中色譜斑點清晰，顯色方法較好，b中色譜斑點非常模糊，難以分辨，所以選用a顯色方法.2.4.3 點樣量的選擇

取黃柏酮對照品和鹽酸小檗堿對照品于2塊薄層板上從左至右依次點樣，分別是0.5 μL、1 μL、1.5 μL、2 μL、2.5 μL、3 μL、3.5 μL和4 μL，并以石油醚（60-90）-乙酸乙酯（體積比4:3）和氯仿-甲醇（體積比7:1）展開劑對上述對照品展開，結果如圖3所示.

圖3 點樣量對比

由圖3所示，黃柏酮從第四個點開始斑點均顯示清晰，鹽酸小檗堿從第二個點開始斑點均顯示清晰，因此選擇2 μL為黃柏酮對照品點樣量，1 μL為鹽酸小檗堿對照品點樣量.

2.4.4 溫度的影響

分別取黃柏酮和鹽酸小檗堿對照品，點樣量為2 μL和1 μL；取川黃柏對照藥材、關黃柏對照藥材和川黃柏、關黃柏樣品，點樣量為2 μL，點于活化后的薄層板上，分別在 6 °C（圖4 a和b）、30 °C（圖4 c和d）中同時展開，取出晾干，在365 nm紫外光下觀察熒光，然后噴質量分數(shù)10%硫酸乙醇顯色劑顯色，在日光下觀察.

圖4 不同溫度下效果對比

如圖4所示，在一定的相對濕度（60%）下，a-d的Rf值均約為0.55，表明在6～30°C溫度范圍內對鑒別無明顯的影響.

2.4.5 濕度的影響

在活化后的薄層板上點樣黃柏酮對照品2 μL，關黃柏樣品2 μL，鹽酸小檗堿對照品1 μL，然后在不同相對濕度（20%、50%和80%）的層析缸中分別展開，顯色，檢視（表1和圖5）.

表1 不同相對濕度條件

圖5 不同相對濕度下對比

結果顯示，相同溫度（28 °C）下，相對濕度為20%（a、d）、50%（b、e）和80%（c、f）時，對應的Rf值分別為0.72、0.64和0.55，可見相對濕度會影響展開效果：相對濕度越高，對應的Rf值就越??；相對濕度越低，色譜斑點變得模糊且分散.因此，在進行實驗時控制相對濕度為45%～60%.

2.4.6 溶劑的影響

由于黃柏酮與鹽酸小檗堿均溶于甲醇和乙酸乙酯，因此分別使用甲醇和乙酸乙酯配制對照品溶液與釋稀樣品溶液，進而比較其對展開效果的影響，由圖6所示，2種溶劑對實驗結果均無明顯影響.

圖6 乙酸乙酯、甲醇對實驗結果的影響

2.4.7 展開劑的預飽和時間對實驗結果的影響

分別取黃柏酮對照品，川黃柏樣品各2 μL，鹽酸小檗堿對照品1 μL點于活化后的薄層板，比較不同預飽和時間（5 min和30 min）對實驗結果的影響，由圖7可知兩者的Rf值均為0.4，而b、d的斑點更為清晰，分離效果更好，因此預飽和時間選擇30 min為佳.

圖7 預飽和時間對比

2.5 樣品檢測

取不同的10種樣品溶液在常溫（25°C）和相對濕度（61%）的條件下，與川黃柏、關黃柏對照藥材、黃柏酮對照品，在預制硅膠G板上點樣，一次展開劑為氯仿-甲醇（體積比7:1），二次展開劑為石油醚（60-90）-乙酸乙酯（體積比4:3），展開后噴以質量分數(shù)10%硫酸乙醇顯色劑顯色.結果如圖8所示，圖8a和b中3～5和11與c和d中3的樣品中均含有黃柏酮，表明川黃柏（廣西）是關黃柏；而2個偽品（圖a和b中的12，圖8c和d中的7）均不含鹽酸小檗堿與黃柏酮，此結果與高效液相色譜分析結果一致，表明該方法適合于關黃柏、川黃柏的快速鑒別.

圖8 基于TLC法的樣品檢測結果

3 結果與討論

目前川黃柏和關黃柏的鑒別是通過對川黃柏與關黃柏的來源、藥材性狀、顯微鑒別等方面進行辨別[3]，但它們性狀極為相似，還需要用到顯微鑒別，步驟較為復雜且對鑒別人員的要求較高；同時，在川黃柏藥材薄層色譜特征鑒別研究[9]中，雖然做出了對川黃柏和關黃柏的快速鑒別，但無真?zhèn)舞b別判斷，且其中的顯色方法重復性較差.研究采用薄層色譜法中二級展開方法，在同一薄層硅膠G板上，以第一次展開劑為氯仿-甲醇（體積比7:1），在365 nm波片下與鹽酸小檗堿對照品色譜圖比較鑒別川黃柏真?zhèn)?，以第二次展開劑為石油醚（60-90）-乙酸乙酯（體積比4:3），展開后噴以質量分數(shù)10%硫酸乙醇顯色劑顯色，與黃柏酮對照品色譜圖比較進行川黃柏與關黃柏辨別.該方法不但可以鑒別川黃柏及關黃柏的真?zhèn)?，還能進一步辨別川黃柏與關黃柏，且對人員設備要求低，具有前處理簡便快捷、成本低、準確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)勢，為川黃柏及關黃柏的質量控制及市場監(jiān)管提供了有效手段.

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Rapid Distinguishment and Identification of Cortex Phellodendri Chinenseand Cortex PhellodendriAmurensis Based on TLC

LIANG FengLan1,ZHAO HaiZhou1,LIAN Yicheng2,HUANG ZhengGui3
(1.School of Life Sciences,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China;2.School of Food and Pharmaceutical Engineering,Zhaoqing University,Zhaoqing,Guangdong 526061,China;3.Zhanjiang Institute for Food and Drug Control,Zhanjiang,Guangdong 524022,China)

The method of grading expansion in TLC is used to establish a method for rapid distinguishment and identification ofCortex Phellodendri ChinenseandCortex Phellodendri amurensisascortex phellodendri amurensiscontains plenty of obacunone butcortex phellodendri chinensecontains a little,and bothcortex phellodendri chinenseandcortex phellodendri amurensiscontain berberine hydrochloride.Cortex phellodendri chinenseandcortex phellodendri amurensisare rapidly distinguished based on the significant differences comparing the two samples withobacunonestandard under the light.The identification of authenticity is achieved by comparing the samples withberberinehydrochloride standard under the UV lamp.This method is easy,effective and good at reproducibility of thin layer chromatography.TLC method can be used in the rapid distinguishment and identification ofcortex phellodendri chinenseand cortex phellodendri amurensis,benefiting the supervision and inspection of these Chinese medicinal materials.

Cortex Phellodendron;Cortex Phellodendron Amurensis;TLC;differential distinguishment;identification

R927

A

1009-8445（2017）05-0044-08

2017-02-26

梁鳳蘭（1982-），女，肇慶學院生命科學學院實驗師.

黃政貴（1982-），男，廣東省湛江市食品藥品檢驗所.

（責任編輯：姜學霞，張寶杰）