急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立及模型維持時間觀察

蔡唐彥，王旭，何湞，鄭乃熙，詹正烜，張英杰，張藝強，蘇友新,2*

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122； 2. 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州 350101)

研究報告

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的建立及模型維持時間觀察

蔡唐彥1，王旭1，何湞1，鄭乃熙1，詹正烜1，張英杰1，張藝強1，蘇友新1,2*

(1. 福建中醫(yī)藥大學(xué)，福州 350122； 2. 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州 350101)

目的建立急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis，AGA)大鼠模型并觀察其維持時間。方法采用25 mg/mL尿酸鈉(monosodium urate，MSU)晶體混懸液踝關(guān)節(jié)腔注射復(fù)制大鼠AGA模型，多個時間點動態(tài)觀察8 d，以大鼠受試踝關(guān)節(jié)局部皮溫、腫脹度、步態(tài)、關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞及其滑膜組織病理形態(tài)學(xué)改變等指標(biāo)判斷是否成模及其維持時間。結(jié)果造模后3 h，生理鹽水組和模型組均可見踝關(guān)節(jié)腫脹，皮溫升高，步態(tài)異常，關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞數(shù)增多，滑膜組織增生、毛細(xì)血管充血、滑膜細(xì)胞排列紊亂等炎癥表現(xiàn)，兩組以上指標(biāo)與空白組比較差異均有顯著性(P<0.01)；造模后4 h，生理鹽水組以上炎癥表現(xiàn)明顯減輕，較3 h時差異有顯著性(P<0.01)，而模型組較3 h時加重(P<0.01)，并且與生理鹽水組比較差異有顯著性(P<0.01)；造模后24 h，生理鹽水組各項指標(biāo)恢復(fù)正常，而模型組炎癥繼續(xù)加重；造模后48～72 h，模型組腫脹、皮溫、步態(tài)異常等局部炎癥達(dá)到高峰；造模后96～168 h，模型組踝關(guān)節(jié)局部炎癥逐漸減輕，但各項指標(biāo)與空白組比較差異仍有顯著性(P<0.01)；造模后192 h，模型組腫脹、皮溫、步態(tài)異常等外在炎癥表現(xiàn)恢復(fù)正常，而炎性細(xì)胞數(shù)及滑膜病理變化與空白組比較差異仍均有顯著性(P<0.01)。結(jié)論采用MSU晶體混懸液踝關(guān)節(jié)腔注射可在造模后4 h成功制備并鑒定出AGA大鼠模型，且至少能維持到造模后168 h。

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；大鼠模型；尿酸鈉；維持時間

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis)是臨床常見病，發(fā)作時嚴(yán)重影響患者的日常生活[1]。建立AGA動物模型是研究本病的前提，目前建立AGA動物模型的方法較多，其中采用尿酸鹽關(guān)節(jié)腔注射復(fù)制AGA模型具有易操作、成功率高等優(yōu)點，應(yīng)用最為廣泛[2-4]。然而大多數(shù)研究缺乏動物成模判斷標(biāo)準(zhǔn)，所用的指標(biāo)特異性不高、也不一致，對模型維持時間的研究也尚未深入[5]。為此，本實驗在參考AGA模型相關(guān)文獻(xiàn)[6，7]及前期預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，選擇踝關(guān)節(jié)局部注射MSU晶體混懸液的方法復(fù)制AGA大鼠模型，并采用多個時間點動態(tài)觀察與AGA密切相關(guān)的踝關(guān)節(jié)皮溫、腫脹、步態(tài)、關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞、關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學(xué)等，以探討該模型成模的判斷指標(biāo)及其維持時間。

1 材料與方法

1.1動物及分組

3月齡SPF級雄性SD大鼠180只，體重200±20 g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供【SCXK(滬)2012-0002】，委托福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)【SYXK(閩)2014-0001】。福利倫理審查號：福中醫(yī)【2016】倫理審字第(017)號。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白組、生理鹽水組和模型組，每組各60只。

1.2主要的試劑及儀器

MSU晶體(美國Sigma公司，批號101498836)；吐溫80(上海古朵生物科技有限公司，批號304A054)；ZH-YLS-7B足趾容積測量儀(安徽正華生物儀器有限公司)；DT-810非接觸紅外線額溫計(深圳華盛昌機(jī)械實業(yè)有限公司)；RM2235切片機(jī)(德國Leica公司)；RH-B-1-S25加熱磁力攪拌器(德國IKA公司)；DM4000B-LED顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3方法

1.3.1 MSU晶體混懸液制備[8]

取500 mg MSU晶體，加2 mL吐溫80，再加無菌生理鹽水用磁力攪拌器加熱攪拌，直至晶體完全溶解，定容至20 mL，制成25 mg/mLMSU晶體混懸液，高壓滅菌后，于4℃保存，用前搖勻。

1.3.2 模型造模方法

SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，參照Coderre造模方法[9]，乙醚麻醉后以大鼠右后肢背側(cè)正中踝關(guān)節(jié)與脛腓骨之間的關(guān)節(jié)腔為進(jìn)針點，將踝關(guān)節(jié)擺放成直角，充分暴露踝關(guān)節(jié)與脛腓骨的間隙，注射針頭與脛骨成45°夾角插入關(guān)節(jié)腔，模型組注射0.2 mL 25 mg/mL MSU晶體混懸液，生理鹽水組以同樣方法注射0.2 mL無菌生理鹽水，空白組不予任何處理。

1.3.3 指標(biāo)及其檢測

前期預(yù)實驗結(jié)果提示造模后1～2 h模型組僅受試踝關(guān)節(jié)輕微腫脹，其他AGA外在表現(xiàn)不明顯，故本研究從造模后3 h開始觀察并記錄。

(1)皮溫

用非接觸紅外線額溫計測量造模后3、4、24、48、72、96、120、144、168、192 h大鼠右踝關(guān)節(jié)進(jìn)針點為中心同一部位的局部皮溫值。

(2)腫脹度

參照上述時間點，采用足趾容積測量儀測量右踝關(guān)節(jié)同一部位的容積值，以造模前后容積的差值作為腫脹度。

(3)步態(tài)分級

參照上述時間點觀察步態(tài)變化，根據(jù)文獻(xiàn)分級標(biāo)準(zhǔn)改良[10，11]：0級：正常行走；I級：輕微跛行，受試下肢略有彎曲；II級：中度跛行，受試下肢剛觸及地面；III級：重度跛行，受試下肢離開地面，3足著地行走。

(4)踝關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞含量及關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學(xué)變化

于上述時間點每組各取6只大鼠，以300 mg/kg 10%水合氯醛腹腔麻醉，備皮，碘伏消毒，切開右踝關(guān)節(jié)囊，用1 mL生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，收集沖洗液，于載玻片上涂片，4%多聚甲醛溶液固定，再進(jìn)行HE染色，光鏡下取 5個隨機(jī)視野進(jìn)行炎性細(xì)胞計數(shù)，取均值。將沖洗完關(guān)節(jié)液的大鼠切取踝關(guān)節(jié)及其周圍軟組織(關(guān)節(jié)近側(cè)及遠(yuǎn)側(cè)各保留約0.5 cm)，去皮，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋、切片和HE染色，光鏡下觀察滑膜組織形態(tài)學(xué)變化，并根據(jù)滑膜組織形態(tài)學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行評分。

1.4統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1一般狀態(tài)的觀察與比較

實驗過程中，空白組大鼠精神、飲食正常，皮毛光澤，活潑好動。與空白組比較，生理鹽水組在造模后24 h內(nèi)精神、飲食尚可，皮毛欠光澤，活動減少；模型組在造模后1周內(nèi)精神、飲食欠佳，皮毛無光澤，懶動，右踝關(guān)節(jié)腫脹，皮色變紅，皮溫升高，行走遲緩，甚至出現(xiàn)跛行、右足蜷縮等(見圖1)。

圖1 造模后4 h各組大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)皮色、腫脹對比Fig.1 Comparison of the right ankle skin color and swelling in the rats of blank (A), saline (B) and model (C) groups at 4 h after modeling

2.2不同時間點皮溫比較

造模后3～4 h，生理鹽水組和模型組踝關(guān)節(jié)局部皮溫較空白組均升高(P<0.01)；造模后24 h，模型組皮溫持續(xù)上升，而生理鹽水組恢復(fù)正常；造模后48～72 h，模型組皮溫達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，至造模后192 h時恢復(fù)正常。(見表1)

表1 不同時間點皮溫比較℃)Tab.1 Comparison of the skin temperature in the rats at different time points

注：與空白組比較，1)P<0.01；與生理鹽水組比較，2)P<0.01；與本組造模后3 h比較，3)P<0.01。

Note. 1) Compared with the blank group,P<0.01. 2) Compared with the saline group,P<0.01.3) Compared with the same group at 3 h after modeling,P<0.01.

2.3不同時間點腫脹度比較

造模后3～4 h，生理鹽水組和模型組踝關(guān)節(jié)輕微腫脹，與空白組比較差異有顯著性(P<0.01)；造模后24 h，模型組踝關(guān)節(jié)腫脹明顯，而生理鹽水組恢復(fù)至正常；造模后48～72 h，模型組腫脹達(dá)到高峰，隨后逐漸消退，至造模后192 h時恢復(fù)正常。(見表2)。

2.4不同時間點步態(tài)比較

造模前，每只大鼠均為正常行走步態(tài)。造模后3～4 h，生理鹽水組和模型組右后肢略有彎曲，輕微跛行，與空白組比較差異均有顯著性(P<0.01)；造模后24 h，模型組步態(tài)異常更為明顯，而生理鹽水組步態(tài)恢復(fù)正常；造模后48～72 h，模型組右后肢彎曲最為明顯，重度跛行；造模后96～168 h，模型組步態(tài)異常逐漸改善；造模后192 h，模型組步態(tài)恢復(fù)正常。(見表3)。

表2 不同時間點腫脹度比較Tab.2 Comparison of the degrees of joint swelling in the rats at different time points

注：與空白組比較，1)P<0.01；與生理鹽水組比較，2)P<0.01；與本組造模后3 h比較，3)P<0.01。

Note. 1) Compared with the blank group,P<0.01. 2)Compared with the saline group,P<0.01. 3) Compared with the same group at 3 h after building,P<0.01.

表3 不同時間點步態(tài)變化比較(n=6，只)Tab.3 Comparison of the changes of gait in the rats at different time points

2.5不同時間點關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞含量比較

造模后3～4 h，生理鹽水組和模型組關(guān)節(jié)液中炎性細(xì)胞數(shù)較空白組均有增加(P<0.01)；造模后24 h，模型組炎性細(xì)胞數(shù)持續(xù)增多，而生理鹽水組恢復(fù)至正常。造模后48～72 h，模型組炎性細(xì)胞數(shù)達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，到造模后192 h時與空白組比較差異仍有顯著性(P<0.01)。(見表4，圖2)。

2.6不同時間點關(guān)節(jié)滑膜組織病理形態(tài)學(xué)比較

造模后3～4 h，生理鹽水組和模型組病理切片可見滑膜組織增生，滑膜細(xì)胞排列紊亂，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血并伴有炎性細(xì)胞浸潤等，與空白組比較差異均有顯著性(P<0.01)；造模后24 h，模型組滑膜組織炎癥持續(xù)加重，而生理鹽水組恢復(fù)至正常；造模后48～72 h，模型組滑膜組織炎癥達(dá)到高峰，隨后逐漸減輕，到造模后192 h時與空白組比較差異仍有顯著性(P<0.01)。(見表5，圖3)。

表4 不同時間點關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞含量比較個)Tab.4 Comparison of the amount of inflammatory cells in synovial fluid in the rats at different time points

注：與空白組比較，1)P<0.01；與生理鹽水組比較，2)P<0.01；與本組造模后3 h比較，3)P<0.01。

Note. 1) Compared with the blank group,P<0.01. 2) Compared with the saline group,P<0.01. 3) Compared with the same group at 3 h after modeling,P<0.01.

注：A.空白組； B.生理鹽水組； C.模型組。箭頭所指表示關(guān)節(jié)液中的炎性細(xì)胞。圖2 造模后48 h各組大鼠踝關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞(HE染色，×200)Note. Arrows indicate inflammatory cells in the synovial fluid. A: Blank group B: Saline group C: Model group.Fig.2 Inflammatory cells in the ankle joint synovial fluid at 48 hours after modeling in the rats in each group(HE staining. ×200)

組別Groups3h4h24h48h72h空白組Blankgroup0.83±0.750.67±0.520.52±0.330.55±0.500.41±0.17生理鹽水組Salinegroup2.00±0.891)1.67±0.521)3)0.55±0.500.52±0.330.52±0.33模型組Modelgroup2.17±0.411)3.33±0.821)2)3)6.17±0.981)2)10.17±0.981)10.33±1.031)組別Groups96h120h144h168h192h空白組Blankgroup0.55±0.500.52±0.330.41±0.170.41±0.170.52±0.33生理鹽水組Salinegroup0.52±0.330.55±0.500.52±0.330.52±0.330.55±0.50模型組Modelgroup9.50±0.841)7.67±1.211)5.17±0.751)4.33±0.821)3.00±0.891)

注：與空白組比較，1)P<0.01；與生理鹽水組比較，2)P<0.01；與本組造模后3 h比較，3)P<0.01。

Note. 1) Compared with the blank group,P<0.01. 2) Compared with the saline group,P<0.01. 3) Compared with the same group at 3 h after modeling,P<0.01.

注：A.空白組； B.生理鹽水組； C.模型組。A、B中箭頭所示正?；そM織，C中箭頭所指表示滑膜組織有增生、大量炎性細(xì)胞浸潤等。圖3 造模后48 h各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織病理(HE染色，×200)Note.A: Blank group; B: Saline group; C: Model group. A, B arrows refer to normal synovial tissue. C arrow refers to the proliferation of synovial tissue, a large number of inflammatory cell infiltration, etc.Fig.3 Histological changes of the ankle joint synovial tissues in the rats at 48 hours after modeling

3 討論

動物模型是醫(yī)藥學(xué)研究的重要工具[13]。通過踝關(guān)節(jié)局部注射MSU晶體混懸液復(fù)制AGA大鼠模型，其操作簡便，可控性高，重復(fù)性好，目前應(yīng)用最多。與其它造模方法相比，該造模方法對動物創(chuàng)傷較小，不會造成不可逆性傷害，方便后續(xù)研究，且模型的病理變化與痛風(fēng)急性發(fā)作時表現(xiàn)出的紅腫熱痛等趨勢一致，其癥狀、體征也較符合痛風(fēng)急性發(fā)作時的臨床表現(xiàn)[14，15]。因此，本實驗采用該造模方法復(fù)制AGA大鼠模型。

目前，判斷AGA動物模型成模指標(biāo)暫無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[16]。梁莎等[15]將病理切片中關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤、關(guān)節(jié)滑膜水腫作為判斷成模的指標(biāo)，僅從組織病理形態(tài)學(xué)改變判定是否成模，而實驗過程中動物模型的表現(xiàn)是否與痛風(fēng)發(fā)作時臨床表現(xiàn)相一致尚不可知。若把模擬痛風(fēng)發(fā)作時的表現(xiàn)與組織病理形態(tài)學(xué)改變相結(jié)合，共同作為判定成模的依據(jù)將更具說服力。為此，本實驗選取與AGA密切相關(guān)的局部皮溫、腫脹、步態(tài)、關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞數(shù)、關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)改變等指標(biāo)來綜合判斷模型成功與否。造模后4 h時模型組踝關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)明顯紅腫，皮溫升高，行走遲緩、足爪卷曲，甚至出現(xiàn)跛行、右足蜷縮等，其外在表現(xiàn)與臨床痛風(fēng)急性發(fā)作時類似。與空白組比較，模型組踝關(guān)節(jié)腫脹明顯，局部皮溫升高，步態(tài)異常，踝關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞增多，滑膜組織增生、毛細(xì)血管充血、滑膜細(xì)胞排列紊亂，與空白組比較差異有顯著性(P<0.01)。上述模型組表現(xiàn)出的紅腫熱痛與其微觀上表現(xiàn)出的關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞增多、滑膜組織病理形態(tài)學(xué)變化一致，且這與臨床痛風(fēng)急性發(fā)作類似，提示本實驗造模成功，所選取成模的判斷指標(biāo)可行。

在動物模型的研究中，保持模型穩(wěn)定，減少復(fù)制模型的自愈率尤為重要[17]。本實驗在造模后4～168 h觀察到模型大鼠在腫脹、皮溫、步態(tài)異常等方面較穩(wěn)定，且踝關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞數(shù)及滑膜病理變化仍提示為AGA模型，說明該模型在造模后1周內(nèi)保持穩(wěn)定。由于沉積在關(guān)節(jié)腔中的尿酸鹽持續(xù)刺激，在造模后192 h模型組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎外在表現(xiàn)雖消失，但炎性細(xì)胞數(shù)及滑膜病理仍未恢復(fù)正常，模型可能由痛風(fēng)急性發(fā)作期進(jìn)入慢性期?？傊?，造模結(jié)束后1周大鼠癥狀、體征、踝關(guān)節(jié)液炎性細(xì)胞數(shù)及滑膜病理變化均符合AGA大鼠模型的鑒定指標(biāo)。

通過本實驗證實，踝關(guān)節(jié)局部注射MSU混懸液引起的大鼠相關(guān)癥狀、體征及組織病理學(xué)改變與痛風(fēng)急性發(fā)作時的臨床表現(xiàn)類似，且造模后1周內(nèi)模型依舊保持穩(wěn)定，提示此法建立的AGA大鼠模型是確實可靠且相對穩(wěn)定的，是構(gòu)建AGA動物模型的理想方法。

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Establishmentofaratmodelofacutegoutyarthritisandobservationofthemodelmaintenancetime

CAI Tang-yan1, WANG Xu1, HE Zhen1, ZHENG Nai-xi1, ZHAN Zheng-xuan1, ZHANG Ying-jie1, ZHANG Yi-qiang1, SU You-xin1,2*

(1. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China； 2. Fujian Health College, Fuzhou 350101, China)

ObjectiveTo establish a model of acute gouty arthritis(AGA) in rats and observe its maintenance time.MethodsThe AGA model of rats was established by injecting monosodium urate (MSU) at the concentration of 25 mg/mL into the ankle joint cavity. The rats were observed for 8 d at different time points. Skin temperature, degree of joint swelling, gait, inflammatory cells in synovial fluid, histopathological changes of synovial tissue and other indicators were observed to determine whether the modeling and maintenance time were successful.ResultsAt 3 h after modeling, differences in the swelling of ankle joint, increase of skin temperature, abnormal gait, the number of inflammatory cells in synovial fluid, synovial hyperplasia, capillary congestion, and disarrangement of synovial cells in the rats were observed in the saline group and the model group (P<0.01). At 4 hours after modeling, the above mentioned inflammatory changes in the saline group were significantly reduced, compared with that at 3 h, showing a significant difference (P<0.01), while the inflammatory changes of the model group were increased significantly compared with that at 3 hours (P<0.01), and showed significant difference compared with the saline group (P<0.01). At 24 h after modeling, the indexes in the rats of saline group returned to normal, but the inflammation of the model group was increased. At 48-72 h after modeling, the local inflammation such as ankle swelling, skin temperature, and abnormal gait of the rats in the model group reached a peak. The inflammation of the ankle joint in the model group was gradually reduced from 96 to 168 h after the model was established, but there were still significant differences in the indexes compared with the blank group (P<0.01). At 192 h after modeling, the joint swelling, skin temperature and abnormal gait of the rats in the model group returned to normal, however, there were significant differences in the number of inflammatory cells and the pathological changes of synovial membrane compared with the blank group (P<0.01).ConclusionsA rat model of AGA can be successfully prepared and identified at 4 h after modeling by injection of MSU crystal suspension into the ankle joint cavity. This rat model of AGA can be maintained at least 168 hours after modeling.

Acute gouty arthritis; Rat models; Monosodium urate, MSU; Maintenance time

SU You-xin. E-mail： suyouxin777@hotmail.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0494-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.005

2017-03-21

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81473495)。

蔡唐彥(1990-)，女，碩士，主要研究方向：骨關(guān)節(jié)疾病的中醫(yī)藥防治與康復(fù)。E-mail： 790503018@qq.com

蘇友新(1969-)，男，博士，教授，主要研究方向：骨關(guān)節(jié)疾病康復(fù)的基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail： suyouxin777@hotmail.com