角叉菜膠誘導(dǎo)慢性非細(xì)菌性前列腺炎動(dòng)物模型的制備與評(píng)價(jià)

戴應(yīng)和，龍小琴，劉晨琪，楊淑賢，李立勇，袁經(jīng)權(quán)，易蔚，曹麗*

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所， 北京 100193； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 南寧 530001； 3. 廣西藥用植物園， 南寧 530023； 4. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150076)

研究報(bào)告

角叉菜膠誘導(dǎo)慢性非細(xì)菌性前列腺炎動(dòng)物模型的制備與評(píng)價(jià)

戴應(yīng)和1,2#，龍小琴2#，劉晨琪4，楊淑賢1，李立勇1，袁經(jīng)權(quán)3，易蔚2，曹麗1*

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所， 北京 100193； 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 南寧 530001； 3. 廣西藥用植物園， 南寧 530023； 4. 哈爾濱商業(yè)大學(xué)，哈爾濱 150076)

目的建立化學(xué)性慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic non-bacterial prostatitis，CNP)動(dòng)物模型，為CNP的發(fā)病機(jī)制及藥物研究提供可靠的模型動(dòng)物及評(píng)價(jià)方法。方法將SD雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型A、B、C組，模型A、B、C組分別用1%的無(wú)菌角叉菜膠注射至前列腺左右腹側(cè)葉中各20、50、100 μL；對(duì)照組每只注入50 μL滅菌的生理鹽水溶液。7 d后處理，分別從解剖學(xué)角度、前列腺指數(shù)、白細(xì)胞檢測(cè)、病理切片以及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、核因子-κB(NF-κB)、IκB激酶(IKKα)、磷酸化IKB-α(p-IKB-α)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)蛋白表達(dá)的影響5個(gè)方面進(jìn)行分析。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型A、B、C組的前列腺組織柔軟程度下降，彈性減弱，與周圍組織發(fā)生粘連；前列腺指數(shù)、白細(xì)胞總數(shù)均顯著增加(P<0.01)，A、B、C組前列腺指數(shù)的增加率分別為21.1%、61.7%和72.7%；白細(xì)胞總數(shù)增加率分別為75.0%、103.6%和114.8%；病理結(jié)果顯示A組前列腺間質(zhì)腫脹較少，B、C組組間質(zhì)明顯腫脹，C組前列腺萎縮明顯，部分腺體變性壞死；A、B、C組前列腺組織內(nèi)NF-κB、IKKα、p-IKB-α、TNF-α和COX-2表達(dá)水平出現(xiàn)不同程度的增加，NF-κB炎癥通道被激活。結(jié)論大鼠前列腺左右腹側(cè)葉注射1%的角叉菜膠各20、50、100 μL，均能夠誘導(dǎo)不同程度前列腺炎癥反應(yīng)，但20 μL劑量太小，炎癥反應(yīng)較弱，操作誤差大；100 μL炎癥反應(yīng)過(guò)強(qiáng)，有一定動(dòng)物死亡；50 μL劑量所造成的前列腺炎動(dòng)物模型最為成功，并可明顯激活NF-κB炎癥信號(hào)通路。

慢性非細(xì)菌性前列腺炎；動(dòng)物模型；角叉菜膠

前列腺是男性的主要附屬性腺之一，而前列腺炎是骨盆區(qū)域的疼痛或伴排尿不適癥狀的一組疾病，主要發(fā)生在20～40歲的男性青年人中，發(fā)病率在泌尿外科中約占25%～30%，是一種多發(fā)性疾病[1]。慢性非細(xì)菌性前列腺炎(chronic non-bacterial prostatitis，CNP)占臨床前列腺炎發(fā)病率的90%以上，其病因和病機(jī)在很大程度上還不清楚，但給患者帶來(lái)極大的痛苦，成為世界性關(guān)注的難治疾病之一[2]。為研究CNP的病因和病機(jī)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研制了各種動(dòng)物模型，因前列腺炎病因不明，假說(shuō)眾多，各種模型各有其特點(diǎn)。經(jīng)文獻(xiàn)查實(shí)，目前采用角叉菜膠誘導(dǎo)的化學(xué)性CNP模型居多，多以解剖學(xué)、前列腺指數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)、病理切片等進(jìn)行評(píng)價(jià)[3,4]。但因注射角叉菜膠的劑量不同以及評(píng)價(jià)指標(biāo)不完善，很難復(fù)制出病理過(guò)程與人體相似的動(dòng)物模型。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)摸索角叉菜膠的注射劑量與評(píng)價(jià)指標(biāo)，建立具有病理過(guò)程及表現(xiàn)與人體相似、穩(wěn)定、重復(fù)性好的CNP動(dòng)物模型，為研究CNP的發(fā)病機(jī)制及藥物創(chuàng)制提供可靠的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體重200～250 g，2月齡。購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(京)2012-0001】。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料(由實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)及自由飲水，12 h循環(huán)燈光，恒定濕度，室溫(23±2)℃。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)及組織取材均于中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)院藥用植物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)設(shè)備內(nèi)進(jìn)行【SYXK(京)2013-0023】。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.1.2 主要儀器與試劑

角叉菜膠(Sigma，美國(guó))，TNF-α(產(chǎn)品編號(hào)：sc-4564)、NF-κB(產(chǎn)品編號(hào)：sc-8008)、IKKα(產(chǎn)品編號(hào)：sc-166231)、p-IKB-α(產(chǎn)品編號(hào)：sc-8404)和COX-2(產(chǎn)品編號(hào)：sc-376861)抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))，PVDF膜(Millipore公司，美國(guó))，BCA蛋白定量試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)：CW0014S)、辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔抗體(產(chǎn)品編號(hào)：CW0157S)和辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗小鼠抗體(產(chǎn)品編號(hào)：CW0152S)(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，中國(guó))其他常規(guī)試劑(北京雙環(huán)化學(xué)試劑廠，中國(guó))。MQX200 型酶標(biāo)儀(Bio-Tek，美國(guó))，Labofuge 400R型離心機(jī)(Heraeus公司，德國(guó))，CKX41型熒光倒置顯微鏡(Olympus公司，日本)，梅特勒-托利多電子天平(梅特勒-托利多公司，中國(guó))等。

1.2方法

1.2.1 模型制備方法

參考Xian Yang等[5]的方法，用1%的無(wú)菌角叉菜膠注射前列腺腹葉中，經(jīng)過(guò)刺激誘導(dǎo)建立SD大鼠化學(xué)性CNP模型：動(dòng)物先適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d按照隨機(jī)分組原則分為陰性對(duì)照組和模型A、B、C組，一共4組，每組10只。將0.1 g的角叉菜膠溶入10 mL 生理鹽水中，混勻，配制成1%的角叉菜膠生理鹽水溶液，用10%水合氯醛溶液腹腔注射(劑量：0.3 mL/100 g)使大鼠麻醉，并用剪刀剪掉其中下腹部的毛。在無(wú)菌條件下，再用酒精棉對(duì)大鼠腹部皮膚消毒，在下腹正中剪開2 cm左右的切口，逐層打開腹壁，找到膀胱，用器械輕輕挑起膀胱，并在其后方找到前列腺，用無(wú)菌微量調(diào)節(jié)注射器將20、50、100 μL的1%無(wú)菌角叉菜膠溶液分別注射到模型A、B、C組的大鼠前列腺左右腹葉上；對(duì)照組每只注入50 μL滅菌的生理鹽水溶液。將前列腺放回體內(nèi)，縫合肌肉、皮膚，消毒傷口，將大鼠回籠中飼養(yǎng)。在傷口處涂抹適量抗生素以防止傷口感染化膿，并每天觀察大鼠活動(dòng)狀態(tài)、進(jìn)食量。

注：A：麻醉后常規(guī)手術(shù)備皮；B：切開腹壁，暴露前列腺；C：向兩側(cè)注射角叉菜膠或生理鹽水；D：縫合腹壁，用適量抗生素涂抹傷口。圖1 1%角叉菜膠溶液注射到前列腺內(nèi)的手術(shù)操作過(guò)程N(yùn)ote. A. Routine skin preparation. B. Cut through the abdominal wall, and exposure of the anterior surface of the prostate. C. Bilateral injection of carrageenan solution or saline into the prostate lobes. D. Suture of the surgical incision and local use of antibiotics.Fig.1 The process of surgical operation to inject 1% carrageenan solution into the rat prostate lobes

1.2.2 樣本采集

術(shù)后7 d，麻醉大鼠，剖開腹腔，充分暴露兩側(cè)前列腺腺體。肉眼觀察其外觀形態(tài)；取出稱其濕重，取部分前列腺組織，用4%甲醛溶液固定，蘇木素-伊紅(HE)染色，做病理切片。另部分前列腺組織制備勻漿，Western blot 法測(cè)定前列腺組織內(nèi)TNF-α、NF-κB、p-IKB-α和COX-2表達(dá)的變化。

1.2.3 前列腺指數(shù)測(cè)定

前列腺指數(shù)常作為CNP的炎癥檢測(cè)指標(biāo)，通過(guò)記錄每只大鼠的前列腺組織的總濕重以及自身體重，即可得到。公式為：前列腺指數(shù)=前列腺組織總濕重/大鼠體重(單位：mg/g)。

1.2.4 白細(xì)胞檢測(cè)

用電子天平稱取每只大鼠前列腺左側(cè)背葉相同重量的小塊前列腺，放入試管內(nèi)，按4 μL/mg加無(wú)菌生理鹽水，并充分剪碎，成為混懸液體，用微量移液槍準(zhǔn)確吸取20 μL，加入0.38 mL白細(xì)胞稀釋液的試管中，充分混勻，再滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，靜置2～3 min，待白細(xì)胞下沉；用低倍顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞計(jì)數(shù)板四角4個(gè)大方格內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)。公式為：白細(xì)胞數(shù)/L=4個(gè)大方格內(nèi)的白細(xì)胞數(shù)/4 × 20 × 107

沉積物是湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，可以間接地反映水體污染情況（余輝等，2010）。沉積物是營(yíng)養(yǎng)鹽及其他污染物的主要蓄積庫(kù)，當(dāng)環(huán)境條件發(fā)生改變時(shí)，沉積物中的有機(jī)質(zhì)會(huì)礦化釋放出大量氮磷，并消耗水中的溶解氧，對(duì)水體造成二次污染（Shen et al.，2013；Wang et al.，2009；徐進(jìn)等，2014）。因此，研究沉積物中TN、TP和OM的含量及其分布特征對(duì)控制水體富營(yíng)養(yǎng)化和改善生態(tài)系統(tǒng)狀況具有重要意義（盧少勇等，2012）。

1.2.5 組織病理學(xué)檢查

取各組用4%甲醛溶液固定的前列腺組織，24 h后梯度脫水、石蠟包埋。制成切片(5 μm)。常規(guī)脫蠟脫水后，蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.6 Western Blot 檢測(cè)前列腺組織中TNF-α、NF-κB、IKKα、p-IKB-α和COX- 2的表達(dá)水平

將前列腺組織制備成勻漿，4℃低溫12 000 r /min 離心10 min。對(duì)裂解的組織總蛋白上清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將各組的蛋白濃度調(diào)到同一水平。制備10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠，每孔加蛋白樣品，經(jīng)電泳后通過(guò)半干式電轉(zhuǎn)儀將分離的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素濾膜上。將膜用5%脫脂牛奶含有0.1%吐溫20的(TBST)在搖床上封閉2 h，加入一抗后4℃下孵育過(guò)夜，將膜用TBST洗3次，每次15 min；加入二抗放在搖床孵育2 h，再次用TBST 洗3次，每次15 min，后加入發(fā)光顯色劑ECL顯色，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析白條帶灰度，對(duì)蛋白條帶用Photoshop軟件進(jìn)行掃描灰度量化分析，計(jì)算各蛋白條帶與內(nèi)參照β-actin的比值。

1.3統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1解剖學(xué)觀察

假手術(shù)組大鼠前列腺組織柔軟，有光澤，富有彈性，與周圍其他組織之間幾乎沒(méi)有粘連，在解剖過(guò)程中比較容易與其他組織分開。模型A組前列腺組織增大不太明顯，柔軟程度稍有下降，彈性減弱，與周圍組織粘連程度較輕，部分前列腺組織有少量灰白色片狀結(jié)節(jié)。模型B組前列腺組織明顯增大，柔軟程度下降，失去彈性，與周圍組織粘連程度較重，部分前列腺組織表面可見暗紅色或灰白色片狀結(jié)節(jié)。模型C組前列腺組織顯著增大，部分壞死，柔軟程度較低，無(wú)彈性，與周圍組織粘連十分嚴(yán)重，前列腺組織表面可見暗紅色或灰白色片狀結(jié)節(jié)。由解剖學(xué)觀察結(jié)果可見，模型B組炎癥程度比較合理。

與假手術(shù)組比較，模型A、B、C組中大鼠的前列腺指數(shù)均顯著增加，具有明顯差異(P<0.01)；模型A組前列腺指數(shù)的增加率為21.1%，增幅較小；模型B、C組前列腺指數(shù)的增加率分別為61.7%和72.7%，增幅比較明顯，但模型C組出現(xiàn)動(dòng)物死亡，說(shuō)明模型B組是比較合理可行的(見表1)。

表1 前列腺指數(shù)(n=10)Tab.1 Prostate indexes of the different groups

注：“─”表示死亡，與假手術(shù)組比較：**P<0.01

Note. “─”means rat death.**P<0.01, versus the sham operated control group.

2.3白細(xì)胞檢測(cè)

2.4組織病理學(xué)

從病理切片可以看出：假手術(shù)組的前列腺被膜正常，可見大小不一的前列腺腺腔，形態(tài)不規(guī)則，腔內(nèi)皺壁豐富，充滿嗜酸性分泌物；前列腺間質(zhì)無(wú)明顯腫脹，較清晰，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，偶見腔內(nèi)有粉紅染蛋白液，腺體周圍有平滑肌纖維、纖維細(xì)胞束和毛細(xì)血管。模型A組的大部分前列腺組織腺體由柱狀上皮細(xì)胞變?yōu)榘鶢?，有的為扁平狀，腺體結(jié)構(gòu)改變，充滿嗜酸性分泌物；前列腺間質(zhì)腫脹較少。模型B組的部分腺體由柱狀上皮細(xì)胞變?yōu)榘鶢?，腺管間偶見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，病理改變明顯；前列腺被膜增厚，腔內(nèi)皺壁消失，腺泡破壞。模型C組的腺體由柱狀上皮細(xì)胞變?yōu)榘鶢睿俟荛g可見炎細(xì)胞浸潤(rùn)，前列腺萎縮病理改變嚴(yán)重，說(shuō)明模型B組的造模程度比較合理(見圖2)。

2.5WesternBlot檢測(cè)前列腺組織中NF-κB、IKKα、p-IKB-α、TNF-α和COX-2表達(dá)的影響

在角叉菜膠的誘導(dǎo)下，可產(chǎn)生大量炎癥因子，而NF-κB作為經(jīng)典的炎癥相關(guān)信號(hào)通路在前列腺炎模型中扮演怎樣的角色值得關(guān)注。因此，本研究應(yīng)用Western Blot技術(shù)分析了NF-κB通路關(guān)鍵蛋白NF-κB、IKKα、p-IKB-α、TNF-α以及COX-2 的表達(dá)水平，結(jié)果見圖3和圖4。

從圖3和圖4的結(jié)果看出：與假手術(shù)組比較，除模型A組前列腺組織內(nèi)p-IKB-α、TNF-α和COX-2表達(dá)水平不明顯(P>0.05)，差異無(wú)顯著性；模型B組與C組中前列腺組織內(nèi)NF-κB、IKKα、p-IKB-α、TNF-α和COX-2表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)，差異有顯著性；模型A組前列腺組織內(nèi)NF-κB和IKKα也有不同程度的增加(P<0.05)。說(shuō)明角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠前列腺炎激活了NF-κB信號(hào)通路。

注：A. 假手術(shù)組，箭頭示前列腺腺體正常，間質(zhì)無(wú)明顯腫脹。B. 模型A組，箭頭示前列腺間質(zhì)輕度腫脹。C. 模型B組，箭頭示前列腺萎縮，纖維組織增生，間質(zhì)明顯腫脹；有大量淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞浸潤(rùn)及漿細(xì)胞分布。D.模型C組，箭頭示腺管間炎細(xì)胞浸潤(rùn)，前列腺萎縮，部分腺體變性壞死。(HE 染色，×200)。圖2 大鼠前列腺組織病理觀察Note. A.A rat of the sham operated group. The arrow indicates normal glandular structure, with no interstitial edema. B. A rat of the model group A. The arrows indicate mild interstitial edema. C. A rat of the model group B. Arrows indicate glandular atrophy, fibrous hyperplasia and interstitial lymphocyte infiltration. D. A rat of the model group C. Arrows indicate glandular atrophy and partial glandular necrosis, and interstitial lymphocyte infiltration. HE staining. ×200Fig.2 Histology of prostate tissues of the rats

注： 假手術(shù)組； 模型A組； 模型B組； 模型C組。(下圖同)圖3 大鼠前列腺組織NF-κB、IKKα以及p-IKB-α的表達(dá)水平Note.sham group Model group A Model group B Model group C (The same in the following Fig).Fig.3 Expression of NF-κB, IKKα and p-IKB-α in the prostate tissues of the rats

圖4 大鼠前列腺組織TNF-α和COX- 2 的表達(dá)水平Fig.4 Expression of TNF-α and COX- 2 in the prostate tissues of the rats

3 討論

CNP動(dòng)物模型是探索其發(fā)病機(jī)制及治療方法的基礎(chǔ)，而CNP動(dòng)物模型有著不同的造模方法。目前，最常用的CNP動(dòng)物造模方法分為免疫性CNP動(dòng)物造模法和化學(xué)制劑直接注射法兩大類[6]。免疫性CNP動(dòng)物造模是根據(jù)CNP的發(fā)病可能與機(jī)體免疫反應(yīng)失調(diào)有關(guān)，但還處于探索階段，尚不成熟[7]?；瘜W(xué)制劑直接注射法理論基礎(chǔ)成熟，易于操作，且病理過(guò)程與人體相似,是CNP模型的主要造模方法。角叉菜膠是一種誘導(dǎo)非特異性炎癥模型的經(jīng)典試劑，也是誘導(dǎo)CNP動(dòng)物模型最常用的化學(xué)試劑[8]。目前注射角叉菜膠的劑量多為20 μL和100 μL，均存在不同程度的問(wèn)題，不能完全滿足評(píng)價(jià)CNP動(dòng)物模型藥物的要求，譬如Chen[9]和Chen[10]在SD大鼠中注入20 μL 1%角叉菜膠誘導(dǎo)CNP動(dòng)物模型，由于注的量比較少，模型不太穩(wěn)定；蘭量園等[11]在雄性Wistar大鼠前列腺左右兩側(cè)腹葉分別注入1%角叉菜膠生理鹽水溶液100 μL誘導(dǎo)CNP動(dòng)物模型，由于注的量較多，容易造成部分液體漏出，不同動(dòng)物的炎癥程度會(huì)受到影響。目前注射50 μL 1%的無(wú)菌角叉菜膠誘導(dǎo)CNP動(dòng)物模型的報(bào)道較少。因此，筆者首次對(duì)注射20、50和100 μL三個(gè)劑量進(jìn)行對(duì)比研究，并通過(guò)解剖學(xué)、前列腺指數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、病理切片以及TNF-α、NF-κB、IKKα、p-IKB-α和COX-2的表達(dá)水平進(jìn)行指標(biāo)評(píng)價(jià)，尋求制備可重復(fù)、穩(wěn)定、炎癥反應(yīng)程度盡量一致的大鼠化學(xué)性CNP動(dòng)物模型。

角叉菜膠誘導(dǎo)前列腺炎時(shí)，前列腺會(huì)出現(xiàn)增大，前列腺組織和周圍組織發(fā)生粘連，出現(xiàn)暗紅色或灰白色片狀結(jié)節(jié)[9]；可以從前列腺臟器指數(shù)和解剖學(xué)角度直觀地分析模型的成功性。WBC是反應(yīng)炎癥程度的標(biāo)志性指標(biāo)，在臨床診療中，前列腺是否存在炎癥、炎癥的嚴(yán)重程度以及治療的效果均可以依據(jù)前列腺液中WBC計(jì)數(shù)進(jìn)行判斷[12]；故白細(xì)胞計(jì)數(shù)可以評(píng)價(jià)動(dòng)物模型是否成功。NF-κB 是一種多功能核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，激活后可以促進(jìn)細(xì)胞因子、黏附因子、趨化因子、COX-2及一氧化氮合酶等表達(dá)及基因轉(zhuǎn)錄[13]。NF-κB未被激活時(shí)和IκB-α形成一個(gè)復(fù)合物IkB激酶(IKK)，在TNF-α等因子的刺激下，IKK被激活，使IκB被磷酸化，IκB從NF-κB上脫落并被泛素化，NF-κB由抑制狀態(tài)被激活，使IKB-α磷酸化形成p-IKB-α，在COX-2的參與下產(chǎn)生前列腺素，引起疼痛[14]。在有慢性非細(xì)菌性前列腺炎(CNBP)時(shí),TNF-α顯著升高, TNF-α等免疫反應(yīng)產(chǎn)物或免疫復(fù)合物通過(guò)刺激神經(jīng)末梢可引發(fā)前列腺炎,產(chǎn)生更加復(fù)雜癥狀[15]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)角叉菜膠誘導(dǎo)后，與假手術(shù)組比較，模型A、B、C組的前列腺組織和周圍組織均發(fā)生不同程度的粘連，模型A組織粘連程度較輕，模型B、C組與周圍組織粘連程度較重，可見暗紅色或灰白色片狀結(jié)節(jié)，模型C組前列腺組織出現(xiàn)不可逆壞死，而且有動(dòng)物死亡。模型A、B、C組的前列腺出現(xiàn)了不同程度的增大，無(wú)論是前列腺指數(shù)還是白細(xì)胞總數(shù)，模型A組增加較小，模型B、C組增加顯著。模型A組NF-κB抗炎通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平有小幅增加，模型B、C組增加顯著。由此可知，模型A組炎癥程度較輕，不太穩(wěn)定；模型C組炎癥程度較重，甚至造成一些不可逆的損失。其主要原因可能是模型A組注的量較少，不好把控，導(dǎo)致模型不穩(wěn)定；模型C組注的量較多，加上前列腺本身較小，瞬間膨脹，超出了前列腺的承受范圍，造成一些不可逆的損傷，甚至動(dòng)物死亡，故很難得到可行的CNP動(dòng)物模型，難以準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)藥效。模型B組注的量適中，模型穩(wěn)定，能夠得到可行的CNP動(dòng)物模型。

綜上所述，SPF級(jí)的雄性SD大鼠(體重220-250 g)，2月齡，用1%的無(wú)菌角叉菜膠注射至前列腺左右腹側(cè)葉中各50 μL，可制備穩(wěn)定、個(gè)體反應(yīng)較為一致的大鼠化學(xué)性CNP動(dòng)物模型，其病理過(guò)程與表現(xiàn)與人體相似。本研究對(duì)角叉菜膠誘導(dǎo)CNP模型方法的合理改進(jìn)以及評(píng)價(jià)方法的建立，為CNP的病因病機(jī)研究以及對(duì)抗CNP的藥物研發(fā)提供了良好的工作基礎(chǔ)。

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Preparationandevaluationoftheratmodelofchronicnonbacterialprostatitisinducedbycarrageenan

DAI Ying-he1,2#, LONG Xiao-qin2, LIU Chen-qi4, YANG Shu-xian1, LI Li-yong1, YUAN Jing-quan3, YI Wei2, CAO Li1*

(1. Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College，Beijing 100193； 2. College of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001； 3. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant, Nanning 530023； 4. Research Center of Life and Environment Science, Harbin University of Commerce, Harbin 150076)

ObjectiveTo establish an animal model of chronic nonbacterial prostatitis induced by chemical substances, and provide a reliable animal model and evaluation method for pathological mechanism and pharmaceutical research of chronic nonbacterial prostatitis.MethodsSD male rats were randomly divided into control group and model groups A, B and C. The three model groups were respectively treated with 20, 50 and 100 μL of 1% sterile carrageenan, injected into the left and right ventral lobes of rat prostate. The control group was injected 50 μL sterile normal saline. The rats were sacrificed at 7 days after carrageenan injection, and the anatomical changes were analyzed, and the prostate index, leukocyte count, the histology of prostate, and the protein expressions of TNF-α, NF-κB, IKKα, p-IKB-α and COX-2 were analyzed.ResultsCompared with the sham operation group, the softness of prostate tissue of groups A, B and C was decreased, the elasticity of the prostatic tissue was weakened, and the prostate tissues of model groups were adhered to surrounding tissues. The total number of leukocytes and the prostate index of model groups A, B and C were significantly increased (P<0.01), by 21.1%, 61.7% and 72.7%, respectively. The total increase rate of white blood cell in the model groups A, B and C was 75%, 103.6% and 114.8%, respectively. Pathological examination showed that the interstitial edema of the prostate of model group A was minimal, but obvious in the groups B and C. Moreover, in the group C, the prostate atrophy was obvious, and some of the glands were degenerated and necrotic. The protein expression levels of NF-κB, IKKα, p-IKB-α, TNF-α, and COX-2 in the prostate tissue were increased to a different extent in all model groups.ConclusionsInflammatory reactions can be induced by injecting 20, 50 or 100 μL of 1% sterile carrageenan into the right and left ventral lobes of the rat prostate. However, the 20 μL dose is too small, inducing only weak inflammatory response, with considerable operation error, while the dose of 100 μL induced excessive inflammatory response, even rat death. The dose of of 50 μL injection is most suitable to establish rat models of nonbacterial prostatitis, showing apparent activation of NF-κB inflammatory signaling pathway.

Chronic nonbacterial prostatitis; Animal models; Carrageenan

CAO li. E-mail： lcao@implad.ac.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0544-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.014

2017-03-29

戴應(yīng)和(1989-)，苗族，在讀碩士，中藥學(xué)(中藥藥理方向)。E-mail： daiyinghegz@126.com;龍小琴(1991-)，女，碩士研究生，專業(yè)：在讀碩士，中藥學(xué)(中藥藥理方向)。E-mail： longxiaoqin128@126.com

#共同第一作者

曹麗，女，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤藥理學(xué)。E-mail: lcao@implad.ac.cn