急性高血糖影響小鼠第一時相胰島素分泌的機制

趙一楠，周迎生，顏迪恩，高秀瑩

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，北京 100029)

研究報告

急性高血糖影響小鼠第一時相胰島素分泌的機制

趙一楠，周迎生*，顏迪恩，高秀瑩

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，北京 100029)

目的觀察急性高血糖影響小鼠第一時相胰島素分泌的功能及形態(tài)學(xué)變化特點。方法給C57/BL 6J小鼠完成頸靜脈插管后輸注20%高糖溶液4 h，建立急性糖毒性小鼠模型，行腹腔葡萄糖耐量實驗(intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)及口服葡萄糖耐量實驗(oral glucose tolerance test，OGTT)評價葡萄糖耐量及胰島素分泌功能。HE染色及電鏡觀察胰島形態(tài)變化及細胞內(nèi)胰島素分泌顆粒亞細胞結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果IPGTT實驗中急性糖毒性組15 min血糖值較對照組顯著增加[(10.3±0.33) mmol/L vs(19.3±1.66) mmol/L]，上升87%(P<0.05)，OGTT實驗中30 min血糖值較對照組顯著增加[(9.8±0.31) mmol/L vs(18.16±1.01) mmol/L]，升高85%(P<0.05)，且早期胰島素分泌高峰受損且分泌延遲。GSIS實驗中急性糖毒性組在基礎(chǔ)狀態(tài)時(葡萄糖濃度2.8 mmol/L)和高糖(16.7 mmol/L)刺激后，胰島素分泌較對照組顯著降低[(0.481±0.003) ng/mL vs(0.702±0.121) ng/mL,(2.43±0.03) ng/mL vs(4.07±0.34) ng/mL]，分別下降46%和67%(P<0.05)；胰島素含量測定結(jié)果顯示，急性糖毒性組比對照組降低[(97.01±2.05) ng/mL vs(65.12±0.42) ng/mL,(121.40±0.58) ng/mL vs(62.7±0.48) ng/mL]，下降49%和94%(P<0.05)。HE染色顯示急性糖毒性胰島邊界不規(guī)則、內(nèi)部細胞排列不整；透射電鏡可見細胞內(nèi)胰島素分泌顆?？张?，線粒體嵴斷裂。結(jié)論急性葡萄糖毒性使胰島β細胞內(nèi)胰島素儲備減少，導(dǎo)致第一時相分泌胰島素峰值降低及延遲。

胰島；急性高血糖試驗；糖耐量試驗；胰島素分泌；組織學(xué)；超微結(jié)構(gòu)；小鼠

胰島素分泌功能障礙或胰島素缺乏是糖尿病發(fā)病的重要原因，早期表現(xiàn)在胰島素第一時相分泌功能的異常[1]。靜脈輸注葡萄糖液、大量飲用含糖飲料、使用類固醇激素和應(yīng)激性因素等是引起血糖迅速升高的常見誘因[2]。研究表明，血糖濃度超過生理范圍對細胞、組織有損害作用，稱糖毒性，當(dāng)血糖升高不能刺激足夠的胰島素釋放就會發(fā)生糖尿病[3,4]。我們既往研究發(fā)現(xiàn)急性糖毒性可以損傷胰島素第一時相分泌，形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)胰島內(nèi)部細胞排列不整齊且外部形態(tài)不規(guī)則，胰島素染色分布不均勻且顏色程度不一致[5]。本研究擬通過建立急性糖毒性損傷模型，探索急性糖毒性影響胰島素分泌的功能及形態(tài)學(xué)機制特點。

1 材料與方法

1.1實驗動物

SPF/VAF級C57BL/6J小鼠為12周齡，雄性，30只，體重24～26 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2016-0011】，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院心肺血管病研究所實驗動物科學(xué)部【SYXK(京)2016-0027】完成小鼠飼養(yǎng)及部分相關(guān)實驗內(nèi)容。動物正常飲食、進水，飼養(yǎng)環(huán)境安靜、舒適，12/12 h晝夜規(guī)律，飼養(yǎng)溫度恒定在22℃～26℃，空氣濕度維持在60%～70%。所有飼養(yǎng)小鼠均完成高葡萄糖鉗夾實驗?zāi)Ｐ?。本實驗分為兩組，每組15只；(1)正常對照組(control group)，頸靜脈輸注生理鹽水；(2)急性糖毒性組(acute hyperglycemia group)，頸靜脈輸注20%葡萄糖。

1.2建立急性葡萄糖毒性模型

將小鼠稱重、編號，并根據(jù)體重按80 mg/kg注射1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠。在頸靜脈插管術(shù)后恢復(fù)3 d。實驗時通過鼠尾靜脈測定小鼠血糖，在頸靜脈插管內(nèi)注射肝素鹽水(200 U/mL)抗凝，將頸靜脈插管連接微量注射泵(Perfusor@compact，BRAUN)，按照起始速度0.5 mL/h輸注20%葡萄糖溶液，血糖在輸注10 min后達到16.7 mmol/L，繼續(xù)輸注，每30 min測定血糖1次，據(jù)血糖濃度調(diào)節(jié)輸注速度，保持血糖濃度≥16.7 mmol/L，輸注4 h后復(fù)測血糖，整個過程中小鼠處于麻醉狀態(tài)。實驗結(jié)束待觀察小鼠恢復(fù)后再送回動物房，正常飲食。

1.3葡萄糖耐量試驗(GTT)

腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)時，小鼠禁食過夜10 h以上。通過鼠尾靜脈測定空腹血糖，給予腹腔注射20%葡萄糖 (2 g/kg)，用固定器固定小鼠，分別測定葡萄糖負荷后15、30、60、120 min血糖，用毛細采血管(Roche)在各時間點鼠尾采血。血標(biāo)本經(jīng)4℃ 10 000 r/min離心10 min取上清，放入-80℃冰箱內(nèi)保存?？诜咸烟悄土吭囼?OGTT)時，小鼠禁食過夜10 h以上。通過鼠尾靜脈測定空腹血糖，給予口服20%葡萄糖 (2 g/kg)灌喂，用固定器固定小鼠，分別測定葡萄糖負荷后30、60、90、120 min血糖，并留取各時間點血標(biāo)本，離心、取上清后放入-80℃冰箱保存[6]。上述實驗在不同小鼠中分別完成。

1.4胰島素濃度測定

采用小鼠超敏胰島素ELISA試劑盒(Alpco公司，USA)測定。從-80℃冰箱中取出樣本，放置至室溫，渦旋混勻5 s，按照既往研究中方法測定胰島素濃度[7]。

1.5胰腺組織HE染色

胰腺組織脫水后石蠟包埋，包埋時注意組織切面向下并沉至石蠟底部。石蠟切片制備：將包埋好的石蠟包埋盒保存在-20℃冰箱內(nèi)，切片前取出放置在冰上，切片厚度6 μm，切片刀盡量從左向右順序切片，切片前用30%乙醇濕潤組織部分以防止組織碎裂，展片時間2～3 s即可。放置在80℃烤片箱內(nèi)100 min，用以防止組織脫片。此后，石蠟切片還需脫蠟、染色。

胰腺組織在切片制備及染色過程中不同于其他實質(zhì)臟器(心臟、肝、腎)，組織形狀不規(guī)則，脫水后質(zhì)地較硬、較脆。切片及展片時組織容易出現(xiàn)碎裂、卷曲，故切片時盡量保證低溫、濕潤，展片時間不宜過長。HE染色過程中染料作用時間不宜過長，可在每次染色操作完成后于立式顯微鏡下觀察染色情況。

1.6小鼠胰島的分離、純化

麻醉后固定小鼠于鼠板上，酒精消毒胸腹部，將腹腔內(nèi)臟器鈍性分離，充分暴露十二指腸及周邊胰腺，按照既往研究中分離方法獲得胰島[8]。

1.7葡萄糖刺激的胰島素分泌實驗(GSIS)

挑選過夜培養(yǎng)的胰島移入含有6 mL KRBH液(0.5% BSA)的培養(yǎng)皿中，于37℃ CO2培養(yǎng)箱中預(yù)孵育1 h。體視顯微鏡下，吸取包膜完整、大小一致的胰島種于24孔板，每孔10個，加入含不同濃度葡萄糖的刺激液，每孔2 mL，每個濃度設(shè)3 個復(fù)孔，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱孵育1 h。取出24孔板，置于冰上10 min，以終止胰島素分泌。體視顯微鏡下，吸取上清1 mL至1.5 mL EP管中(避免吸入胰島)，按照既往研究中的方法完成小鼠胰島素分泌實驗[7,8]。

1.8小鼠胰島透射電鏡

將分離挑選出的200個胰島用3%戊二醛固定液固定2 h，使其蛋白結(jié)構(gòu)保存良好并失去活性。用0.1 mol/L PB緩沖液對組織清洗3次后，采用瓊脂膠進行第1次包埋，使胰島在瓊脂中呈懸浮狀態(tài)。在首都醫(yī)科大學(xué)電鏡室，用1%鋨酸對胰島進行后固定、脫水、包埋、聚合、電子染色。用透射電鏡(日本JEOL JEM-1400)觀察胰島β細胞胰島分泌顆粒及亞細胞結(jié)構(gòu)。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理

正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組間比較為單因素方差分析或LSD檢驗。非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)及四分位法表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料用率表示，采用卡方檢驗分析。應(yīng)用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1成功建立急性糖毒性小鼠模型

本研究通過對小鼠右頸靜脈插管后正常食水恢復(fù)3 d，使用微量注射泵持續(xù)輸注高糖，將血糖維持在16.7 mmol/L以上4 h，起始輸注速度為0.5 mL/h，輸注10 min后測定血糖值，根據(jù)血糖上升情況，調(diào)節(jié)輸注速度，2 h后輸注速度基本為0.2 mL/h左右，輸注結(jié)束后監(jiān)測血糖恢復(fù)情況，通常0.5 h內(nèi)小鼠血糖恢復(fù)至術(shù)前水平，詳見圖1。

本實驗中小鼠共30只，操作成功24只，死亡6只。死亡原因主要包括：手術(shù)操作中出血、插管時產(chǎn)生血栓。每組12只小鼠，其中6只完成IPGTT實驗，另外6只完成OGTT實驗，并記錄數(shù)據(jù)，每組取3只小鼠胰腺組織完成HE染色，6只分離胰島并完成體外實驗，3只小鼠取胰島組織完成透射電鏡。

2.2通過IPGTT及OGTT顯示急性糖毒性對胰島素第一時相分泌的損傷特點

IPGTT實驗結(jié)果表明急性糖毒性組15 min血糖值較對照組升高了87%(P<0.05)，血糖值曲線下面積較對照組增加了97%(P<0.05)；OGTT實驗中急性糖毒性組30 min血糖值較對照組升高了85%(P<0.05)，血糖值曲線下面積較對照組增加了106%(P<0.05)，表明體內(nèi)葡萄糖代謝能力下降。見圖2A-D。而無論是IPGTT還是OGTT，血漿胰島素高峰都出現(xiàn)了延遲，表明胰島素早期分泌功能受損。見圖2E-F。

2.3通過GSIS及胰島素含量測定分析急性糖毒性對胰島素儲備影響

分離胰島后，GSIS實驗中急性糖毒性組在基礎(chǔ)狀態(tài)(葡萄糖濃度2.8 mmol/L)、高葡萄糖狀態(tài)(16.7 mmol/L)、30 mmol/L氯化鉀及40 mmol/L氯化鉀刺激后，胰島素分泌水平較對照組分別降低了46%、67%、20%、50%(P<0.05)。胰島素含量測定結(jié)果顯示急性糖毒性組比對照組分別降低了49%、95%、61%、74%(P<0.05)。詳見圖3。

2.4通過HE染色及電鏡觀察急性糖毒性對胰島細胞亞細胞結(jié)構(gòu)的損傷

實驗各組胰腺組織HE染色顯示：對照組中胰島外形規(guī)整，細胞質(zhì)染色均勻；而急性糖毒性組中胰島內(nèi)部細胞排列不整齊且外部形態(tài)不規(guī)則，細胞質(zhì)染色分布不均勻且顏色程度不一致，詳見圖4A、B。胰島組織電鏡結(jié)果顯示：對照組胰島中β細胞胰島素分泌顆粒成熟度高、空泡數(shù)量少；而急性糖毒性組中β細胞內(nèi)成熟胰島素分泌顆粒明顯減少，空泡數(shù)量增加，線粒體數(shù)量增加，且存在線粒體腫脹及膜斷裂等病理改變，詳見圖4C-F。

注：A為葡萄糖及氯化鉀刺激下對照組與急性糖毒性組的胰島素分泌水平；B為葡萄糖及氯化鉀刺激下對照組與急性糖毒性組的胰島素含量；其中a為對照組，b為急性糖毒性組。圖3 葡萄糖及氯化鉀刺激下對照組及急性糖毒性組胰島素水平Note. A, insulin secretion was stimulated by glucose and potassium chloride in the control and acute hyperglycemia groups. B, insulin content of islets in the control and acute hyperglycemia groups. A, control group; b, acute hyperglycemia group.Fig.3 The insulin levels stimulated by glucose and potassium chloride in the control and acute hyperglycemia groups

注：A、B為對照組及急性糖毒性組胰腺組織HE染色圖像(×400)；C、E為對照組胰島組織透射電鏡照片(×2000，×4000)；D、F為急性糖毒性組胰島組織透射電鏡照片(×2000，×4000)；其中可見細胞核(◇)及線粒體(↓)，胰島素顆粒(Δ)。圖4 對照組與急性糖毒性組的HE染色及透射電鏡結(jié)果Note. A, a pancreatic islet in a control mouse; B, a pancreatic islet in an acute hyperglycemic mouse; C, E, electron micrographs of islet cells in a control mouse; D, F, electron micrographs of islet cells in an acute hyperglycemic mouse. Nucleus (◇), mitochondria (↓) and insulin particles (Δ).Fig.4 Histology and ultrastructure of pancreatic islets in the mice of control and acute hyperglycemia groups

3 討論

本研究中IPGTT結(jié)果顯示急性糖毒性組15 min血清胰島素水平明顯低于對照組，與之相對應(yīng)的血糖值卻顯著高于對照組，因此急性糖毒性能夠損害胰島素第一時相分泌，而胰島素第一時相分泌與糖尿病的發(fā)病密切相關(guān)，因此這可能成為糖尿病發(fā)病的新的誘因，這與之前Elena Toschi在臨床研究報道相一致[4]。為觀察胰島β細胞受損與不同血糖濃度和刺激時間的關(guān)系，我們繪制葡萄糖濃度-時間和胰島素濃度-時間曲線，并計算曲線下的面積。發(fā)現(xiàn)急性糖毒性組血糖曲線下的面積高于對照組，而胰島素水平曲線下面積卻低于對照組。Leahy研究[5]表明糖毒性與血液葡萄糖濃度和輸液時間相關(guān)，通過對大鼠連續(xù)葡萄糖輸液 (2 mL/h) 48 h，成功地建立葡萄糖鉗夾模型，這項研究驗證了48 h持續(xù)高血糖可以減損胰島素分泌功能，出現(xiàn)糖耐量減低表現(xiàn)。

既往研究沒有確切的時間定義急性和慢性糖毒性。Leahy[5]的研究最早定義48 h為慢性糖毒性。Evans-Molina[9]定義1 h為急性葡萄糖刺激。本課題組前期研究中，定義 4 h作為急性糖毒性，并發(fā)現(xiàn)急性糖毒性損傷確實會減損早期胰島素分泌并減少小鼠胰島β細胞中胰島素含量。本研究證實了急性糖毒性損傷對胰島素第一時相分泌的減損作用，但這種減損作用是由于胰島素儲備減低還是胰島素敏感性下降造成的仍存在爭議。本研究結(jié)果表明胰島素分泌減少和胰島素含量下降有關(guān)。既往體外研究[10]表明，用11 mmol/L和28 mmol/L葡萄培養(yǎng)的胰島細胞7 d，胰島素含量分別減少了 45%和60%，胰島素分泌顯著減少。

本研究GSIS實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組及急性糖毒性組中分離、純化后的胰島在葡萄糖刺激下可分泌胰島素，且本組分離所得胰島在高葡萄糖刺激下分泌胰島素量是基礎(chǔ)葡萄糖的4倍以上，優(yōu)于多數(shù)文獻報道[11-13]。而急性糖毒性組在葡萄糖濃度為2.8或16.7 mmol/L刺激分泌胰島素水平比對照組分別下降了46%和67%(P<0.05)，這與之前報道的體外胰島在葡萄糖濃度為20 mmol/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 min后，胰島素分泌較對照組減少75%是類似的[14]。既往研究中，F(xiàn)esta[15]發(fā)現(xiàn)糖耐量受損和2型糖尿病患者的胰島素分泌水平分別降低了31%和70%。本研究中，急性糖毒性可以導(dǎo)致胰島素分泌減損，類似于Festa研究中的糖耐量受損組。慢性糖毒性研究發(fā)現(xiàn)，10 mmol/L 的高葡萄糖損傷就會引起胰島素分泌降低[16,17]。Ling[18]發(fā)現(xiàn)后在 20 mmol/L的高葡萄糖損傷就會引起胰島素分泌降低。臨床研究中[19]，體外環(huán)境下25 mmol/L高葡萄糖損傷48 h可使胰島細胞的胰島素 mRNA 含量減少，但在30 min內(nèi)胰島素分泌不會減少，故胰島素分泌的減損是時間依賴性。

本研究發(fā)現(xiàn)急性糖毒性組胰島出現(xiàn)邊緣不規(guī)則的細胞核及較少的胰島素分泌泡和大量的空泡，線粒體數(shù)量增加，但線粒體嵴有斷裂。既往研究[20]也發(fā)現(xiàn)慢性糖毒性可以減少胰島素分泌泡并導(dǎo)致線粒體腫脹。本研究中發(fā)現(xiàn)急性糖毒性組胰島素分泌泡數(shù)量減少，這說明確實存在胰島素含量的減少及胰島素分泌下降。此外，Morini[21]發(fā)現(xiàn)糖毒性可誘導(dǎo)細胞膜骨架斷裂和胰島細胞線粒體腫脹，這也與胰島素分泌功能障礙相關(guān)。

本研究使用戊巴比妥鈉對小鼠進行麻醉，對血糖沒有影響，既往基礎(chǔ)研究表明戊巴比妥鈉麻醉大鼠對其血糖及胰島素分泌沒有影響，而芬太尼麻醉大鼠，會使其血糖升高[22]。本研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)急性糖毒性對胰島素分泌的損傷作用，但其損傷機制的分子生物學(xué)研究，尚需進一步實驗探討。此外，急性糖毒性對胰島造成的這種損傷是短暫一過性還是永久性目前尚不清楚，期待在未來的研究中進一步完善。

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Impairmentmechanismsofacutehyperglycemiainthefirst-phaseinsulinsecretioninmouse

ZHAO Yi-nan, ZHOU Ying-sheng*, YAN Di-en, GAO Xiu-ying

(Department of Metabolism and Endocrinology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, Beijing 100029，China)

ObjectiveTo clarify the impairment mechanisms of acute hyperglycemia in the first-phase insulin secretion in mice.MethodsThe mouse model of acute glucose toxicity was established by glucose infusion through jugular vein catheterization. The glucose and insulin levels were assessed by IPGTT and OGTT in the mice of acute hyperglycemia and control groups. The histology of pancreatic islets was observed using HE staining and the insulin granules and other cytoplasmic organelles were observed by electron microscopy.ResultsThe mouse model of acute hyperglycemia was successfully established. The IPGTT showed that the blood glucose level was decreased by 87% (10.3±0.33 mmol/L vs. 19.3±1.66 mmol/L) at 15 min in the acute hyperglycemia group compared with the control group. The OGTT showed that the blood glucose level was decreased by 85% (9.8±0.31 mmol/L vs. 18.16±1.01 mmol/L) at 30 min in the acute hyperglycemia group compared with the control group. However, the peak values of insulin secretion were delayed in both IPGTT and OGTT. Insulin levels at 2.8 and 16.7 mmol/L glucose stimulation in the acute hyperglycemia group was declined by 46% and 67% than the control group, respectively (P<0.05). Residual insulin content in islet β cells was declined by 49% at 2.8 mmol/L and 94% at 16.7 mmol/L glucose infusion than the control group (P<0.05). The histology showed irregular structure of pancreatic islets in the acute hyperglycemia group. The electron microscopy revealed that the amount of insulin granules was decreased, and more cytoplasmic vacuoles and swollen mitochondria were observed.ConclusionsAcute intravenous glucose load decreases insulin content of islet β cells, leading to decrease and delay of the first-phase insulin secretion.

Acute hyperglycemia; Pancreatic islets; Glucose tolerance test; Insulin secretion; Histology; Ultrastructure; Mouse

ZHOU Ying-sheng,yszhou@cemu.edu.cn

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0479-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.003

2017-02-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(81641027)；教育部留學(xué)回國基金資助項目(2012-940)；北京市科委科研基金資助項目(Z131100004013044)；北京市學(xué)科帶頭人基金資助項目(2013-2-006)。

趙一楠(1988-)，男，在讀博士生，專業(yè)：內(nèi)分泌與代謝疾病。E-mail： zhaoyinan1988@163.com

周迎生(1965-)，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：2型糖尿病發(fā)病機制及心血管并發(fā)癥防治。E-mail： yszhou@ccmu.edu.cn