副干酪乳桿菌直投式菌種中霉菌和酵母菌檢測方法的建立

董雪鳳，楊子彪，任發(fā)政，劉松玲，段瑞華，宋偉志，王遠(yuǎn)

（1.云南皇氏來思爾乳業(yè)有限責(zé)任公司，大理 671000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3.大理市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，大理 671000）

★乳與乳制品

副干酪乳桿菌直投式菌種中霉菌和酵母菌檢測方法的建立

董雪鳳1，楊子彪1，任發(fā)政2，劉松玲2，段瑞華1，宋偉志3，王遠(yuǎn)1

（1.云南皇氏來思爾乳業(yè)有限責(zé)任公司，大理 671000；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院教育部功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3.大理市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，大理 671000）

霉菌和酵母菌是直投式菌種中常見的污染菌，嚴(yán)重影響直投菌種的安全使用。在副干酪乳桿菌直投式菌種的霉菌、酵母菌檢測中，由于菌種本身對霉菌、酵母菌的抑制作用以及高濃度菌種對污染菌檢測的干擾作用，經(jīng)常造成檢測結(jié)果的假陰性。本研究根據(jù)副干酪乳桿菌菌體比霉菌、酵母菌小的特點(diǎn)，采用抽濾的方法將副干酪乳桿菌和霉菌、酵母菌分開，通過定性和定量兩步檢驗(yàn)，結(jié)合國標(biāo)檢測方法，成功鑒定到副干酪乳桿菌直投式菌種污染的低豐度霉菌和酵母菌。為有效地控制副干酪乳桿菌直投式菌種的產(chǎn)品質(zhì)量，菌種發(fā)酵產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中的穩(wěn)定性提供了有效的保證。

副干酪乳桿菌；直投式菌種；霉菌；酵母菌

直投式酸奶發(fā)酵劑（directed vat set，DVS）是指通過對發(fā)酵菌種進(jìn)行高密度培養(yǎng)、濃縮、洗滌、添加保護(hù)劑、冷凍干燥等工藝制成的發(fā)酵劑菌種，可直接加入到熱處理的原料乳中進(jìn)行發(fā)酵，而無需對其進(jìn)行活化、擴(kuò)培等其他預(yù)處理工作。直投式發(fā)酵劑具有活力強(qiáng)、種類多、使用方便及性能穩(wěn)定等多種優(yōu)點(diǎn)，成為目前眾多大型乳品企業(yè)的首選。

副干酪乳桿菌作為一種有效的益生菌[1]，具有良好的加工性能，成為乳品生產(chǎn)中常用的菌種[2,3]。在副干酪乳桿菌直投發(fā)酵劑的使用過程中，霉菌、酵母菌的污染嚴(yán)重影響著使用的安全性[4,5]。在霉菌、酵母菌檢測中，高濃度的發(fā)酵劑菌種易對檢測結(jié)果造成嚴(yán)重干擾，同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌本身對霉菌、酵母菌具有一定的抑制作用[6]，這些都嚴(yán)重影響了檢測的準(zhǔn)確性。

本研究通過超濾分離手段結(jié)合國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[7]探討了副干酪乳桿菌直投式菌種中霉菌、酵母菌的檢測方法[8]，改善了國標(biāo)法的不足，期望新方法能夠幫助相關(guān)乳企提高發(fā)酵成功率，減少生產(chǎn)損失，為市場提供更優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品。同時(shí)可以進(jìn)一步研究探討用此方法純化霉菌、酵母菌超標(biāo)的副干酪乳桿菌直投式菌種稀釋液，作為生產(chǎn)應(yīng)急時(shí)使用，以保證副干酪乳桿菌直投式菌種發(fā)酵產(chǎn)品的穩(wěn)定性，有效控制產(chǎn)品質(zhì)量，提高發(fā)酵成功率，避免和減少生產(chǎn)中的損失。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：國外進(jìn)口的副干酪乳桿菌直投式菌種。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氫鉀1g、七水合硫酸鎂0.5g、瓊脂20g、孟加拉紅0.033g、氯霉素0.1g、蒸餾水1 000mL，121℃滅菌20min。

1μm過濾膜。

1.2 儀器和設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱（28±1℃）、QL-901混合器、抽濾瓶、真空泵、XS-212-201顯微鏡（10×～100×）、電子天平（感量0.1g）。

1.3 原理

根據(jù)副干酪乳桿菌與霉菌孢子、酵母細(xì)胞的大小差異，選用選擇性透過濾膜，稀釋副干酪乳桿菌直投式菌種樣品，通過抽濾分離出霉菌、酵母菌再進(jìn)行檢測。酵母細(xì)胞的大小是1～5μm×5～30μm[9]，霉菌孢子為2～10μm，副干酪乳桿菌通常寬度小于1.5μm[10]。副干酪乳桿菌直投式菌種由于采用冷凍真空干燥工藝，菌株寬度更小，不超過1μm。依據(jù)不同菌株分子大小不同的特性，通過1μm微膜抽濾將副干酪乳桿菌和霉菌、酵母菌分離開，即基本上霉菌、酵母菌留在濾膜上，副干酪乳桿菌在濾液中[11]。

1.4 方法

1.4.1 樣品處理

樣品制備：稱取5g副干酪乳桿菌直投式菌種至盛有95g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，振蕩2min后靜置30min，制得1:20的樣品勻液。

1.4.2 定性檢測方法

1.4.2.1 制備培養(yǎng)基：加熱溶解商用孟加拉紅培養(yǎng)基，高壓蒸汽121℃滅菌15min，滅菌后，待培養(yǎng)基冷卻至45～50℃時(shí)，傾注到滅菌平板上，培養(yǎng)基厚度在5mm以上，凝固待用。

1.4.2.2 第一次抽濾：固定好濾器，取10g制得的樣品勻液通過孔徑1 μm的濾膜過濾，然后將過濾后的濾膜貼在已制備好的孟加拉紅瓊脂平板上。

1.4.2.3 第二次抽濾：取10g上述步驟1.4.1制得的樣品勻液通過孔徑1μm的濾膜過濾，然后將過濾后的濾膜放入20～30g無菌生理鹽水中，用拍擊式振蕩器振蕩2min，制得二次稀釋液，取10g二次稀釋液通過孔徑1μm的濾膜過濾，然后將過濾好的濾膜貼在已制備好的孟加拉紅瓊脂平板上。

1.4.2.4 第三次抽濾：取10g上述步驟1.4.2.3制得的二次稀釋液，通過孔徑1 μm的濾膜過濾，將過濾后的濾膜放入20～30g無菌生理鹽水中，用拍擊式振蕩器振蕩2min，制得三次稀釋液，取10g三次稀釋液通過孔徑1μm的濾膜過濾，然后將過濾好的濾膜貼在已制備好的孟加拉紅瓊脂平板上。

1.4.2.5 結(jié)果觀察：將上述平板置于28±1℃培養(yǎng)5d，觀察濾膜上菌落的生長情況，看有無霉菌和酵母菌典型菌落。

1.4.3 定量檢測方法

1.4.3.1 第一次抽濾：固定好濾器，將10g上述步驟

1.4.1 制得的樣品勻液通過孔徑1μm的濾膜過濾，然后將過濾后的濾膜放入30g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，制得第一次抽濾后的樣品勻液。

1.4.3.2 第二次抽濾：固定好濾器，將上述步驟1.4.3.1制得的第一次抽濾后的樣品勻液全部通過新的孔徑1μm濾膜過濾，然后將過濾后的濾膜放入30g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，制得第二次抽濾后的樣品勻液。

1.4.3.3 第三次抽濾：固定好濾器，將上述步驟1.4.3.2制得的第二次抽濾后的樣品勻液全部通過新的孔徑1μm濾膜過濾，然后將過濾后的濾膜放入50g滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分振搖，制成稀釋度為1×10-2的樣品勻液。

1.4.3.4 制備培養(yǎng)皿：取1g上述步驟1.4.3.3制得的稀釋度為1×10-2的樣品勻液，注入9g滅菌生理鹽水的試管中，充分振搖，制得稀釋度為1×10-3的樣品勻液，按此操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液，每遞增稀釋1次，換用一次無菌吸管；在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1g樣品勻液注入2個(gè)無菌平皿作平行實(shí)驗(yàn)，及時(shí)將15～20g冷卻至46～50℃的孟加拉紅培養(yǎng)基傾注至平皿，轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。

1.4.3.5 培養(yǎng)：待瓊脂凝固后，將平皿倒置，28±1℃培養(yǎng)5d，觀察并記錄。

1.4.3.6 菌落計(jì)數(shù)及報(bào)告：選取菌落數(shù)在10～150CFU之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，一個(gè)稀釋度使用兩個(gè)平板，取兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，乘以稀釋倍數(shù)后出報(bào)告。

1.4.4 國標(biāo)法對比檢測

1.4.4.1 在100級的潔凈工作臺進(jìn)行過濾操作。稱取10g副干酪乳桿菌直投式菌種至盛有90mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中，用拍擊式振蕩器振蕩2min后靜置30min，制成1:10的樣品勻液。

1.4.4.2 取1mL上述制成的1:10樣品勻液，注入9mL滅菌生理鹽水的試管中，充分振搖，即為1:100的稀釋液。按此操作程序，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用一次無菌吸管。

1.4.4.3 根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（本試驗(yàn)選擇10-1、10-2、10-3、10-4），在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個(gè)無菌平皿。同時(shí)分別取1mL樣品稀釋液加入2個(gè)無菌平皿作空白對照。及時(shí)將15～20mL冷卻至46℃左右的孟加拉紅培養(yǎng)基傾注至平皿，并轉(zhuǎn)動平皿使其混合均勻。

1.4.4.4 培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)，出具結(jié)果報(bào)告。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性檢測結(jié)果

按照GB 6914-86規(guī)定的取樣方法，選取從3個(gè)國家進(jìn)口的15個(gè)副干酪乳桿菌直投式菌種樣品為樣本。按上述定性檢測方法檢測，結(jié)果13個(gè)樣品未檢出霉菌和酵母菌，兩個(gè)樣品檢出霉菌、酵母菌，試驗(yàn)結(jié)果如下：

第一次抽濾后濾膜上菌落的培養(yǎng)結(jié)果見圖1。從圖1可見濾膜一片白色，未檢測到霉菌、酵母。原因可能是第一次抽濾后濾膜上副干酪乳桿菌數(shù)量較多，抑制了霉菌、酵母菌的生長。

第二次抽濾后濾膜上菌落的培養(yǎng)結(jié)果見圖2。從圖2可見濾膜出現(xiàn)淡粉色，有少量霉菌、酵母菌。這是因?yàn)榈诙纬闉V后濾膜上副干酪乳桿菌數(shù)量相對減少，對霉菌、酵母菌生長的抑制作用相對減弱。

圖1 第一次濾液定性檢測結(jié)果

圖2 第二次濾液定性檢測結(jié)果

第三次抽濾后濾膜上菌落的培養(yǎng)結(jié)果見圖3。從圖3可見濾膜出現(xiàn)粉色的典型酵母菌落和霉菌菌落，可確定此副干酪乳桿菌直投式菌種樣品中有霉菌、酵母菌存在。這是因?yàn)榈谌纬闉V后濾膜上副干酪乳桿菌數(shù)量較少，對霉菌、酵母菌生長基本沒有抑制作用。

總之，一次抽濾后由于副干酪乳桿菌抽濾下去的少，留在濾膜上的副干酪乳桿菌較多，阻礙了酵母菌和霉菌的生長；二次抽濾后濾膜上酵母菌和霉菌的生長情況受副干酪乳桿菌抑制作用弱，濾膜微紅；三次抽濾后留在濾膜上的副干酪乳桿菌數(shù)量基本很少了，抑制霉菌、酵母菌的能力基本沒有，濾膜上有霉菌、酵母菌的典型菌落，證明副干酪乳桿菌直投式菌種樣品中有霉菌和酵母菌存在。

圖3 第三次濾液定性檢測結(jié)果

2.2 定量檢測結(jié)果

相同樣品除進(jìn)行定性檢測外，同時(shí)做定量檢測和國標(biāo)方法檢測。用國標(biāo)法檢測的15個(gè)國外進(jìn)口副干酪乳桿菌菌種中霉菌、酵母菌都為0，而用抽濾的方法檢測相同的樣品，結(jié)果見表1。

表1 濾液定量檢測結(jié)果

從表1可以看出，13個(gè)樣品與用國標(biāo)法檢測的結(jié)果相同，即1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5稀釋度的霉菌和酵母菌落檢測結(jié)果都為0。 而樣品7、樣品12與國標(biāo)法的檢測結(jié)果不同，由于樣品經(jīng)1μm濾膜抽濾處理后，除去了副干酪乳桿菌對霉菌、酵母菌的抑制作用，排除了檢測過程的干擾因素，均檢出了霉菌和酵母菌。樣品7的檢測結(jié)果是：稀釋度為1×10-2的兩個(gè)平皿的霉菌和酵母菌落數(shù)平均為18個(gè)，其中酵母菌落數(shù)12個(gè)、霉菌菌落數(shù)6個(gè)；稀釋度為1×10-3兩個(gè)平皿霉菌和酵母菌落數(shù)平均為7，不在10～150CFU計(jì)數(shù)范圍以內(nèi)，因此選1×10-2稀釋度中的菌落數(shù)來計(jì)數(shù)，即該樣品中霉菌和酵母菌數(shù)為1 800CFU/g。樣品12的檢測結(jié)果是：稀釋度為1×10-2的兩個(gè)平皿中霉菌和酵母菌落數(shù)平均為15個(gè)，其中酵母菌落數(shù)9個(gè)、霉菌菌落數(shù)6個(gè)；稀釋度為1×10-3兩個(gè)平皿霉菌和酵母菌落數(shù)平均為6，不在10～150CFU計(jì)數(shù)范圍以內(nèi)，因此選1×10-2稀釋度中的菌落數(shù)來計(jì)數(shù)，即該樣品中霉菌和酵母菌數(shù)為1 500CFU/g。

3 結(jié)論

3.1 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供了一種副干酪乳桿菌直投式菌種中霉菌和酵母菌的定量檢測方法，主要解決直接用國標(biāo)法檢測會受稀釋倍數(shù)、抑制作用等因素的干擾而造成的漏檢。

3.2 本試驗(yàn)通過過濾分離手段避免了副干酪乳桿菌對檢測過程的干擾，成功定量檢驗(yàn)到直投式菌種中污染的低豐度的霉菌和酵母。

3.3 本試驗(yàn)的實(shí)施可有效地控制國外進(jìn)口直投式菌種的產(chǎn)品質(zhì)量，保證乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中的穩(wěn)定性，同時(shí)可有利于避免產(chǎn)品保質(zhì)期發(fā)生鼓蓋的質(zhì)量問題。

[1]Tsai,Yueh-Ting,Cheng,Po-Ching,et al.The immunomodulatory effects of lactic acid bacteria for improving immune functions and benefits[J].Applied Microbiology and Biotechnolo gy,2012,96(4):853-862.

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Improvement of Detection Technology for Molds and Yeats in Directed Vat Set of Lactobacillus paracasei

DONG Xue-feng1, YANG Zi-biao1, REN Fa-zheng2, LIU Song-ling2, SONG Wei-zhi3
(1.Yunan Huangshi Lesson Dairy Industry Co., Ltd., Dali 671000; 2. Key Laboratory of Functional Dairy, College of Food Science & Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083; 3. Agricultural Technology Promotion Center of Dali, Dali 671000)

Dairy products are particularly susceptible to fugal contaminations leading to important economic losses. The commonly used assaying for molds and yeasts in directed vat set of Lactobacillus paracasei was often interferred by the high density of starter strains and by the fact that some strains can inhibit the growth of molds and yeasts during assaying. It was known that the cell of L. paracasei was smaller than both molds and yeasts. In this study, we separated the bigger molds and yeasts cells from the smaller L.paracasei cells by extraction fi ltration and by doing so we managed to detect the low abundant of contamination of molds and yeasts quantitatively and qualitatively. The detecting techonology developed in this study will help avoid the economic losses resulted from contaminations of molds and yeasts during fermentation using Directed Vat Set.

Lactobacillus paracasei; Directed vat set; Mold; Yeast

TS252.1

A

1004-4264（2017）10-0039-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.10.010

2017-06-08

云南省科技計(jì)劃生物重大專項(xiàng)（奶業(yè)專項(xiàng)）（2014ZA001）。

董雪鳳（1975-），高級工程師，研究方向?yàn)槿橹破放c乳酸菌的開發(fā)應(yīng)用。