廣東省實驗用小型豬主要病原微生物學(xué)及寄生蟲學(xué)調(diào)查

黃樹武，閔凡貴，吳瑞可，陳梅玲，王希龍*，潘金春*

(1.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510663； 2.廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

研究報告

廣東省實驗用小型豬主要病原微生物學(xué)及寄生蟲學(xué)調(diào)查

黃樹武1,2，閔凡貴1,2，吳瑞可1,2，陳梅玲1,2，王希龍1,2*，潘金春1,2*

(1.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510663； 2.廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510663)

目的調(diào)查廣東省實驗用小型豬主要病原微生物和寄生蟲的感染情況。方法從廣東省4家生產(chǎn)單位隨機(jī)抽取小型豬154頭，包括巴馬小型豬、蕨麻小型豬、西藏小型豬和五指山小型豬4種品系，采集皮毛、鱗屑、血清、肛拭子、糞便等樣品檢測20種病原，對結(jié)果進(jìn)行生產(chǎn)單位和品系間的差異性分析。結(jié)果所檢4家單位的所有品系小型豬均存在多種病原復(fù)合感染，豬鏈球菌2型(50.7%)、胸膜肺炎放線桿菌(40.3%)、肺炎支原體(100.0%)、乙型腦炎病毒(41.3%)、豬圓環(huán)病毒2型(74.8%)、豬傳染性胃腸炎病毒(73.8%)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(44.7%)7種病原的檢出率相對較高，豬細(xì)小病毒(26.0%)、豬偽狂犬病病毒(15.6%)、腸道中蠕蟲(3.2%)有一定檢出率；要求強免的豬瘟病毒(62.8%)、口蹄疫病毒(35.8%)免疫合格率較低，豬偽狂犬病病毒免疫合格率高達(dá)98.4%。本次調(diào)查未檢出沙門氏菌、布魯氏菌、豬痢疾蛇樣螺旋體、皮膚病原真菌、甲型流感病毒、弓形蟲、體外寄生蟲和糞便球蟲。結(jié)論廣東地區(qū)存欄實驗用小型豬存在多種病原復(fù)合感染，需加強免疫和質(zhì)量控制，逐步建立高等級群體；同時也為實驗用小型豬地方標(biāo)準(zhǔn)乃至國家標(biāo)準(zhǔn)的制/修訂提供了依據(jù)。

實驗用小型豬；病原菌；病毒；寄生蟲；調(diào)查

研究證明，豬在藥代動力學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和解剖學(xué)等多個方面與人類非常相似[1]，是一種理想的實驗動物，可替代犬、猴用于器官移植、外科模型、教學(xué)和藥物臨床前評價等生物醫(yī)學(xué)研究[2]。小型豬由于具有體小、操作方便等優(yōu)點，已經(jīng)在生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，日益成為一種理想的實驗動物，然而我國尚未有實驗用小型豬相應(yīng)的國家標(biāo)準(zhǔn)，僅北京、上海、廣西、江蘇等地方提出了地方標(biāo)準(zhǔn)，且各地標(biāo)準(zhǔn)存在較大差異[3-6]，在一定程度上阻礙了小型豬的實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化研究和推廣應(yīng)用。由于廣東省缺乏實驗用小型豬的地方標(biāo)準(zhǔn)，并且制標(biāo)、立標(biāo)的周期長，目前廣東省實驗動物行政許可需要對外來地方標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行確認(rèn)，鑒于各地已有地方標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的技術(shù)指標(biāo)差異很大，對廣東地區(qū)的適用性需要進(jìn)行科學(xué)探討。

此前，國內(nèi)有研究人員對部分地區(qū)的實驗用小型豬病原攜帶情況進(jìn)行了調(diào)查，顯示病原攜帶情況除與品系相關(guān)外，還具有區(qū)域性特點[7-10]。目前，尚無關(guān)于廣東地區(qū)實驗用小型豬流行病調(diào)查的相關(guān)報道。本研究通過對廣東地區(qū)小型豬繁殖基地生產(chǎn)的小型豬進(jìn)行人獸共患病和高發(fā)病原的流行病學(xué)調(diào)查，旨在了解實驗用小型豬感染性疾病的病原攜帶狀況及其分布特點，為小型豬的質(zhì)量檢測、廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)乃至國家標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實驗動物

本研究抽樣調(diào)查的實驗動物來自廣東省4家實驗用小型豬生產(chǎn)單位(用代號A、B、C、D單位表示)，共抽取154頭小型豬，品系包括巴馬小型豬(bama minipig,BMP)、蕨麻小型豬(Juema minipig,JMP)、西藏小型豬(Tibet minipig,XZP)和五指山小型豬(Wuzhishan minipig,WZSP)。具體抽樣信息見表1。

1.2主要試劑與儀器

DHL平板、沙氏瓊脂平板購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；肛拭子運送培養(yǎng)基購自廣州陽普醫(yī)療科技股份有限公司；ID 32E鑒定條、氧化酶試劑購自法國生物梅里埃股份有限公司；三糖鐵、半固體瓊脂購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；糖發(fā)酵培養(yǎng)基、氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基、氰化鉀培養(yǎng)基、蛋白胨水、靛基質(zhì)試劑購自杭州濱和微生物試劑有限公司；鼠傷害沙門菌(CMCC50115)購自廣東省微生物菌種保藏中心；沙門多價診斷血清購自寧波天和微生物試劑有限公司；布氏桿菌試管凝集抗原購自中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所；豬ELISA試劑盒購自TSZ公司和武漢科前生物股份有限公司；弓形蟲間接血凝試驗檢測試劑購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所；DNA抽提試劑，豬痢疾蛇樣螺旋體熒光PCR檢測試劑盒購自廣州旭牧生物科技有限公司；無水乙醇購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 不同生產(chǎn)單位抽樣調(diào)查的實驗用小型豬品系及數(shù)量

生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠，SPX-288型)；生物安全柜(德國，Biometra型)；ATB梅里埃鑒定儀(法國，ATB NEW型)；離心機(jī)(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，TG16-W型)；恒溫?fù)u床(寧波江南儀器廠，KYC100型)；生物顯微鏡(德國，Leica DM500型)；酶標(biāo)儀(美國，Bio-rad 680型)；酶標(biāo)洗板機(jī)(北京拓普分析儀器公司，DEM-Ⅲ型)；恒溫培養(yǎng)箱(英國，SPX-250B型)；恒溫孵育器(杭州奧盛儀器有限公司，K-20型)；漩渦振蕩器(天津津立儀器設(shè)備科技發(fā)展有限公司，TM60-4型)；PCR工作臺(上海市金鵬科技有限公司，BHC-1300II A/B3型)；AB-7500熒光定量PCR儀(北京新陽創(chuàng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，7500型)；冰箱(容聲，BCD-295WYL型)；可見光分光光度計(上海上分計量檢測有限公司，722S型)。

1.3實驗方法

1.3.1 樣本采集

血清取樣：從小型豬前腔靜脈叢無菌采血5 mL，加入肝素抗凝管中，輕輕混勻，離心后分離血漿用于ELISA檢測，剩下血細(xì)胞用于DNA抽提。糞便：取豬新鮮糞便(含粘液)或肛拭子用于腸道病原菌和腸道寄生蟲檢測。體表拔毛取樣：用鑷子在耳根、頸后、眼周、背部、臀部和腹股溝等易感部位分別拔取少許被毛，散放于載玻片上，用透明膠帶壓住用于檢體外寄生蟲。取皮毛、鱗屑：用刮刀刮取動物皮毛、鱗屑接種于沙氏平板培養(yǎng)，用于皮膚病原真菌檢測。

1.3.2 檢測指標(biāo)及方法

檢測指標(biāo)共20項，包括病原菌指標(biāo)7項，病毒指標(biāo)9項和寄生蟲指標(biāo)4項，具體檢測指標(biāo)和方法見表2。ELISA、 PCR方法直接參照試劑盒說明書進(jìn)行檢測，病原菌培養(yǎng)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，非免疫群體以檢出率(陽性數(shù)量/樣本總量×100%)表示，免疫群體以免疫合格率(抗體陽性數(shù)量/樣本總量×100%)表示。

2 結(jié)果

2.1不同生產(chǎn)單位實驗用小型豬的病原檢測結(jié)果

本次調(diào)查結(jié)果見表2，不同生產(chǎn)單位實驗用小型豬的病原檢測結(jié)果存在差異。

在病原菌方面，4個生產(chǎn)單位都檢出豬鏈球菌2型和胸膜肺炎放線桿菌，感染率均較高，總體感染率達(dá)到50.7%和40.3%。豬肺炎支原體方面，A和C單位未檢測，B和D單位的檢出率為100%。4個生產(chǎn)單位均未檢出沙門氏菌、布魯氏菌、豬痢疾蛇樣螺旋體和皮膚病原真菌。

在病毒方面，年度國家動物疫病強制免疫計劃要求對豬瘟、口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征病毒進(jìn)行免疫[11]。4家單位均未免疫豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗，但均能檢測到病毒感染，平均感染率達(dá)44.7%。A和B單位免疫了豬瘟病毒疫苗，A、B和C單位免疫了口蹄疫病毒疫苗，但免疫合格率低，未免疫的單位均未檢測到相應(yīng)病毒抗體。B單位免疫了偽狂犬病毒疫苗，免疫率為98.4%，其他3家單位未免疫該病毒疫苗，但是均能檢測到不同比例的抗體。乙型腦炎病毒和豬圓環(huán)病毒2型4個生產(chǎn)單位皆有不同程度的感染，C單位豬圓環(huán)病毒2型感染率達(dá)100%。4家單位中，B和C單位檢測到豬細(xì)小病毒感染。4家單位中，只有B和D單位進(jìn)行了豬傳染性胃腸炎的檢測，均有很高的檢出率。

在寄生蟲方面，所有4家單位均未檢出弓形蟲、體外寄生蟲和糞便球蟲，A、B、D單位檢出少量腸道蠕蟲。

2.2不同品系小型豬的病原免疫與感染情況

將檢測結(jié)果按小型豬品系進(jìn)行分類統(tǒng)計(表3)，不同品系的小型豬病原免疫和感染情況總體差異不大。

疫苗免疫方面，只對豬瘟病毒、口蹄疫病毒和豬偽狂犬病病毒進(jìn)行了免疫，豬偽狂犬病病毒免疫合格率最高，超過95%；口蹄疫病毒免疫合格率最低，均未超過60%；對于豬瘟病毒，只有巴馬小型豬免疫合格率達(dá)標(biāo)。未免疫豬瘟病毒、口蹄疫病毒群體檢測結(jié)果為陰性，而未免疫豬偽狂犬病病毒群體有一定的檢出率。

群體病原感染方面，所有小型豬均未檢出沙門氏菌、布魯氏菌、豬痢疾蛇樣螺旋體、皮膚病原真菌、豬流感、弓形蟲、體外寄生蟲和糞便球蟲；所有受檢小型豬均檢測到豬鏈球菌2型、胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、乙型腦炎病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。在腸道蠕蟲感染方面，有三個品系小型豬檢測到蟲體。

表2 不同生產(chǎn)單位的實驗用小型豬病原感染情況

注：*，為免疫群體的免疫合格率。

Note.*，indicats qualified rate of an immunized population.

表3 不同品系的實驗用小型豬的病原感染情況

注：*，為免疫群體的免疫合格率。

Note. *，indicates qualified rate in immunized population.

3 討論

微生物和寄生蟲感染實驗動物不僅會干擾試驗結(jié)果，影響動物生產(chǎn)，甚至還會威脅人類健康，因此需要定期開展病原監(jiān)測[12]。本研究對廣東省保種繁育的實驗用小型豬開展了7種病原菌、9種病毒和4種寄生蟲的流行病學(xué)調(diào)查研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各4種品系的小型豬均存在多種病原復(fù)合感染，不同品系的小型豬對病原的易感性總體差異不大。

現(xiàn)有關(guān)于實驗用小型豬流行病學(xué)調(diào)查研究結(jié)果顯示，不同地理區(qū)域、不同品系小型豬病原攜帶情況存在一定差異[7-10]。由于尚無關(guān)于廣東地區(qū)實驗用小型豬的流行病學(xué)調(diào)查報道，本研究可以彌補這方面的不足。本次調(diào)查結(jié)果顯示，豬鏈球菌2型、胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2型、乙型腦炎病毒、豬細(xì)小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等主要病原流行特征與已有報道相似，只是存在感染率的差異；但廣東地區(qū)豬傳染性胃腸炎病毒檢出率高，甚至達(dá)到100%的感染率；廣東地區(qū)未檢出豬流感病毒(H1型)。本研究結(jié)果中實驗用小型豬肺炎支原體的檢出率與廣東地區(qū)商品豬肺炎支原體的調(diào)查結(jié)果相似[13]，表明豬種間病原的易感性差異不大，與地域性病原流行相關(guān)性高。

根據(jù)《2016年國家動物疫病強制免疫計劃》的要求，對高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性豬藍(lán)耳病、豬瘟，群體免疫密度應(yīng)常年保持在90%以上，其中應(yīng)免畜禽免疫密度應(yīng)達(dá)到100%，免疫抗體合格率全年保持在70%以上[11]。而本調(diào)查結(jié)果，口蹄疫病毒(35.8%)，豬瘟病毒(62.8%)的免疫合格率都相對比較低，達(dá)不到免疫要求，部分生產(chǎn)單位未免疫或未及時免疫高危病原，存在較大風(fēng)險。所有生產(chǎn)單位均未免疫豬繁殖與呼吸綜合征病毒，但所有品系均檢測到感染，表明小型豬對該病毒的易感性較高或感染后可檢測到抗體，與潘金春等[14]研究結(jié)果吻合。

本次調(diào)查結(jié)果顯示，廣東地區(qū)現(xiàn)有普通級實驗用小型豬存在多種病原復(fù)合感染并趨于復(fù)雜化，表明在普通級小型豬群體通過病原篩選高質(zhì)量小型豬乃至SPF級小型豬的可行性不高，需要建立屏障環(huán)境生產(chǎn)繁育高等級小型豬。本研究結(jié)果對指導(dǎo)實驗用小型豬的生產(chǎn)、管理和使用有著重要的意義，同時可為小型豬質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制/修訂提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1] Wakeman DR, Crain AM, Snyder EY. Large animal models are critical for rationally advancing regenerative therapies[J].Regen Med，2006, 1:405-413.

[2] Pan J, Min F, Wang X, et al. Establishment of a special pathogen free Chinese Wuzhishan minipigs colony [J].J AnimSci Technol，2015, 57:7.

[3] DB11/T 828.1-2011, 實驗用小型豬第1部分:微生物學(xué)等級及監(jiān)測[S].

[4] DB11/T 828.2-2011, 實驗用小型豬第2部分:寄生蟲學(xué)等級及監(jiān)測[S].

[5] DB31/T 240-2001, 實驗動物實驗用小型豬[S].

[6] DB45/T546-2008, 實驗動物小型豬[S].

[7] 胡燕, 楊欣艷, 王傳彬, 等.我國實驗用小型豬三個種群微生物感染狀況調(diào)查[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2006,16(10): 599-602.

[8] 田維毅, 錢寧, 王平, 等.貴州小型豬病原生物攜帶和感染狀況的調(diào)查[J].實驗動物科學(xué)，2007,24(6):86-88.

[9] 楊欣艷, 胡燕, 王傳彬,等.國內(nèi)不同地區(qū)實驗用小型豬種群微生物感染狀況調(diào)查[J].實驗動物科學(xué), 2007,24(1):21-24.

[10] 王峰, 孫瑞萍, 劉濤, 等.海南封閉群五指山小型豬病原微生物攜帶狀況調(diào)查[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(7): 200-201.

[11] 2016年國家動物疫病強制免疫計劃[E].農(nóng)醫(yī)發(fā)[2016]10號.

[12] 孫倩.實驗動物學(xué)基礎(chǔ)[M].北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社.2005:97-129.

[13] 萬慶文, 謝王韻, 溫賢誠, 等.廣東東莞地區(qū)豬肺炎支原體感染的血清學(xué)調(diào)查[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技.2014,39(3):22-23.

[14] 潘金春, 任柏樺, 閔凡貴, 等.不同品系小型豬對高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒的敏感性篩選[J].中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2015,25(6):14-17.

MicrobiologicalandparasitologicalinvestigationofexperimentalminipigsinGuangdongprovince

HUANG Shu-wu1,2， MIN Fan-gui1,2， WU Rui-ke1,2， CHEN Mei-ling1,2， WANG Xi-long1,2*， PAN Jin-chun1,2*

(1.Guangdong Laboratory Animals Monitoring Institute, Guangzhou 510663,China； 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Laboratory Animals, Guangzhou 510663)

ObjectiveTo conduct a microbiological and parasitological investigation of experimental minipigs in Guangdong province.MethodsFour major experimental minipig production units in Guangdong province were included in this investigation. Samples were taken from a total of 154 pigs of 4 brreds, i.e., Bama minipigs, Juema minipigs, Tibet minipigs and Wuzhishan minipigs. Pig fur, scales, serum, rectal swabs and feces samples were collected for detection of 20 pathogens. The data were analyzed and compared among the production units and breeds.ResultsMixed infections were detected in all the four institutions. The infection rates of 7 pathogens were rather high:Streptococcussuistype 2 (50.7%),Actinobacilluspleuropneumoniae(40.3%),Mycoplasmahyopneumoniae(100%), Japanese encephalitis virus (41.3%), porcine circovirus type 2 (74.8%), porcine transmissible gastroenteritis virus (73.8%),gastroenteritis virus (44.7%).Porcine parvovirus (26.0%), pseudorabies virus(15.6%) and intestinal worms (3.2%) were also detected in some animals. The immune qualified rates of classical swine fever virus (62.8%) and foot-and-mouth disease virus (35.8%) were rather low. The immune qualified rate of pseudorabies virus was as high as 98.4%. Besides,Salmonella,Brucella, swine dysentery snake like spirochetes, dermatophytes, influenza virus. Toxoplasma gondii, ectoparasites, and coccidia were not detected.ConclusionsThe results of this investigation indicate that epidemiological quality control of pathogens in experimental minipigs and efforts to establish high grade minipig population in Guangdong province remain to be strengthened. Our study also provides a basis for revision of local and even national standards for experimental minipigs.

Experimental minipigs; Pathogenic bacteria; Virus; Parasite; Investigation

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0069-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.014

2017-03-21

廣東省科技計劃項目(2015A030302028，2015A030303004)。

黃樹武(1990-)，男，學(xué)士，研究方向：實驗動物質(zhì)量監(jiān)測和病原菌研究。E-mail: hsw2015@gdlami.com

王希龍(1963-)，男，研究員，研究方向：小型豬實驗動物標(biāo)準(zhǔn)化和比較醫(yī)學(xué)研究。E-mail: wangxilonggd@163.com。

潘金春(1979-)，男，副研究員，研究方向：實驗動物質(zhì)量監(jiān)測和比較醫(yī)學(xué)研究。E-mail: jcpan@sina.com。*共同通訊