丹酚酸A改善ZDF大鼠視網膜病變及其作用機制

馬全鑫，陳小真,2，戎亦驪，黃俊杰，朱科燕，陳 誠，施佳君，李園園，陳民利*

(1.浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心/比較醫(yī)學研究所，杭州 310053； 2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027)

研究報告

丹酚酸A改善ZDF大鼠視網膜病變及其作用機制

馬全鑫1，陳小真1,2，戎亦驪1，黃俊杰1，朱科燕1，陳 誠1，施佳君1，李園園1，陳民利1*

(1.浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心/比較醫(yī)學研究所，杭州 310053； 2.溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027)

目的觀察丹酚酸A(SAA)對Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠視網膜病變的干預作用，探討SAA可能的作用機制。方法取7～8周齡雄性ZDF大鼠32只，Purina#5008飼料飼喂4周后，按血糖平均分為模型對照組，SAA高、低劑量組與二甲雙胍(Met)組，每組8只。另取同齡雄性ZL大鼠8只作為正常對照。SAA低、高劑量組每日尾靜脈注射SAA 0.5 mg/kg、1 mg/kg，Met組每日經口灌胃Met 200 mg/kg，連續(xù)給藥12周，觀察ZDF大鼠白內障發(fā)生率和視網膜病理學改變，并檢測血糖血脂、糖化血紅蛋白(HbA1c)和血清白介素1(IL-1)、IL-6、氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)、丙二醛(MDA)含量和脂蛋白相關磷脂酶A2(Lp-PLA2)的活性，以及尿液中轉鐵蛋白(TRF)、視黃醇結合蛋白(RBP)的含量。結果模型對照組大鼠血糖、血脂及HbA1c均上升，糖尿病性白內障發(fā)病率68.75 %，視網膜基底增厚和微血管病變，血清IL-1、IL-6、ox-LDL和MDA含量和Lp-PLA2活性顯著升高，尿液中TRF和RBP含量亦顯著升高。給予SAA后，ZDF大鼠白內障發(fā)病率降低，視網膜病理學形態(tài)有不同程度的改善，血清IL-1、IL-6、ox-LDL、MDA含量和Lp-PLA2活性下降，尿液中TRF、RBP含量亦下降。結論SAA能改善ZDF大鼠糖尿病視網膜病變，降低白內障發(fā)生率，其作用途徑可能與抑制慢性炎癥、防止脂質過氧化和降低Lp-PLA2活性有關。

2型糖尿??；視網膜病變；Lp-PLA2；ZDF大鼠

近年來，全球糖尿病發(fā)病率快速上升，其中2型糖尿病占85%[1]。2型糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，可引發(fā)多種微血管和大血管并發(fā)癥。糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是2型糖尿病的主要并發(fā)癥之一。長期的高血糖、高胰島素及慢性炎癥反應會引起視網膜不可逆的病理變化，具體表現(xiàn)為微動脈瘤、微血管病變、視網膜出血、出現(xiàn)視網膜新生血管及黃斑水腫等[2, 3]，最終導致視網膜脫離而失明，嚴重影響患者的生活質量。因此改善或減緩糖尿病患者的視網膜病變至關重要。

丹酚酸A(salvianolic acid A，SAA)是我國傳統(tǒng)藥用植物丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)中的活性最強的酚酸類物質。據(jù)報道，SAA具有顯著的抗炎、抗氧化、保護血管內皮細胞、抗纖維化和防治1型糖尿病并發(fā)癥等藥理活性[4-6]，這些藥理作用在一定程度上與DR的防治機制相一致。因此，本文使用ZDF大鼠作為DR動物模型，觀察SAA對DR的防治作用，并探討SAA可能的作用機制，為SAA的臨床應用提供參考。

1 材料和方法

1.1實驗動物

32只SPF級7～8周齡雄性Zucker糖尿病肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠，體重(200±10)g及8只同周齡的雄性Zucker瘦型(Zucker lean，ZL)大鼠，體重(170±10)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2012-001]；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心屏障實驗室[SYXK(浙)2013-184]，環(huán)境溫度：(22±2)℃，相對濕度：50% ～60%，光照：12 h/12 h明暗交替，噪聲<50 dB；在IVC籠內飼養(yǎng)，自由飲食。經浙江中醫(yī)藥大學實驗動物倫理審查委員會通過，決議編號：ZSLL-2015-72。

1.2主要試劑與儀器

SAA粉針劑，由正大青春寶藥業(yè)有限公司提供；鹽酸二甲雙胍片(metformin，Met)，國藥準字：H20023370，由中美上海施貴寶制藥有限公司生產；血糖(glucose，GLU)，總膽固醇(total cholestrol，TC)檢測試劑，購自上海德賽診斷系統(tǒng)有限公司；糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)檢測試劑，購自Trinity Biotech公司；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(ELISA)試劑盒：轉鐵蛋白(transferrin，TRF)，視黃醇結合蛋白(retinol-binding protein，RBP)，白細胞介素-1(interleukin-1，IL-1)，白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)，購自杭州誠維生物有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MDA)測試盒購自南京建成生物工程研究所；脂蛋白相關磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)活性檢測試劑盒，購自Abcam公司；改良FAA固定液：70%乙醇90 mL，冰醋酸5 mL，40%甲醛5 mL混合配制而成；PAS染色試劑盒，購自珠海貝索生物技術有限公司。

7020全自動生化分析儀(日本日立公司)；Hb9210糖化血紅蛋白分析儀(愛爾蘭Trinity Biotech公司)；Thermo多功能酶標儀(美國Thermo公司)；AL204-電子分析天平(瑞士Mettler公司)；Nana Zoomer 2.0 RS數(shù)字切片掃描設備(日本濱松公司)；HM335E半自動石蠟切片機(德國Microm公司)；自動染色機(德國Leica公司)。

1.3實驗方法

1.3.1 實驗動物分組

取32只7～8周齡雄性ZDF大鼠，飼喂Purina#5008飼料，另取8只同周齡ZL大鼠飼喂基礎飼料，作為正常對照組。飼喂4周后，將ZDF大鼠按血糖水平分層隨機分為均勻4組，即模型對照組，SAA高、低劑量組和Met組，每組8只。ZDF大鼠2只一籠，ZL大鼠4只一籠。SAA高、低劑量組ZDF大鼠每天經尾靜脈注射SAA 1 mg/kg、0.5 mg/kg，Met組大鼠每天經口灌胃200 mg/kg，模型對照組和正常對照組每天尾靜脈注射5 mL/kg生理鹽水，連續(xù)給藥12周。

1.3.2 一般情況觀察

實驗期間觀察動物的飲食、飲水、糞便和排尿情況以及精神活動狀態(tài)，并記錄白內障發(fā)生數(shù)。

1.3.3 生化指標檢測

在給藥12周時，24 h代謝籠法收集的尿液，檢測尿液中TRF、RBP含量，隔2 d后禁食不禁水12 h后，尾靜脈取血約1 mL，一部分全血使用EDTA抗凝，用于檢測HbA1c，另一部分分離血清，使用全自動生化檢測儀檢測GLU和TC，試劑盒檢測IL-1、IL-6、ox-LDL、MDA含量和Lp-PLA2活性，具體方法按試劑盒說明書進行。

1.3.4 眼球病理組織學觀察

取血后，對動物施行安死術，每組中隨機選取4只大鼠，小心地取下眼球，置于4%中性甲醛固定24 h后，流水沖洗1 h，從睫狀體后部經鋸齒緣環(huán)形剪開虹膜，去除前眼部分，將眼杯以視乳頭為中心，分切成3份均勻的橘瓣樣片狀，剝離視網膜層，PBS緩沖液中4℃浸泡過夜，用粗吸管輕吸出視網膜層，放入3%胰蛋白酶中消化2～3 h，10 mL消化1只眼視網膜，間隔20 min搖晃消化小瓶，終止消化，吸入蒸餾水中漂洗吹打，至僅剩下一層透明的視網膜血管網，用粗吸管將毛細血管網帶水吸取置于潔凈載玻片上，輕搖晃載玻片使水滴中血管網展開鋪平，室溫自然干燥后，按試劑盒說明書進行PAS染色。將另外4只大鼠眼球從眼眶中小心取出，直接置于改良FAA固定液，固定24 h后，以視乳頭為中心，垂直于虹膜切開，固定、包埋、切片，進行HE染色并觀察，隨后在NDP.view2軟件中，每只大鼠各選取黃斑區(qū)附近的5個點，測量從內界膜到視網膜色素上皮細胞層的厚度，并計算各組視網膜的平均厚度。

1.4統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1對血液生化的影響

由表1可見，給藥12周時，與正常對照組比較，模型對照組GLU、TC與HbA1c均升高(P< 0.01),與模型對照組比較，1.0 mg/kg SAA組HbA1c降低(P< 0.05)，Met組GLU與HbA1c下降(P< 0.05，P< 0.01)。

2.2對白內障發(fā)生率與視網膜病變的影響

給藥12周時，正常對照組未出現(xiàn)白內障，模型對照組發(fā)病率68.75%，0.5 mg/kg SAA組發(fā)病率為31.25%，1 mg/kg SAA組發(fā)病率為12.50%，Met組發(fā)病率為31.25%，見表2。

由圖1 HE染色結果可見，正常對照組視網膜各層細胞排列緊密，邊界清晰；模型對照組視網膜神經纖維層結構疏松，有黃斑區(qū)水腫，各層細胞排列紊亂，可見毛細血管壁增厚；0.5 mg/kg SAA組與1.0 mg/kg SAA組視網膜組織結構有不同程度的改善，血管壁增厚程度減少；經NDP.view2軟件測量，與正常對照組比較，模型對照組視網膜增厚(P< 0.01)，與模型對照組比較，SAA高、低劑量組與Met組視網膜厚度降低(P< 0.01)，見圖2。

表1 SAA對ZDF大鼠血液生化指標的影響(n=8)

注：與正常對照組相比，##P< 0.01；與模型對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note: Compared with the control group,##P< 0.01； Compared with the model group,*P< 0.05，**P< 0.01.

表2 SAA對ZDF大鼠白內障發(fā)生率的影響(n=8)

注：A：正常對照組；B：模型對照組；C：0.5 mg/kg SAA組；D：1.0 mg/kg SAA組；E：Met組。圖1 SAA對ZDF大鼠視網膜的影響(HE染色)Note：A：Control group; B: Model group; C: 0.5 mg/kg SAA group; D:1.0 mg/kg SAA group; E: Met group.Fig.1 Effect of SAA on the retina of the ZDF rats.HE stain

注：與正常對照組相比，##P< 0.01；與模型對照組相比，** P< 0.01。圖2 SAA對ZDF大鼠視網膜厚度的影響Note: Compared with the control group, ##P< 0.01；Compared with the model group, ** P< 0.01.Fig.2 Effect of SAA on the thickness of retina of the ZDF rats

由圖3視網膜血管消化鋪片PAS染色結果可見，正常對照組視網膜血管形態(tài)完整，內皮細胞和周細胞分布規(guī)則；模型對照組視網膜內皮細胞增多且部分增生，細胞核大小不一，周細胞減少；各給藥組視網膜微血管形態(tài)均有不同程度的改善，且1.0 mg/kg SAA組未發(fā)現(xiàn)明顯的內皮細胞增生或周細胞減少現(xiàn)象。

2.2對尿TRF和尿RBP含量的影響

由圖4可見，與正常對照組比較，模型對照組ZDF大鼠尿液中RBP和TRF含量均升高(P< 0.01)；與模型對照組比較，SAA高、低劑量組和Met組尿液RBP均下降(P< 0.05)；1 mg/kg SAA組尿液TRF含量下降(P< 0.05)。

2.3對血清炎癥因子水平的影響

由圖5可見，給藥12周時，與正常對照組比較，模型對照組ZDF大鼠血清IL-1和IL-6含量上升(P< 0.01)；與模型對照組比較，1.0 mg/kg SAA組ZDF大鼠血清IL-1和IL-6下降(P< 0.05)，而200 mg/kg Met血清IL-1和IL-6亦有下降趨勢，但差異無顯著性(P> 0.05)。

2.4對血清脂質過氧化的影響

由圖6可見，給藥12周時，與正常對照組比較，模型對照組ZDF大鼠血清MDA和ox-LDL含量上升(P< 0.01)；與模型對照組比較， SAA高、低劑量組和Met組血清MDA含量均下降(P< 0.01)；1.0 mg/kg SAA組ox-LDL含量下降(P< 0.01)，其余各給藥組差異無顯著性。

注：A：正常對照組；B：模型對照組；C：0.5 mg/kg SAA組；D：1.0 mg/kg SAA組；E：Met組?！? 周細胞；→：內皮細胞?！簾o細胞毛細血管。圖3 SAA對ZDF大鼠視網膜微血管形態(tài)的影響(PAS染色)Note：A：Control group; B:Model group; C:0.5 mg/kg SAA group; D:1.0 mg/kg SAA group; E: Met group.→: Pericytes；→：Endotheliocyte；→：Acellular capillaries.Fig.3 Effect of SAA on the retina microvessels of the ZDF rats.PAS stain

注：與正常對照組相比，##P< 0.01；與模型對照組相比，* P< 0.05。圖4 SAA對ZDF大鼠尿RBP和尿TRF的影響Note: Compared with the control group, ##P< 0.01；Compared with the model group, * P< 0.05.Fig.4 Effect of SAA on RBP and TRF in urine of the ZDF rats

注：與正常對照組相比，##P< 0.01；與模型對照組相比，* P< 0.05。圖5 SAA對ZDF大鼠血清炎癥因子的影響Note: Compared with the control group, ##P< 0.01；Compared with the model group, * P< 0.05.Fig.5 Effect of SAA on inflammatory factor in serum of the ZDF rats

2.5對血清Lp-PLA2活性的影響

由圖7可見，給藥12周時，與正常對照組比較，模型對照組ZDF大鼠血清Lp-PLA2活性上升(P< 0.01)；與模型對照組比較，SAA高、低劑量組和Met組Lp-PLA2活性均下降(P< 0.05，P< 0.01)。

注：與正常對照組相比，##P< 0.01；與模型對照組相比，** P< 0.01。圖6 SAA對ZDF大鼠脂質過氧化的影響Note: Compared with the control group, ##P<0.01；Compared with the model group, ** P< 0.01.Fig.6 Effect of SAA on lipid peroxidation of the ZDF rats

注：與正常對照組相比，##P< 0.01；與模型對照組相比，* P< 0.05，** P< 0.01。圖7 SAA對ZDF大鼠血清Lp-PLA2活性的影響Note: Compared with the control group, ##P< 0.01；Compared with the model group, * P< 0.05，** P< 0.01.Fig.7 Effect of SAA on the activity of Lp-PLA2 in serum of the ZDF rats

3 討論

DR是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥。國內常用的2型糖尿病DR動物模型多為鏈脲佐菌素誘導模型[7]，而ZDF大鼠作為一種新引進的自發(fā)型2型糖尿病動物模型，具有微血管病變發(fā)病周期短，個體差異小，與人類臨床癥狀相似等特點[8]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，ZDF大鼠在20周齡時，出現(xiàn)血糖血脂升高、出現(xiàn)糖尿病性白內障、視網膜厚度增加、視網膜血管周細胞數(shù)目明顯減少等特征性病變，給予SAA能有效降低白內障發(fā)病率、改善糖尿病視網膜微血管病變、抑制視網膜水腫，提示SAA具有抗DR的作用。

尿RBP、TRF與DR的發(fā)生和發(fā)展的嚴重程度密切相關，DR的程度可隨尿RBP和TRF的增高而加重[9,10]。有學者認為，如果存在持續(xù)性的微量白蛋白尿，視網膜會出現(xiàn)旁中央區(qū)光敏度下降，甚至出現(xiàn)視野缺損[11]。因此，尿RBP、TRF可做為DR早期診斷的獨立預測因子。本實驗中，模型對照組ZDF大鼠尿RBP和TRF含量顯著升高，SAA組均有不同程度的下降，且呈一定的劑量關系，進一步證實了SAA對糖尿病視網膜微血管的保護作用。本實驗還發(fā)現(xiàn)，SAA具有一定的降糖作用但不顯著，因此我們推測SAA并非通過調節(jié)血糖血脂抑制DR的形成，而是通過其他作用途徑來實現(xiàn)的。

慢性炎癥在DR的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要而又復雜的角色。一方面，視網膜炎癥反應可通過影響內皮型一氧化氮合酶導致眼內血壓升高，并能通過產生血管內皮生長因子誘導新生血管形成，而這些血管滲透性高，易發(fā)生出血[12,13]；另一方面，病變的視網膜中炎癥介質和粘附因子表達升高，可導致白細胞粘附，加劇了局部的炎癥反應，進一步誘發(fā)血管損傷[14]。因此，降低機體炎癥反應是防治DR的重要策略之一。多項研究已證實SAA具有顯著的抗炎活性[15,16]，本研究同樣發(fā)現(xiàn)，SAA能明顯降低ZDF大鼠IL-1和IL-6等炎癥標記物，而Met組并未顯示出明顯的抗炎作用，提示SAA能通過減輕機體炎癥反應減緩DR的發(fā)展，而在抗炎方面的作用SAA優(yōu)于Met。

氧化應激是指機體在遭受各種有害刺激時，自由基的產生和抗氧化防御系統(tǒng)之間的失衡，從而導致組織損傷的過程。在高糖狀態(tài)下，氧化應激增強，產生過氧化產物，激活與糖尿病微血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展有關的信號傳導通道[17]。本實驗結果顯示SAA能顯著降低血清ox-LDL和MDA含量，而這兩者是典型的脂質過氧化產物，說明SAA具有較強的抗氧化活性。Met也有降低MDA的作用，但在降低ox-LDL方面沒有SAA作用明顯，提示SAA具有顯著的抗氧化活性，能通過減少脂質過氧化來降低對視網膜微血管的損傷作用。

Lp-PLA2是一種炎癥性疾病的新型標記物，其活性的增加意味著血管功能出現(xiàn)障礙[18]。Lp-PLA2能水解ox-LDL產生溶血卵磷脂和氧化游離脂肪酸，二者是強烈的過氧化物質和促炎因子，對血管內皮細胞造成損傷，使血管通透性增加。近來有研究發(fā)現(xiàn)，降低Lp-PLA2活性能有效抑制糖尿病所致的血-視網膜屏障功能障礙，其作用機制為Lp-PLA2抑制劑能減少溶血卵磷脂的產生，減少血管內皮生長因子受體2信號通路的激活，從而降低血管通透性[19]。因此，Lp-PLA2可能成為治療糖尿病患者黃斑水腫的新的治療靶點。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，SAA能顯著降低血清中Lp-PLA2活性，并呈一定的劑量關系，推測降低Lp-PLA2活性可能也是SAA改善ZDF大鼠視網膜病變的作用途徑之一。然而其具體作用機制尚不明確，需更多實驗加以闡釋。

綜上所述，SAA有減緩和改善糖尿病視網膜微血管病變的作用，其作用機制可能和抗炎、抗氧化以及降低Lp-PLA2活性有關。因此，SAA可以作為DR的一種有效輔助治療藥物，對于改善DR的預后有重要意義。

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EffectofsalvianolicacidAonretinopathyanditsmechanisminZDFrats

MA Quan-xin1， CHEN Xiao-zhen1,2， RONG Yi-li1， HUANG Jun-jie1， ZHU Ke-yan1， CHEN Cheng1， SHI Jia-jun1， LI Yuan-yuan1， CHEN Min-li1*

(1.Animal Experimental Research Center/Institute of Comparative Medicine, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China； 2.The Second Affiliated Hospital and Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325027)

ObjectiveTo observe the intervention effect of salvianolic acid A (SAA) on retinopathy of Zucker diabetic fatty (ZDF) rats and explore the possible action mechanism of SAA to prevent and treat diabetic retinopathy (DR).MethodsThirty-two 7-8-week old ZDF rats were taken and fed with Purina rat chow for 4 weeks. The ZDF rats were equally divided by the blood glucose into model group, 0.5 mg/kg SAA group, 1.0 mg/kg SAA group and metformin (Met) group. 8 Zucker lean (ZL) rats were taken as control group. After 12-week administration, incidence of cataracts and retinal pathology was observed, and levels of GLU, TC and HbA1cin blood, transferrin (TRF) and retinol binding protein (RBP) in urine and levels of interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), oxidized low density lipoprotein (ox-LDL), malondialdehyde (MDA) and lipoprotein related phospholipase A2 (Lp-PLA2) activity in serum were measured.ResultsIn the model group, GLU, TC, HbA1c, diabetic cataract incidence rate, retinal basement thickening and microangiopathy appeared in most of the rats. The levels of TRF and RBP in urine and levels of IL-1, IL-6, ox-LDL, MDA in serum were significantly increased, and Lp-PLA2 activity was also significantly increased. After SAA administration, the morbidity rate of cataract was reduced, and retinal pathological changes were improved in different degrees. The levels of TRF, RBP, IL-1, IL-6, ox-LDL, MDA and Lp-PLA2 activity was decreased.ConclusionsSAA can slow down the process of diabetic retinopathy in ZDF rats and reduce the incidence of cataract. The mechanisms of action may be related to inhibition of chronic inflammation, prevention of lipid peroxidation and reduction of Lp-PLA2 activity.

Type 2 diabetes mellitus; Retinopathy; Lp-PLA2; ZDF rats

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0040-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.008

2017-04-12

浙江省中醫(yī)藥管理局重點項目(2015ZZ009)；浙江中醫(yī)藥大學比較醫(yī)學創(chuàng)新團隊(XTD201301)。

馬全鑫(1988-)，男，碩士，研究方向：中藥藥理與比較醫(yī)學。E-mail: mqx1025@hotmail.com

陳民利(1963-)，女，教授，研究方向：實驗動物與比較醫(yī)學。E-mail: cmli991@aliyun.com