釩暴露對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和遷移的影響

余曉巍，胡楚元，熊志軍

(湖南省職業(yè)病防治院，長(zhǎng)沙 410003)

研究報(bào)告

釩暴露對(duì)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和遷移的影響

余曉巍，胡楚元，熊志軍

(湖南省職業(yè)病防治院，長(zhǎng)沙 410003)

目的觀察偏釩酸鈉(NaVO3·2H2O)暴露對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和遷移的影響，探討釩神經(jīng)毒性的相關(guān)機(jī)制。方法偏釩酸鈉孵育原代培養(yǎng)的SD大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，免疫熒光技術(shù)顯示小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的變化及其特異性標(biāo)志物Iba1的表達(dá)，免疫印跡技術(shù)檢測(cè)iNOS、COX-2、ERK和p-ERK蛋白表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)炎癥因子TNF-α，IL-1β的釋放水平；構(gòu)建劃痕遷移模型，免疫熒光技術(shù)記錄偏釩酸鈉對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果偏釩酸鈉孵育小膠質(zhì)細(xì)胞后，神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)由靜息態(tài)的分支狀向吞噬細(xì)胞樣形態(tài)轉(zhuǎn)變，其特異性標(biāo)志物Iba1表達(dá)顯著增加；iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)和TNF-α，IL-1β釋放水平與對(duì)照組相比較均顯著升高；偏釩酸鈉促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移。結(jié)論偏釩酸鈉顯著促進(jìn)了小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和遷移。

偏釩酸鈉；小膠質(zhì)細(xì)胞；炎性反應(yīng)；遷移

釩是地球上廣泛分布的微量元素。釩的大量開(kāi)發(fā)與應(yīng)用引發(fā)的環(huán)境問(wèn)題日益嚴(yán)重，生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢氣成為大氣中釩的重要來(lái)源[1,2]，廠區(qū)及附近的土壤、水源大都受到污染，尤以釩、錳、銅、鉛為主[3,4]，存在嚴(yán)重職業(yè)危害與環(huán)境污染。國(guó)內(nèi)外研究顯示，釩具有神經(jīng)毒性[5]，有研究發(fā)現(xiàn)釩甚至可以直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致明顯的神經(jīng)毒性[6]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞免疫細(xì)胞，在正常生理狀態(tài)下處“靜息”狀態(tài)，它們通過(guò)持續(xù)監(jiān)控微環(huán)境的變化維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[7]。而當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被迅速“激活”并對(duì)外界刺激做出反應(yīng)，如遷移、增殖、形態(tài)改變(從分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜖?、釋放免疫因子和炎性介質(zhì)，并參與細(xì)胞碎片吞噬[8,9]，這些作用對(duì)神經(jīng)元的損傷和修復(fù)具有雙重影響[10,11]。因此本研究擬通過(guò)觀察釩暴露對(duì)原代培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)和遷移的影響，探討釩神經(jīng)毒性的相關(guān)機(jī)制，以期為釩暴露導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷提供應(yīng)對(duì)策略。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SD乳鼠(出生24 h內(nèi))，體重6.5～9.0 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2016-0002]，在湖南省職業(yè)病防治院毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室[SYXK(湘)2014-0003]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)批準(zhǔn)[湘職防(2014)倫研批第006號(hào)]。

1.2主要試劑

偏釩酸鈉(NaVO3·2H2O)：分析純，購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；iNOS和COX-2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，OX- 42、Iba1、Hoechst 33258、ERK和p-ERK購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；熒光標(biāo)記二抗、FITC和羅丹明購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hylone公司； ELISA試劑盒(TNF-α、IL-1β)購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠皮層原代小膠質(zhì)細(xì)胞的制備

將新生SD乳鼠在無(wú)菌條件下斷頭、開(kāi)顱取腦后，置于冷PBS溶液中。分離大腦皮層、剪碎，0.125%的胰酶溶液于37℃消化20 min，2層紗布過(guò)濾后接種于多聚賴氨酸預(yù)先包被的75 mL培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后全量換液。之后每3 d換液一次，第14天將培養(yǎng)瓶旋緊密封，固定于37℃恒溫水平搖床內(nèi)，以220 r/min振蕩3 h，收集脫落細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)皿中，貼壁1 h后去除未貼壁細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

細(xì)胞爬片后，按免疫熒光法，用OX-42抗體標(biāo)記細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察。

1.3.3 免疫熒光檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化

細(xì)胞爬片后，25 μmol/L的偏釩酸鈉孵育小膠質(zhì)細(xì)胞12 h，用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS浸洗3次，每次10 min，0.3% Triton X-100室溫處理30 min后，加3% BSA室溫封閉30 min；加入Iba1抗體(1∶200)，4℃過(guò)夜；次日，PBS浸洗3次，每次10 min，加FITC標(biāo)記熒光二抗或羅丹明，室溫孵育1 h；PBS浸洗3次，每次10 min，甘油封片后，置于奧林巴斯FV1000熒光顯微鏡下觀察、拍照。采用奧林巴斯FV10-ASW顯微攝影圖像分析系統(tǒng)攝取免疫熒光圖像，隨機(jī)測(cè)定5個(gè)視野細(xì)胞熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)5次(n=5)。

1.3.4 劃痕遷移實(shí)驗(yàn)

在24孔板中按照5×105/孔進(jìn)行細(xì)胞爬片后，用1 mL吸管尖端在玻片上進(jìn)行劃痕，用DMEM培養(yǎng)基浸洗3次后，25 μM的偏釩酸鈉孵育小膠質(zhì)細(xì)胞12 h，按免疫熒光法，用OX-42抗體標(biāo)記細(xì)胞，置于奧林巴斯FV1000熒光顯微鏡下觀察、拍照，并計(jì)算進(jìn)入劃痕區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量。每次隨機(jī)選取5個(gè)視野，取平均值作為1個(gè)樣本。每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 5 次；按免疫印跡法，檢測(cè) ERK和p-ERK蛋白表達(dá)，每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次(n=3)。

1.3.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)iNOS、COX-2蛋白表達(dá)

將小膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，加入25 μM 的偏釩酸鈉處理，分別于6、12和24 h后，經(jīng)胰酶消化收集細(xì)胞，提取總蛋白。根據(jù) BCA 蛋白定量試劑盒的說(shuō)明蛋白定量后，進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，然后100 mA 3.5 h電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用濃度為5%的脫脂奶粉封閉1 h后，用PBST洗膜3次，每次10 min；將PVDF膜放入稀釋好的iNOS抗體(1∶1000)、COX-2抗體(1∶500)中，4℃過(guò)夜；次日用PBST洗膜3次，每次10 min，將PVDF膜放入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000稀釋)中，室溫孵育2 h；PBST洗膜3次，每次20 min；加ECL發(fā)光劑孵育，在3 ～15 min內(nèi)顯影、定影，分析。每次實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次(n=3)。

1.3.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

將小膠質(zhì)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h，加入25 μM 的偏釩酸鈉處理，分別于6、12和24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書的相關(guān)步驟檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎性因子 TNF-α、IL-1β含量的變化。

注：(A)OX- 42標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞；(B)Hoechst 33258標(biāo)記的細(xì)胞核；(C)A+B組合；(D)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)照組；(E)偏釩酸鈉處理組(25 μmol/L)；與對(duì)照組比較，** P< 0.01。圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞鑒定以及偏釩酸鈉對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Note.(A)Microglia labeled with OX- 42；(B)Cell nuclei labeled with Hoechst 33258；(C)Merged A and B；(D)Control group;(E)NaVO3·2H2O exposure group (25 μmol/L); Compared with the control group, ** P< 0.01.Fig.1 Microglia identification and the effect of NaVO3·2H2O on the morphology of microglia

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1原代小膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

小膠質(zhì)細(xì)胞所占總體細(xì)胞比例達(dá)到99%以上，表明SD大鼠皮層原代小膠質(zhì)細(xì)胞分離純化成功(圖1)。

2.2偏釩酸鈉暴露對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

未經(jīng)處理的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)為細(xì)長(zhǎng)分枝狀，25 μM的偏釩酸鈉孵育小膠質(zhì)細(xì)胞12 h后，小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)由細(xì)長(zhǎng)分枝狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜖?，表現(xiàn)為突起回縮和形態(tài)變圓25 μM的偏釩酸鈉孵育小膠質(zhì)細(xì)胞12 h，Iba1的相對(duì)熒光強(qiáng)度與對(duì)照組比較顯著增加，差異有顯著性(P< 0.01)，表明小膠質(zhì)細(xì)胞被顯著激活(圖1)。

2.3偏釩酸鈉暴露對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移的影響

與對(duì)照組比較，25 μM 的偏釩酸鈉處理小膠質(zhì)細(xì)胞12 h顯著上調(diào)了ERK磷酸化水平，并增強(qiáng)了小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移能力，差異有顯著性(P< 0.01)(圖2)。

2.4偏釩酸鈉暴露對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子的影響

小膠質(zhì)細(xì)胞在靜息狀態(tài)時(shí)幾乎不表達(dá)iNOS和COX-2，25 μM 偏釩酸鈉處理的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)水平隨時(shí)間的延長(zhǎng)增加(P< 0.05或P< 0.01)(圖3)。

小膠質(zhì)細(xì)胞在靜息狀態(tài)時(shí)分泌少量TNF-α和IL-1β，在被偏釩酸鈉激活后，小膠質(zhì)細(xì)胞大量分泌TNF-α和IL-1β，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)顯著增加，與對(duì)照組比較，差異有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)(表1)。

注：(A)免疫熒光檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移情況；(B)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析；(C)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p-ERK蛋白表達(dá)情況；與對(duì)照組比較，** P< 0.01。圖2 偏釩酸鈉對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞遷移以及ERK磷酸化水平的影響Note:(A)Representative photomicrographs of the migrating cells before and after treatment with a NaVO3·2H2O (25 μM);(B)Statistical analysis of the number of microglia migration;(C)The expression of p-ERK determined by Western blotting analysis；Compared with the control group,** P< 0.01.Fig.2 Effect of NaVO3·2H2O on microglial migration and the expression of p-ERK

注：(A)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS和COX-2蛋白表達(dá)；(B)灰度值統(tǒng)計(jì)分析；與對(duì)照組比較，* P< 0.05，** P< 0.01。圖3 各組間小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS和COX-2的蛋白表達(dá)情況Note:(A)The expression of iNOS and COX-2 by Western blotting analysis;(B)Statistical analysis of the gray value；Compared with control grouo, * P< 0.05，** P< 0.01.Fig.3 The expression of iNOS and COX-2 in different groups

Tab.1Comparison of TNF-α and IL-1β levels in the supernatant of microglial cultures in different groups

分組GroupsTNF?αIL?1β對(duì)照組Controlgroup4449±10．734963±14．58偏釩酸鈉6h處理組NaVO3·2H2Ofor6h9549±10．73?8363±14．58?偏釩酸鈉12h處理組NaVO3·2H2Ofor12h15949±10．73??25763±14．58??偏釩酸鈉24h處理組NaVO3·2H2Ofor24h24574±6．69??27963±14．58??

注：與對(duì)照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

3 討論

釩的毒性研究較多地集中在致畸，致癌，致突變作用方面。相比之下，對(duì)釩的神經(jīng)毒性研究開(kāi)展得相對(duì)有限和缺乏。越來(lái)越多的研究表明，釩具有神經(jīng)毒性效應(yīng)[12,13]，釩甚至可以直接進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致明顯的神經(jīng)毒性，例如神經(jīng)衰弱、不安、震顫、狂躁癥、抑郁癥等[6]。近來(lái)，研究還發(fā)現(xiàn)受到釩刺激的少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的ROS而受損[14]，少突膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)元髓鞘的重要組成部分，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于神經(jīng)元發(fā)揮生理功能也是不可或缺。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的固有免疫細(xì)胞，它在神經(jīng)元的生存和整個(gè)生命活動(dòng)中起著十分重要的作用[7]。而關(guān)于釩對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的相關(guān)作用目前尚未見(jiàn)任何報(bào)道。

遷移是小膠質(zhì)細(xì)胞應(yīng)對(duì)炎癥刺激的一個(gè)重要的功能，ERK磷酸化在小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移中發(fā)揮關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，偏釩酸鈉誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞突起長(zhǎng)度縮短、變圓，伴隨著遷移能力的增強(qiáng)，其特異性標(biāo)志物Iba1蛋白表達(dá)也明顯增加。而Iba1蛋白屬EF手性蛋白，是小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記物，因腦組織巨噬細(xì)胞含量極少，檢測(cè)Iba1可視為特異性檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞。隨著小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，Iba1的表達(dá)顯著增加。這些指標(biāo)表明偏釩酸鈉誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化，而激活的小膠質(zhì)細(xì)胞是介導(dǎo)中樞炎癥反應(yīng)主要的細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥是一把雙刃劍：精密調(diào)控下的神經(jīng)炎癥反應(yīng)啟動(dòng)后可以發(fā)揮吞噬和修復(fù)的作用，最終恢復(fù)組織內(nèi)環(huán)境的平衡[16,17]；而過(guò)度的炎癥反應(yīng)使得小膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)多種細(xì)胞表面受體，釋放多種細(xì)胞因子，如炎癥因子TNF-α、IL-1β、NO和活性氧類物質(zhì)等，這些炎癥介質(zhì)不但對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性，還通過(guò)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)使得小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生更多的毒性因子，從而加劇神經(jīng)毒性作用。而本研究發(fā)現(xiàn)，在偏釩酸鈉作用下，小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)大量的炎性因子如iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β，并隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，iNOS主要存在于小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，過(guò)度激活的小膠質(zhì)細(xì)胞生成大量的iNOS，進(jìn)而導(dǎo)致高濃度的NO的生成，高濃度的NO能夠抑制線粒體呼吸功能和糖酵解、抑制DNA合成、損害DNA結(jié)構(gòu)、與超氧陰離子自由基反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝基，產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用[18]。COX-2為誘導(dǎo)型酶，正常生理狀態(tài)下不表達(dá)，在受到炎癥刺激時(shí)誘發(fā)性的高表達(dá)。COX-2除了本身具有一定的促炎作用之外，與iNOS之間存在“交互感應(yīng)”。COX-2是NO合成的上游關(guān)鍵酶分子，而在炎性狀態(tài)下，NO能夠通過(guò)NO/cGMP通路上調(diào)COX-2的表達(dá)。TNF-α是小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)釋放的主要的炎性細(xì)胞因子，在神經(jīng)毒性中發(fā)揮重要作用。已有研究表明，TNF-α可激活小膠質(zhì)細(xì)胞上的TNF-α 受體從而啟動(dòng)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致其它促炎因子如iNOS、COX-2等的合成，最終導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷、變性甚至死亡[19]。此外TNF-α可促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和黏附分子，促進(jìn)炎癥因子如IL-1β、IL-6的產(chǎn)生，導(dǎo)致炎癥的惡性循環(huán)[20]。IL-1β是中樞炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵因子，其不僅可以通過(guò)NF-κB途徑進(jìn)一步促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，還具有自分泌作用，進(jìn)而通過(guò)炎癥因子的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，加重炎癥損傷，促進(jìn)神經(jīng)毒性作用。這些炎性因子存在著一定程度的相互作用機(jī)制，共同促進(jìn)炎癥的發(fā)展。本研究顯示小膠質(zhì)細(xì)胞能夠被偏釩酸鈉激活，表達(dá)及高分泌iNOS、COX-2、TNF-α和IL-1β。

綜上所述，釩暴露可在體外激活原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥因子的大量表達(dá)，并顯著促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，為進(jìn)一步深入研究偏釩酸鈉的神經(jīng)毒性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

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Exposuretovanadiumpromotesprimaryculturedratmicroglialinflammationandmigration

YU Xiao-wei， HU Chu-yuan， XIONG Zhi-jun

(Hunan Prevention and Treatment Institute for Occupational Diseases, Changsha 410003, China)

ObjectiveTo observe the changes of rat microglial inflammation and migration after exposure to sodium metavanadate(NaVO3·2H2O), and to analyze the possible mechanisms of vanadium neurotoxicity.MethodsPrimary cultured rat microglial cells were incubated with NaVO3·2H2O. Morphological changes and the Iba1 expression of microglia were tested by immunofluorescence assay. iNOS, Cox-2, ERK and p-ERK protein expressions were determined by western blotting. The levels of TNF-α and IL-1β in the culture medium were tested by enzyme-linked immunosorbent assay. The migration of microglia was tested by immunofluorescence staining using wound-healing assay.ResultsMicroglia changed from resting state with ramous shape to round shape in activated state after NaVO3·2H2O exposure, and the expression of Iba1 increased obviously. The protein expressions of iNOS and COX-2 increased significantly compared with the control. The levels of TNF-α and IL-1β were also increased significantly. NaVO3·2H2O promotes the migration of microglia through ERK pathway.ConclusionsExposure to NaVO3·2H2O promotes primary cultured rat microglial inflammation and migration. These results suggest that the inflammatory reaction of microglia may be one of the possible mechanisms of neurotoxicity caused by vanadium exposure.

Sodium metavanadate; Microglia; Inflammatory reaction; Migration

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0055-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.011

2017-02-18

湖南省衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)科研基金(B2015-318)。

余曉巍(1984-)，男，醫(yī)學(xué)博士，主管藥師，研究方向：毒理學(xué)研究。E-mail: yuxw0714@163.com