1α,25(OH)2D3對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素表達(dá)的影響

牛國(guó)棟，李思維，劉忠軍，宋純理，冷慧杰

(北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京 100191)

研究報(bào)告

1α,25(OH)2D3對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素表達(dá)的影響

牛國(guó)棟，李思維，劉忠軍，宋純理，冷慧杰*

(北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科，北京 100191)

目的在細(xì)胞水平，探討1α,25(OH)2D3對(duì)軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素合成和分泌的影響。方法使用炎性因子TNF-α對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行炎癥干預(yù)，分別添加不同劑量1α,25(OH)2D3至正常及炎癥狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞，使用ELISA及Western Blot方法分別檢測(cè)細(xì)胞上清中和細(xì)胞內(nèi)潤(rùn)滑素分泌表達(dá)的變化，從而評(píng)估1α,25(OH)2D3對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果TNF-α可以明顯降低細(xì)胞活性，以及細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞上清液中潤(rùn)滑素的表達(dá)分泌。1α,25(OH)2D3可以升高正常軟骨細(xì)胞以及炎癥狀態(tài)下軟骨細(xì)胞的活性，但是不能調(diào)節(jié)正常軟骨細(xì)胞上清和胞內(nèi)潤(rùn)滑素的分泌和表達(dá)。對(duì)于炎癥狀態(tài)的軟骨細(xì)胞，1α,25(OH)2D3可以明顯提高潤(rùn)滑素在細(xì)胞上清及細(xì)胞內(nèi)的分泌表達(dá)，并有一定劑量依賴性。結(jié)論1α,25(OH)2D3能夠促進(jìn)炎癥狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素的表達(dá)分泌，從而更好的保護(hù)軟骨表面。

1α,25(OH)2D3；潤(rùn)滑素；軟骨細(xì)胞；關(guān)節(jié)炎

骨性關(guān)節(jié)炎是常見(jiàn)多發(fā)病，因其病程長(zhǎng)，且致病因素復(fù)雜，包括遺傳因素，年齡因素，創(chuàng)傷后力學(xué)因素等，從某種意義來(lái)說(shuō)，也是疑難病[1-3]。其中關(guān)節(jié)損傷導(dǎo)致的關(guān)節(jié)不穩(wěn)定從而造成關(guān)節(jié)軟骨表面過(guò)度的摩擦負(fù)荷，是軟骨損傷的重要原因。關(guān)節(jié)軟骨作為一種非常復(fù)雜的摩擦學(xué)系統(tǒng)，可在關(guān)節(jié)的各種運(yùn)動(dòng)情況下提供極低的摩擦，從而防止關(guān)節(jié)軟骨的磨損[4]。關(guān)節(jié)的最佳功能狀態(tài)與關(guān)節(jié)的低摩擦系數(shù)環(huán)境的維持是分不開的[5]。

關(guān)節(jié)腔中充填著軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞分泌的關(guān)節(jié)滑液。在對(duì)關(guān)節(jié)軟骨表層的保護(hù)中，關(guān)節(jié)腔中的滑液起著很重要的作用。關(guān)節(jié)滑液中的主要潤(rùn)滑成分包括透明質(zhì)酸、潤(rùn)滑素以及表面活性磷脂。透明質(zhì)酸作為滑液的主要成分(3.5mg/dL)，早已引起廣泛關(guān)注，而潤(rùn)滑素是近年才引起了學(xué)者們的關(guān)注。最近的研究表明，透明質(zhì)酸、潤(rùn)滑素和表面活性磷脂三者必須協(xié)同起潤(rùn)滑作用、缺一不可[6]。潤(rùn)滑素作為關(guān)節(jié)軟骨表面邊界潤(rùn)滑的最重要蛋白，主要由關(guān)節(jié)軟骨最表面的軟骨細(xì)胞和關(guān)節(jié)囊內(nèi)表面的滑膜細(xì)胞所分泌，作為關(guān)節(jié)軟骨表面的邊界潤(rùn)滑劑和細(xì)胞保護(hù)劑，在維持關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)與功能上起著重要的作用[7]。潤(rùn)滑素不僅在邊界潤(rùn)滑中發(fā)揮著重要的物理性保護(hù)作用，還具有抗炎癥，抗滑膜組織增生等生物性保護(hù)作用[8]。已經(jīng)有研究建議將潤(rùn)滑素作為治療骨性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)重要策略[9]。

維生素D(VD)是一種類激素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在人體中發(fā)揮的作用非常復(fù)雜，是目前的研究熱點(diǎn)[10]。人們對(duì)于VD對(duì)于骨骼的重要生理作用已經(jīng)非常明確，其缺乏會(huì)導(dǎo)致多種骨骼疾病，如佝僂病、骨質(zhì)疏松、軟骨病等[11, 12]。但VD水平與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系尚存爭(zhēng)議[13-16]。很多學(xué)者都在此領(lǐng)域進(jìn)行探索。首先，已經(jīng)有研究證實(shí)了軟骨細(xì)胞中VD受體的表達(dá)[19]。并且，近來(lái)很多研究結(jié)果肯定了VD對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的保護(hù)作用[15, 17, 18]。VD對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨的具體保護(hù)作用機(jī)制可能并不單一。目前文獻(xiàn)中還沒(méi)有研究探討VD對(duì)潤(rùn)滑素的調(diào)節(jié)作用，而這對(duì)更全面認(rèn)識(shí)VD在關(guān)節(jié)生理代謝中所起的作用有重要意義。我們的前期實(shí)驗(yàn)研究表明，VD可以通過(guò)TGF-β1調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨Ⅱ型膠原的表達(dá)和降解[20]。而有實(shí)驗(yàn)證明，TGF-β在潤(rùn)滑素表達(dá)分泌的過(guò)程中起著非常重要的作用[5, 21, 22]。因此我們假設(shè)維生素D可能可以通過(guò)調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨潤(rùn)滑素的分泌來(lái)保護(hù)軟骨。本研究在細(xì)胞水平上探索維生素D是否可以促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素的表達(dá)，進(jìn)一步理解維生素D保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的軟骨細(xì)胞取自5只出生后24 h內(nèi)的SPF級(jí)Sprague-Dawley雄性大鼠，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SYXK(京)2016-0041]。

1.2試劑

75%乙醇(北京化工廠)；1α,25(OH)2D3(Selleck，美國(guó))；雙抗(Gibco，美國(guó))；PBS(Hyclone，中國(guó))；胎牛血清(Gibco，美國(guó))；DMEM低糖培養(yǎng)基(Hyclone，中國(guó))；Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國(guó))；甲苯胺藍(lán)試劑(索萊寶公司，中國(guó))；4%多聚甲醛(索萊寶公司，中國(guó))；TritonX-100試劑(Sigma，美國(guó))；5%BSA試劑(中杉金橋公司，中國(guó))；CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)；Ⅱ型膠原抗體(Biosis，美國(guó))；Lubricin Elisa試劑盒(HCB，加拿大)；酶標(biāo)儀(Thermo，美國(guó))；抗Lubricin抗體(Santa Cruz，美國(guó))；抗GAPDH抗體(谷歌生物，中國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)分組

本研究將軟骨細(xì)胞分為六組，進(jìn)行組間比較。分組具體包括無(wú)任何干預(yù)的對(duì)照組，正常低VD組，正常高VD組，誘導(dǎo)組，誘導(dǎo)低VD組和誘導(dǎo)高VD組，誘導(dǎo)低VD組和誘導(dǎo)高VD組均為TNF-α和VD同時(shí)給藥。每一組軟骨細(xì)胞處理?xiàng)l件見(jiàn)表1。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)與鑒定

使用冰凍致死法處理新生的SD大鼠，并使用75%酒精浸泡5 min消毒。從新生大鼠關(guān)節(jié)中獲取關(guān)節(jié)軟骨組織塊，對(duì)軟骨組織塊處理并分離軟骨細(xì)胞，對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并利用甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原染色對(duì)進(jìn)行軟骨細(xì)胞鑒定。具體方法細(xì)節(jié)請(qǐng)參考我們先前的研究[23]。因軟骨細(xì)胞過(guò)度傳代會(huì)發(fā)生細(xì)胞表型改變，本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為2～3代軟骨細(xì)胞。

1.4.2 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性測(cè)定

對(duì)各組將軟骨細(xì)胞進(jìn)行活性檢測(cè)時(shí)，以2.5×104的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(每孔100 μL)，使細(xì)胞貼壁穩(wěn)定。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，每孔加入20 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)3 h。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各組細(xì)胞的吸光度值，來(lái)反映活細(xì)胞數(shù)量。

1.4.3 軟骨細(xì)胞上清液中潤(rùn)滑素含量的檢測(cè)

檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞上清液中潤(rùn)滑素表達(dá)時(shí)，以每孔5×104的密度將軟骨細(xì)胞接種于24孔板中，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后收取24孔板中培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞上清液，4℃離心機(jī)1000 r/min離心20 min，抽取上清，檢測(cè)各組潤(rùn)滑素的表達(dá)。

1.4.5 軟骨細(xì)胞內(nèi)潤(rùn)滑素合成表達(dá)的檢測(cè)

檢測(cè)各組軟骨細(xì)胞內(nèi)潤(rùn)滑素合成時(shí)，將軟骨細(xì)胞以5×104密度接種于24孔板，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，制備用于蛋白免疫印跡檢測(cè)的蛋白樣品。制作6%分離膠、5%濃縮膠，取30 μg樣品蛋白上樣，以90 V恒壓電泳，樣品進(jìn)入分離膠后140 V恒壓電泳，溴酚藍(lán)抵達(dá)分離膠底部時(shí)停止電泳。以240 mA 4℃下電轉(zhuǎn)膜120 min。取出硝酸纖維素膜，于5%BSA/TBST封閉液中室溫封閉2 h，孵育Lubricin或GAPDH一抗，于搖床上4℃過(guò)夜。室溫TBST洗膜10 min，重復(fù)3次，添加相應(yīng)二抗，搖床上室溫孵育1 h。室溫TBST洗膜10 min，重復(fù)3次，雙紅外激光掃描成像系統(tǒng)進(jìn)行熒光顯色分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 軟骨細(xì)胞研究分組一覽表

注：A.光鏡下軟骨細(xì)胞；B.甲苯胺藍(lán)染色；C.Ⅱ型膠原免疫熒光染色；D.軟骨細(xì)胞維生素D受體。圖1 光鏡下及染色后細(xì)胞形態(tài)觀察Note. A．Chondrocytes without staining (×10); B. Chondrocytes stained with toluidine blue (×20); C. Type II collagen (×40); D. Vitamin D receptor in chondrocytes (×20).Fig.1 Microscopic images of chondrocytes observed using different staining

2 結(jié)果

2.1關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞及維生素D受體鑒定

通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察，所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)符合軟骨細(xì)胞特點(diǎn)(圖1A)。通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色和免疫熒光染色，分別可觀察到蛋白聚糖(圖1B)和Ⅱ型膠原表達(dá)(圖1C)。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示軟骨細(xì)胞表面表達(dá)有維生素D受體(圖1D)。

2.21α,25(OH)2D3對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用

圖2結(jié)果顯示，TNF-α誘導(dǎo)并不能降低軟骨細(xì)胞活性(P> 0.05)。相對(duì)于對(duì)照組軟骨細(xì)胞，1α,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)正常軟骨細(xì)胞活性有促進(jìn)作用，但正常低VD組和正常高VD組差異無(wú)顯著性。對(duì)于TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞，誘導(dǎo)低VD組和誘導(dǎo)高VD組均提高了誘導(dǎo)后軟骨細(xì)胞活性，但兩組之間差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。

2.31α,25(OH)2D3對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞上清中潤(rùn)滑素分泌的影響

圖3結(jié)果顯示，1α,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)正常軟骨細(xì)胞(無(wú)誘導(dǎo))潤(rùn)滑素表達(dá)差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。TNF-α誘導(dǎo)后，軟骨細(xì)胞(誘導(dǎo)組)上清中潤(rùn)滑素表達(dá)明顯降低(相對(duì)于對(duì)照組，P< 0.05)。1α,25(OH)2D3進(jìn)一步干預(yù)可顯著提高軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素的細(xì)胞外分泌(P< 0.05)。并且誘導(dǎo)低VD組和誘導(dǎo)高VD組軟骨細(xì)胞上清中潤(rùn)滑素表達(dá)差異有顯著性(P< 0.05)。

注：A. TNF-α誘導(dǎo)對(duì)正常軟骨細(xì)胞活性的影響；B. 1α,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)正常軟骨細(xì)胞活性的影響；C. 1α,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活性的影響。1.對(duì)照組；2.誘導(dǎo)組；3.正常低VD組；4.正常高VD組；5.誘導(dǎo)低VD組；6.誘導(dǎo)高VD組。 *表示P < 0.05，NS表示P > 0.05。圖2 CCK-8測(cè)定的各組軟骨細(xì)胞活性比較Note. A. Effects of TNF-α stimulation; B. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the normal chondrocytes; C. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the chondrocytes stimulated by TNF-α. 1.Control group; 2.TNF-α stimulated group; 3.Normal low VD group; 4.Normal high VD group; 5.Stimulated low VD group; 6.Stimulated high VD group.* indicates P < 0.05，NS indicates P> 0.05. Fig.2 Comparison of activities of chondrocytes from all the groups by CCK-8

注：A.TNF-α誘導(dǎo)對(duì)正常軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素分泌的影響；B. 1α,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)正常軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素分泌的影響；C. 1α,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素分泌的影響。1.對(duì)照組；2.誘導(dǎo)組； 3.正常低VD組；4.正常高VD組；5.誘導(dǎo)低VD組；6.誘導(dǎo)高VD組。*表示P < 0.05，NS表示P > 0.05。圖3 各組軟骨細(xì)胞上清潤(rùn)滑素表達(dá)比較Note. A. Effects of TNF-α stimulation; B. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the normal chondrocytes; C. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the chondrocytes stimulated by TNF-α. 1.Control group; 2.TNF-α stimulated group; 3.Normal low VD group; 4.Normal high VD group; 5.Stimulated low VD group; 6.Stimulated high VD group.* indicates P<0.05，NS indicates P>0.05. Fig.3 Expression of lubricin in the supernatant of cultured chondrocytes

2.41α,25(OH)2D3對(duì)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞胞內(nèi)潤(rùn)滑素合成的影響

圖4和圖5結(jié)果表明，1α,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)無(wú)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素表達(dá)差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。TNF-α誘導(dǎo)后，軟骨細(xì)胞(誘導(dǎo)組)中潤(rùn)滑素表達(dá)降低(相對(duì)于對(duì)照組，P< 0.05)。1α,25(OH)2D3進(jìn)一步干預(yù)，誘導(dǎo)低VD組和誘導(dǎo)高VD組均顯著上調(diào)了軟骨細(xì)胞內(nèi)潤(rùn)滑素的分泌(P< 0.05)，且誘導(dǎo)高VD組分泌的潤(rùn)滑素量顯著高于誘導(dǎo)低VD組(P<0.05)。

注：1.對(duì)照組；2.誘導(dǎo)組；3.正常低VD組；4.正常高VD組；5.誘導(dǎo)低VD組；6.誘導(dǎo)高VD組。圖4 軟骨細(xì)胞中潤(rùn)滑素蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果Note.1.Control group; 2.TNF-α stimulated group; 3.Normal low VD group; 4.Normal high VD group; 5.Stimulated low VD group; 6.Stimulated high VD group.Fig.4 Expression of lubricin in chondrocytes detected by Western blot

注：A. TNF-α誘導(dǎo)對(duì)正常軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素表達(dá)的影響；B. 1α,25(OH)2D3干預(yù)對(duì)正常軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素表達(dá)的影響；C. 1α,25(OH)2D3對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的影響。1.對(duì)照組；2.誘導(dǎo)組；3.正常低VD組；4.正常高VD組；5.誘導(dǎo)低VD組；6.誘導(dǎo)高VD組。*表示P < 0.05，NS表示P > 0.05。圖5 各組軟骨細(xì)胞內(nèi)潤(rùn)滑素表達(dá)的比較Note. A. Effects of TNF-α stimulation; B. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the normal chondrocytes; C. Effects of different doses of 1α,25(OH)2D3 on the chondrocytes stimulated by TNF-α. 1.Control group; 2.TNF-α stimulated group; 3.Normal low VD group; 4.Normal high VD group; 5.Stimulated low VD group; 6.Stimulated high VD group.* indicates P < 0.05，NS indicates P > 0.05.Fig.5 Expression of lubricin in the chondrocytes

3 討論

潤(rùn)滑素是關(guān)節(jié)軟骨的一種保護(hù)性蛋白，在維持關(guān)節(jié)正常生理功能中發(fā)揮著重要作用。在骨性關(guān)節(jié)炎起始與發(fā)展的過(guò)程中，關(guān)節(jié)軟骨表面的潤(rùn)滑素表達(dá)是降低的[24]。潤(rùn)滑素分泌的降低可能意味著關(guān)節(jié)軟骨表面邊界潤(rùn)滑能力的下降、關(guān)節(jié)軟骨表面摩擦系數(shù)的增高和軟骨磨損的增加。并且，關(guān)節(jié)軟骨摩擦系數(shù)的增加引起的表面物理性改變可以導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨生物性改變，即逐漸引起軟骨表面軟骨細(xì)胞的凋亡，過(guò)度分泌MMP等基質(zhì)金屬蛋白酶和炎癥因子，加速關(guān)節(jié)軟骨的降解[25, 26]。分泌的炎癥因子會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨潤(rùn)滑素的降低，形成一種惡性循環(huán)[25]。因此，潤(rùn)滑素在OA的發(fā)生發(fā)展中所起的作用不可忽視。

我們使用了炎癥因子TNF-α對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)，模擬骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生時(shí)軟骨細(xì)胞的改變。TNF-α是一種在骨性關(guān)節(jié)炎起始和發(fā)展中發(fā)揮重要作用的炎癥因子，可以明顯促進(jìn)軟骨細(xì)胞的分解代謝[27, 28]。研究結(jié)果顯示，相對(duì)于沒(méi)有TNF-α干預(yù)的正常軟骨細(xì)胞，TNF-α干預(yù)確實(shí)可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞上清中及胞質(zhì)中潤(rùn)滑素表達(dá)降低，這與Jones有關(guān)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子對(duì)潤(rùn)滑素生物調(diào)節(jié)的研究結(jié)果相似，同時(shí)與臨床觀察到的骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)潤(rùn)滑素表達(dá)下降的結(jié)果相呼應(yīng)[5]。

在臨床流行病學(xué)研究中，維生素D水平與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展關(guān)系尚不明確[29]。這可能與影響流行病學(xué)研究結(jié)果的因素錯(cuò)綜復(fù)雜有關(guān)。近來(lái)越來(lái)越多的研究結(jié)果顯示維生素D對(duì)關(guān)節(jié)軟骨退變能起到重要的抑制作用[20, 29]。本研究首先證實(shí)了大鼠軟骨細(xì)胞中維生素D受體(VDR)的表達(dá)，Tetlow在人體軟骨細(xì)胞研究中也發(fā)現(xiàn)了VDR的存在[19]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示無(wú)論是在正常狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞還是炎癥狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞，維生素D都能提高軟骨細(xì)胞的活性，說(shuō)明維生素D能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。對(duì)于TNF-α誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)與蛋白免疫印跡的結(jié)果表明，無(wú)論是胞外潤(rùn)滑素分泌水平還是在胞質(zhì)內(nèi)合成水平，1α,25(OH)2D3干預(yù)可以顯著抑制因TNF-α干預(yù)導(dǎo)致的潤(rùn)滑素表達(dá)下降。而且，隨著劑量的增加，對(duì)潤(rùn)滑素表達(dá)的影響亦增加。這說(shuō)明1α,25(OH)2D3可以升高骨性關(guān)節(jié)炎的軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素的表達(dá)，在骨性關(guān)節(jié)炎過(guò)程中，可能通過(guò)促進(jìn)潤(rùn)滑素的表達(dá)來(lái)保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨。

然而對(duì)于未經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)的正常軟骨細(xì)胞，1α,25(OH)2D3干預(yù)雖然可以提升軟骨細(xì)胞活性，但并沒(méi)有顯著升高關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素的表達(dá)水平。首先，結(jié)果說(shuō)明維生素D發(fā)揮生物反應(yīng)可能與細(xì)胞所處的狀態(tài)相關(guān)，炎癥狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞和正常狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞分泌潤(rùn)滑素對(duì)維生素D的敏感度有顯著差異。Li等[20]在關(guān)于1α,25(OH)2D3對(duì)軟骨細(xì)胞CTXII和TGF-β研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。在正常生理狀態(tài)下的關(guān)節(jié)軟骨，1α,25(OH)2D3干預(yù)不能增加其潤(rùn)滑素的表達(dá)，可能不能通過(guò)該途徑來(lái)預(yù)防骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生；而一旦處于骨性關(guān)節(jié)炎狀態(tài)，1α,25(OH)2D3可促進(jìn)炎癥狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素的表達(dá)，可能成為維生素D保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的途徑之一。另外，TNF-α誘導(dǎo)可以降低軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素的表達(dá)，但對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有顯著影響；1α,25(OH)2D3干預(yù)正常軟骨細(xì)胞可以增加細(xì)胞活性，但對(duì)軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素分泌沒(méi)有顯著影響；不同劑量的1α,25(OH)2D3干預(yù)TNF-α誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞，可以顯著影響潤(rùn)滑素的表達(dá)，但對(duì)細(xì)胞活性沒(méi)有顯著影響。這些結(jié)果提示潤(rùn)滑素的分泌與軟骨細(xì)胞活性沒(méi)有必然聯(lián)系，可能跟細(xì)胞炎癥與否狀態(tài)相關(guān)，這個(gè)問(wèn)題尚待進(jìn)一步研究。

骨性關(guān)節(jié)炎的多發(fā)性和復(fù)雜性長(zhǎng)期困擾著患者和醫(yī)療工作者。盡管維生素D對(duì)關(guān)節(jié)作用的機(jī)制還不十分明確，但其對(duì)關(guān)節(jié)積極的保護(hù)使其成為一個(gè)極具前景的選擇。并且，目前已有研究證明人重組潤(rùn)滑素可以改善關(guān)節(jié)炎癥狀，但距其應(yīng)用于臨床還有一段距離。維生素D可以促進(jìn)炎癥狀態(tài)下的軟骨細(xì)胞潤(rùn)滑素分泌表達(dá)這一作用，提供了一個(gè)新的思路，值得我們進(jìn)一步探討。

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1α,25(OH)2D3regulatesexpressionoflubricinofchondrocytesinratarticularcartilage

NIU Guo-dong, LI Si-wei, LIU Zhong-jun, SONG Chun-li, LENG Hui-jie*

(Department of Orthopedics, Peking University Third Hospital, Beijing 100191,China)

ObjectiveTo investigate the effects of vitamin D on synthesis and secretion of lubricin in chondrocytes at the cellular level.MethodsRat articular chondrocytes were stimulated by TNF-α. Normal and inflammatory chondrocytes were treated by different doses of vitamin D respectively. ELISA and Western Blot were used to detect the secretion of lubricin in the supernatant and the synthesis level in the cells.ResultsTNF-α significantly reduced the activity of both normal chondrocytes and chondrocytes in inflammatory state. TNF-α also significantly reduced the expression of lubricin in the cells and supernatant.1α,25(OH)2D3 increased the activity of both normal chondrocytes and chondrocytes in inflammatory state. 1α,25(OH)2D3 significantly elevated the secretion and expression of supernatant and intracellular lubricin only in chondrocytes stimulated by TNF-α in a dose-dependent manner, but not in normal chondrocytes.ConclusionsVitamin D can promote the secretion and expression of lubricin in inflammatory state chondrocytes, which may act as one of the mechanisms of vitamin D protecting the cartilage surface in osteoarthritis.

Vitamin D; Lubricin; Chondrocytes; Osteoarthritis

R-33

A

1671-7856(2017)010-0028-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.010.006

2017-04-20

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào)：11472017)。

牛國(guó)棟(1985 - )，男，碩士，主要從事骨性關(guān)節(jié)炎方面的研究。E-mail: tiankun23@163.com

冷慧杰(1975 - )，男，博士，副研究員，主要從事骨與關(guān)節(jié)力學(xué)生物學(xué)研究。E-mail: lenghj@bjmu.edu.cn