流式細胞術(shù)分析PMA誘導(dǎo)THP-1分化為巨噬細胞的表型特征

彭卓穎，李 想，叢 喆，薛 婧

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京 100021)

研究報告

流式細胞術(shù)分析PMA誘導(dǎo)THP-1分化為巨噬細胞的表型特征

彭卓穎，李 想，叢 喆*，薛 婧*

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京 100021)

目的用流式細胞術(shù)明確單獨使用PMA誘導(dǎo)THP-1細胞分化而來的巨噬細胞的分化情況。方法首先用PMA刺激THP-1細胞分化為巨噬細胞，再分別使用LPS、IFN-γ和IL-6將細胞誘導(dǎo)為M1型巨噬細胞，用IL-4、IL-13和IL-6將細胞誘導(dǎo)為M2型巨噬細胞。顯微鏡下觀察三種細胞的形態(tài)學(xué)改變，并用流式細胞術(shù)檢測各細胞主要CD分子表達的差異。結(jié)果當THP-1分化為巨噬細胞后變?yōu)橘N壁生長，細胞形態(tài)呈較規(guī)則的圓形或橢圓形；M1和M2細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞突起較明顯，細胞顆粒度較大。巨噬細胞表面與抗原提呈功能相關(guān)的CD分子的表達均較低，大部分呈陰性；而M1和M2細胞表面這些CD分子的表達均較高。結(jié)論單獨使用PMA刺激THP-1細胞所分化而來的巨噬細胞抗原提呈能力較弱，基本處于靜息狀態(tài)。

THP-1；巨噬細胞；佛波酯；流式細胞術(shù)

巨噬細胞(macrophage，Mφ)是一類由血液中單核細胞分化而來的固有免疫細胞，在機體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[1]。但是由于細胞數(shù)量少，分離過程較繁瑣[2,3]，因此多用佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)誘導(dǎo)THP-1單核細胞系分化而成的THP-1-Mφ作為研究巨噬細胞功能的體外細胞模型[4]。雖然目前THP-1-Mφ細胞是比較通用的巨噬細胞模型，但是此細胞的分化特征尚不明確，這將影響對巨噬細胞相關(guān)功能實驗的分析。本文主要利用流式細胞術(shù)對分化所得巨噬細胞的特征進行分析，首先用不同細胞因子組合對THP-1細胞進行刺激，分別誘導(dǎo)出Mφ、M1和M2三種細胞，比較以上細胞的形態(tài)學(xué)變化，并用流式檢測各細胞主要CD分子表達的差異，以期明確THP-1-Mφ細胞的分化情況。

1 材料和方法

1.1細胞

THP-1細胞，外周血的人單核細胞系，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)所細胞中心，用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2孵箱中進行培養(yǎng)。

1.2細胞因子

Recombinant Human IFN-γ(300-02)、Recombinant Human IL-13(200-13)和Recombinant Human IL-4(200-04)購自Peprotech公司，Recombinant Human IL-6 Protein(206-IL)購自R&D公司，PMA(P1585)和LPS(L4391)購自Sigma公司。

1.3流式抗體

流式抗體PE anti-human CD16 Antibody(3G8)、PE anti-human CD68 Antibody(Y1/82A)、FITC anti-human CD80 Antibody(2D10)、APC anti-human CD83 Antibody(HB15)、PE anti-human CD86 Antibody(IT2.2)、PE anti-human CD1a Antibody(HI149)、APC anti-human CD11c Antibody(3.9)均購自Biolegend公司；流式抗體PE Mouse Anti-Human CD14(M5E2)、PerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD209(DCN46)、APC Mouse Anti-Human HLA-DR(G46-6)、FITC Mouse Anti-Human CD163(GHI/61)、PE Mouse Anti-Human CD206(19.2)均購自BD公司。

1.4實驗方法

1.4.1 PMA和細胞因子誘導(dǎo)THP-1 細胞定向分化[4,5]

取9×106個正常THP-1于T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入終濃度為50 ng/mL的PMA。2 d后細胞進行換液處理，一部分細胞進行流式檢測；一部分細胞中加入終濃度均為20 ng/mL的LPS、IFN-γ和IL-6，使細胞向THP-1-M1方向分化；另一部分細胞中加入終濃度均為20 ng/mL的IL-4、IL-13和IL-6，誘導(dǎo)細胞向THP-1-M2方向分化。THP-1-M1和THP-1-M2細胞于第5天進行流式檢測。

1.4.2 胞外流式染色

用胰酶將培養(yǎng)瓶內(nèi)的貼壁細胞消化下來，PBS緩沖液洗2次(4℃ 1500 r/min離心3 min)，用PBS將細胞濃度調(diào)整為每毫升1×107個，混勻后在每個流式管中加入100 μL細胞懸液，向每管內(nèi)加入相應(yīng)流式抗體，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min，2 mL PBS緩沖液洗2次，300 μL PBS重懸細胞，過濾后上機。

1.4.3 胞內(nèi)流式染色[6]

同上將細胞加入流式管內(nèi)，向每管中加入200 μL IC fixation buffer，4℃避光孵育20 min，隨后用2 mL破膜液洗2次，100 μL破膜液重懸細胞，向每管中加入對應(yīng)流式抗體，混勻后4℃避光孵育30 min，破膜液洗2次，PBS緩沖液洗1次，將細胞懸液過濾后上機。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1THP-1分化為不同細胞后的形態(tài)學(xué)改變

THP-1細胞形態(tài)飽滿、大小均一、折光性較好，為懸浮生長單個細胞(圖1A)；PMA刺激2 d后，誘導(dǎo)分化的THP-1-Mφ細胞全部貼壁，大部分細胞仍呈圓形或橢圓形，聚團生長較明顯(圖1B)；繼續(xù)向其中加入細胞因子LPS、IFN-γ和IL-6，誘導(dǎo)細胞定向分化為THP-1-M1細胞后，形態(tài)更為多樣，部分細胞呈長梭形，且細胞膜上的突起十分明顯(圖1C)；而繼續(xù)加入IL-4、IL-13和IL-6誘導(dǎo)分化出的THP-1-M2細胞，形態(tài)與THP-1-M1細胞較相似，但長梭形細胞相對較少(圖1D)。

注：“……”同型對照；“-”CD14和CD68；A：使用流式細胞術(shù)檢測CD分子的表達情況；B：利用統(tǒng)計圖比較不同細胞上CD分子表達情況的差異。與THP-1-Mφ比較，* P< 0.05。圖2 CD14和CD68分子在不同巨噬細胞上表達的差異Note: “……” Isotype control; “-”CD14 and CD68；A:The expression of CD molecules were detected by flow cytometry；B:The differences of CD molecules on different cells were analyzed by histogram.Compared with the THP-1-Mφ, * P< 0.05.Fig.2 Expression of CD14 and CD68 in different macrophage subsets

2.2單核巨噬細胞特異性分子CD14、CD68在各細胞中的表達

THP-1、THP-1-M1和THP-1-M2細胞表面均可高表達CD14分子，表達量分別為(85.8±6.93)%、(89.25±8.42)%和(82.20±8.62)%；而PMA刺激分化的THP-1-Mφ細胞表面CD14的表達僅為(43.1±2.95)%。與之相反，CD68分子在THP-1與THP-1-Mφ細胞內(nèi)均高表達，當繼續(xù)分化為THP-1-M1后CD68的表達也并未發(fā)生明顯變化(P=0.7709)；而THP-1-M2細胞內(nèi)CD68的表達則出現(xiàn)了較明顯的降低(P=0.0129)，表達量為(53.45±1.62)%(圖2)。

注：“……”同型對照；“-”CD16,CD80和CD86；A：使用流式細胞術(shù)檢測CD分子的表達情況；B：利用統(tǒng)計圖比較不同細胞上CD分子表達情況的差異。與THP-1-Mφ比較，* P< 0.05，** P< 0.01。圖3 CD16,CD80和CD86分子在不同巨噬細胞表面表達的差異Note: “……” Isotype control；“-” CD16,CD80 and CD86；A:The expression of CD molecules were detected by flow cytometry；B:The differences of CD molecules on different cells were analyzed by histogram.Compared with the THP-1-Mφ，* P< 0.05，** P< 0.01.Fig.3 Differences in the expression of CD16,CD80 and CD86 in different macrophage subsets

2.3M1型巨噬細胞特異性分子CD16、CD80和CD86在各細胞中的表達

CD16、CD80和CD86等分子的表達是判斷M1型巨噬細胞分化情況的指標。如圖3所示，THP-1分化出的THP-1-Mφ細胞表面CD16和CD80的表達基本未發(fā)生變化，CD86分子的表達量增加到(14.59±2.98)%(P=0.0270)；當THP-1-Mφ繼續(xù)分化為THP-1-M1后，CD16分子的表達出現(xiàn)小幅度升高，而CD80和CD86的表達卻出現(xiàn)了非常明顯的上升(P值分別為0.0063和0.0082)，表達量分別達到(75.85±8.41)%和(69.65±6.43)%；分化出的THP-1-M2細胞表面CD16分子的表達有所降低，但其變化并無顯著性差異，CD80和CD86的表達情況與THP-1-M1細胞基本相同。

2.4M2型巨噬細胞特異性分子CD163、CD206和CD209在各細胞中的表達

較常用于鑒定THP-1-M2細胞分化情況的CD分子為CD163、CD206和CD209。正常THP-1、THP-1-Mφ和THP-1-M1細胞內(nèi)CD163分子的表達量均較低；CD206分子在以上三種細胞表面的表達基本為陰性；CD209在THP-1和THP-1-M1細胞表面的表達量分別為(24.10±5.37)%和(44.75±7.99)%，而在THP-1-Mφ細胞表面的表達基本呈陰性；分化成的THP-1-M2細胞可低表達CD206分子，而且CD163和CD209分子的表達均出現(xiàn)了明顯的增加，表達量分別為(64.90±0.71)%和(89.20±5.06)%(圖4)。

注： “……”同型對照；“-”CD163,CD206和CD209；A：使用流式細胞術(shù)檢測CD分子的表達情況；B：利用統(tǒng)計圖比較不同細胞上CD分子表達情況的差異。與THP-1-Mφ比較，* P< 0.05，** P< 0.01。圖4 CD163,CD206和CD209分子在不同巨噬細胞上表達的差異Note: “……” Isotype control；“-” CD163,CD206 and CD209；A:The expression of CD molecules were detected by flow cytometry；B:The differences of CD molecules on different cells were analyzed by histogram.Compared with the THP-1-Mφ，* P< 0.05，** P< 0.01.Fig.4 Differences in the expression of CD163,CD206 and CD209 in different macrophage subsets

2.5與抗原提呈功能相關(guān)的CD分子的表達情況

THP-1細胞表面CD83、CD11c和HLA-DR的表達均較高，表達量分別達到(54.75±7.84)%、(76.15±9.12)%和(94.25±2.89)%，CD1a分子的表達呈陰性。THP-1-M1和THP-1-M2細胞則高表達這幾個分子。與之相反，THP-1-Mφ細胞CD1a的表達仍為陰性，CD83分子的表達明顯降低(P=0.0498)，CD11c和HLA-DR的表達更是顯著下降，P值分別為0.0073和0.0027(圖5)。

注：“……”同型對照；“-”CD83,CD1a,CD11c和HLA-DR；A：使用流式細胞術(shù)檢測CD分子的表達情況；B：利用統(tǒng)計圖比較不同細胞上CD分子表達情況的差異。與THP-1-Mφ比較，* P< 0.05，** P< 0.01。圖5 CD83,CD1a,CD11c和HLA-DR分子在不同巨噬細胞表面表達的差異Note: “……” Isotype control；“-” CD83,CD1a,CD11c and HLA-DR；A:The expression of CD molecules were detected by flow cytometry；B:The differences of CD molecules on different cells were analyzed by histogram.Compared with the THP-1-Mφ，* P< 0.05，** P< 0.01.Fig.5 Differences in the expression of CD83,CD1a,CD11c and HLA-DR in different macrophage subsets

3 討論

巨噬細胞是一種具有可塑性和多功能性的固有免疫細胞，當體內(nèi)外微環(huán)境發(fā)生變化時，巨噬細胞可向不同亞型進行分化，其中研究較多的為M1和M2型巨噬細胞。M1細胞可分泌促炎因子，在炎癥早期發(fā)揮作用；M2細胞可分泌抑制炎癥因子，發(fā)揮組織修復(fù)作用[7,8]。而對巨噬細胞的功能性研究主要通過體外實驗進行，PMA誘導(dǎo)THP-1細胞分化成的THP-1-Mφ是最常用的細胞模型，但到目前為止并沒有明確其分化情況。THP-1-Mφ可能為單一亞型的巨噬細胞，也可能是M1和M2型巨噬細胞共存的細胞群，因此本研究對此科學(xué)問題進行了深入探究。首先利用PMA刺激THP-1單核細胞分化為THP-1-Mφ，然后在此基礎(chǔ)上繼續(xù)添加不同細胞因子，分別誘導(dǎo)出THP-1-M1和THP-1-M2細胞，最后用顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化，并用流式細胞術(shù)檢測細胞主要CD分子的表達情況。

當THP-1細胞被PMA刺激兩天后，細胞由之前的懸浮生長變?yōu)橘N壁生長，而且THP-1-Mφ細胞可高表達單核巨噬細胞特有的CD14分子和CD68分子，說明單核細胞已經(jīng)成功分化為巨噬細胞。但是此時細胞大部分呈圓形或橢圓形，并沒有形成明顯的突觸，不具備吞噬病原體的功能，故THP-1-Mφ細胞攝取抗原的能力較弱，當繼續(xù)分化為THP-1-M1和THP-1-M2后，細胞表面出現(xiàn)非常明顯的突起，此時的巨噬細胞可對病原體進行有效的吞噬。由于Mφ與M1和M2型巨噬細胞之間的形態(tài)學(xué)差異較大，而且THP-1-Mφ并不能高表達M1型巨噬細胞的特異性分子CD80和CD86，也不能高表達M2型巨噬細胞的特異性分子CD163和CD209，因此可以認為THP-1-Mφ細胞并非THP-1-M1和THP-1-M2兩種細胞的混合群，而是不同于M1和M2的一種巨噬細胞。

除各細胞的特異性分子之外，本研究還對與抗原提呈功能相關(guān)的CD分子進行了檢測，其中共刺激分子CD80、CD83和CD86可使細胞有效攝取并加工提呈抗原，為T細胞的活化提供所需的共刺激信號[9]；CD209的高表達同樣可促進巨噬細胞更好的識別抗原，激活T細胞的免疫應(yīng)答[10]；CD1a則主要負責(zé)脂類抗原的提呈[11]；而HLA-DR的表達可促進巨噬細胞的激活，其表達程度也反映了細胞提呈抗原的能力[12]。統(tǒng)計結(jié)果發(fā)現(xiàn)，THP-1-Mφ細胞表面以上分子的表達量均較低，大部分呈陰性，與體內(nèi)靜息狀態(tài)下的巨噬細胞較相似，此時細胞攝取并提呈抗原的能力較弱，無法有效的刺激T細胞活化[13]；而當THP-1-Mφ被細胞因子誘導(dǎo)分化為THP-1-M1和THP-1-M2后，以上CD分子的表達均出現(xiàn)了明顯的上升。因此可以認為THP-1-Mφ細胞為處于靜息狀態(tài)的巨噬細胞，而THP-1-M1和THP-1-M2則為被活化的具有功能性的巨噬細胞，但是以上結(jié)果并不能直接說明THP-1-Mφ即為M0細胞。

綜上所述，靜息狀態(tài)的Mφ與活化狀態(tài)的M1、M2在細胞形態(tài)和CD分子的表達方面差異較大，在實驗過程中需要根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的細胞模型。本研究在體外誘導(dǎo)實驗的基礎(chǔ)上，采用了比較分析的方法，明確了PMA刺激THP-1細胞后所得THP-1-Mφ的類型，為巨噬細胞功能性實驗的研究提供了理論依據(jù)，而且本實驗重點研究了巨噬細胞CD分子的表達情況，也為巨噬細胞的表型鑒定方法提供了新思路。

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PhenotypiccharacterizationofPMA-inducedTHP-1macrophagesanalyzedbyflowcytometry

PENG Zhuo-ying， LI Xiang， CONG Zhe*， XUE Jing*

(Comparative Medicine Center, Peking Union College(PUMC)& Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences (CAMS);Key Laboratory of Human Diseases Comparative Medicine, Ministry of Health;Key Laboratory of Human Diseases Animal Models, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Beijing Key Laboratory for Animal Models of Emerging and Remerging Infectious Diseases, Beijing 100021, China)

ObjectiveTo identify the characteristics of the subtype of PMA-induced THP-1 macrophages by flow cytometry analysis.MethodsTHP-1 monocytic cells differentiate into macrophages promoted by PMA, then induced into M1 and M2 by adding different cytokines, such as LPS,IL-6 and IFN-γ for THP-1-M1, IL-4,IL-13 and IL-6 for THP-1-M2. Morphology of cells were observed under a microscope and the expression of CD14, CD68, CD16, CD80, CD86, CD163, CD206, CD209, CD83, CD1a, CD11c, HLA-DR were detected by flow cytometry.ResultsThe macrophages stimulated by PMA became adherent; THP-1-M1 and THP-1-M2 lost their spherical morphology, appeared more irregular with many obvious projections. The expression of CD83, CD1a, CD11c, HLA-DR which had the function of antigen presenting on the surface of THP-1-Mφ were very low, and most of them were negative, but those of THP-1-M1 and THP-1-M2 were very high.ConclusionsThe macrophages differentiated from THP-1 stimulated by PMA are weak in antigen presenting function.

THP-1; Macrophage; Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA; Flow cytometry

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0010-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.003

2017-04-12

國家自然科學(xué)基金-青年科學(xué)基金項目(81301437)；科技部重大專項(2014ZX10001001-001-004，2014ZX10001001-002-006)。

彭卓穎(1992-)，女，碩士研究生，從事實驗動物病毒學(xué)研究工作。E-mail: 18810963239@163.com

薛婧(1983-)，女，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：病原生物學(xué)和免疫學(xué)。E-mail: xuejing@cnilas.org。

叢喆(1972-)，女，副主任技師，從事實驗動物病毒分子生物學(xué)和模型研究工作。E-mail: congz@cnilas.org。*共同通訊