光照脅迫下廣葉繡球菌菌絲基因差異表達(dá)的初步分析*

肖冬來(lái)，張 迪，馬 璐，王宏雨，林衍銓

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014）

光照脅迫下廣葉繡球菌菌絲基因差異表達(dá)的初步分析*

肖冬來(lái)，張 迪，馬 璐，王宏雨，林衍銓**

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014）

利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)黑暗和光照下廣葉繡球菌（Sparassis latifolia）菌絲進(jìn)行RNA-Seq分析，比較光照脅迫下的差異表達(dá)基因，并對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能分析和KEGG pathway分析。結(jié)果表明，光照脅迫下顯著性差異表達(dá)的基因328個(gè)，其中，上調(diào)、下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)分別為157個(gè)和171個(gè)。差異表達(dá)基因的GO注釋表明，生物學(xué)過(guò)程主要為細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程、單一生物過(guò)程，而分子功能主要為催化、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)子活性。KEGG pathway功能分析結(jié)果表明，差異基因主要集中在次級(jí)代謝產(chǎn)物合成、淀粉和蔗糖代謝和谷胱甘肽代謝通路中。

廣葉繡球菌；轉(zhuǎn)錄組；GO功能分析；差異表達(dá)基因

廣葉繡球菌（Sparassis latifolia Y.C.Dai&Zheng Wang）[1]，隸屬于多孔菌目（Polyporales） 繡球菌科（Sparassidacea） 繡球菌屬（Sparassis），是1種珍稀食（藥）用真菌，廣葉繡球菌中的β-葡聚糖能提高人體免疫力，具有抗癌、防癌特殊功效[2]。光照在食用菌菌絲生長(zhǎng)、原基形成和產(chǎn)量、子實(shí)體形態(tài)等[3-4]過(guò)程都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

廣葉繡球菌對(duì)光照的需求要高于其它的食用菌，適宜的光照是原基分化與子實(shí)體生長(zhǎng)發(fā)育的必要條件，不同的光質(zhì)和光量影響廣葉繡球菌菌絲生長(zhǎng)速度和原基形成率[5]。Yang等[6]克隆了1個(gè)廣葉繡球菌藍(lán)光受體基因，光照可誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，為光照誘導(dǎo)子實(shí)體發(fā)育的研究提供參考。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析了光照條件下廣葉繡球菌基因差異表達(dá)，以期進(jìn)一步為廣葉繡球菌的光響應(yīng)機(jī)制研究提供科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株和參考基因組

供試廣葉繡球菌菌株“閩繡1號(hào)”為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏。參考基因組為本單位測(cè)序完成的廣葉繡球菌菌株“閩繡1號(hào)”基因組，該數(shù)據(jù)尚未公開(kāi)。

1.2 樣品制備

利用打孔器在活化的繡球菌PDA培養(yǎng)皿上，呈圓周形選取菌齡一致，直徑約7 mm的菌塊接種至表面鋪有玻璃紙的9 cm PDA培養(yǎng)皿。25℃黑暗培養(yǎng)20 d后，將培養(yǎng)皿置于裝有LED白色光源的培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)48 h（調(diào)整透過(guò)培養(yǎng)皿蓋的光強(qiáng)度為300 lx），黑暗培養(yǎng)的菌絲為對(duì)照組。無(wú)菌玻璃棒刮取菌絲后液氮急凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 差異表達(dá)基因分析

光照組和黑暗處理組樣品送至北京安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司提取總RNA、構(gòu)建文庫(kù)，利用Illumina HiSeq平臺(tái)測(cè)序?；虮磉_(dá)量利用FPKM（fragments per kilobase per millon mapped fragments）值進(jìn)行評(píng)估。采用DEGSeq v1.18.0[7]進(jìn)行基因差異表達(dá)分析，比較光照組與黑暗組，并選取|log2Ratio|≥1和q＜0.05的基因作為差異表達(dá)基因，得到上調(diào)、下調(diào)基因個(gè)數(shù)。根據(jù)差異表達(dá)基因在每個(gè)樣品里的表達(dá)量，取以2為底的對(duì)數(shù)后，利用R軟件（v3.1.1）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分層聚類分析。

1.4 GO功能分類注釋與顯著性富集分析

根據(jù)GO數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Ontology，http://www.geneontology.org/），利用軟件Blast2GO得到差異表達(dá)基因?qū)?yīng)的GO條目。針對(duì)GO數(shù)據(jù)庫(kù)中第2層的條目，統(tǒng)計(jì)差異表達(dá)基因在該條目里的個(gè)數(shù)，并計(jì)算百分比。根據(jù)計(jì)算每個(gè)條目的基因數(shù)目，然后應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，差異表達(dá)基因顯著富集的GO條目。計(jì)算得到的p-value通過(guò)校正之后，以q＜0.05為閾值，滿足此條件的GO條目定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的GO條目。

1.5 代謝通路分析與顯著性富集分析

利用 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.kegg.jp/）分析差異基因參與的pathway，對(duì)KEGG中每個(gè)Pathway應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，找出差異表達(dá)基因顯著性富集的Pathway，計(jì)算得到的p-value通過(guò)校正之后，以q＜0.05為閾值，滿足此條件的pathway定義為在差異表達(dá)基因中顯著富集的pathway。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異基因的篩選

光照組和黑暗組共有11 029個(gè)轉(zhuǎn)錄本可定位到參考基因組（廣葉繡球菌基因組測(cè)序結(jié)果預(yù)測(cè)為12 471個(gè)基因，數(shù)據(jù)尚未公開(kāi)）。以黑暗組為對(duì)照，共篩選出差異表達(dá)基因328個(gè)，其中，上調(diào)、下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)分別為157個(gè)和171個(gè)，差異表達(dá)顯著的部分基因見(jiàn)表1。

表1 部分顯著差異表達(dá)的基因Tab.1 Some significantly differentially expressed genes

2.2 差異基因的GO功能分析

差異表達(dá)基因的GO功能分析和GO注釋富集分析見(jiàn)圖1、表2。

差異表達(dá)基因的GO功能分析顯示，在生物學(xué)過(guò)程 （biological process） 分類中，細(xì)胞過(guò)程（cellular process）、代謝過(guò)程 （metabolic process） 和單一生物過(guò)程（single-organism process）所占比例較高，分別占總差異蛋白的19.8%、21.6%和16.5%。在細(xì)胞組分分類中差異表達(dá)基因在細(xì)胞組分（cell part）、細(xì)胞器（organelle）和膜組分（membrane part）類型所占比例較高，分別占總差異蛋白的16.5%、7.3%和5.5%。在分子功能組分中，催化（catalytic）、結(jié)合（binding）和轉(zhuǎn)運(yùn)子（transporter）活性類型所占比例較高，分別占總差異蛋白的28.7%、16.2%和3.0%。

GO功能顯著性富集分析表明，顯著富集的功能有：生物學(xué)過(guò)程下的多糖分解過(guò)程（polysaccharide catabolic process）、碳水化合物代謝過(guò)程（carbohy－drate metabolic process） 和多糖代謝過(guò)程（polysaccharide metabolic process）；分子功能下的水解酶活性（hydrolase activity）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、催化活性 （catalytic activity）、β-甘露糖苷酶活性（beta-mannosidase activity）、單加氧酶活性（monooxygenase activity） 和半乳糖苷酶的活性（galactosidase activity）；細(xì)胞組分下的胞外區(qū)域 （extracellular region）。

圖1 差異表達(dá)基因的GO功能分析Fig.1 Functional annotation of differentially expressed genes according to GO analysis

表2 GO注釋富集分析Tab.2 GO enrichment analysis

2.3 差異基因的KEGG pathway分析

對(duì)差異基因進(jìn)行pathway分析發(fā)現(xiàn)，差異基因可注釋到30條pathway上，差異基因數(shù)目較多的pathway分別為次級(jí)代謝產(chǎn)物合成（biosynthesis of secondary metabolite，涉及10個(gè)差異基因）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism，涉及4個(gè)差異基因）、谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism，涉及3個(gè)差異基因）、半胱氨酸和蛋氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism，涉及3個(gè)差異基因）。經(jīng)KEGG pathway富集分析顯示，未檢測(cè)到顯著富集的pathway。

3 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，得到廣葉繡球菌在光照和黑暗培養(yǎng)下差異基因328個(gè)，這些基因可能參與了廣葉繡球菌對(duì)光照的響應(yīng)調(diào)控。廣葉繡球菌的發(fā)育過(guò)程是一個(gè)多因素調(diào)控的生命過(guò)程，除了自身的遺傳特性作為其調(diào)控發(fā)育的基礎(chǔ)外，外界栽培條件如栽培基質(zhì)、溫度、光照等均可影響其生長(zhǎng)發(fā)育。目前，關(guān)于光照調(diào)控廣葉繡球菌發(fā)育的分子機(jī)制研究還很少[6]，本研究將所有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO注釋和功能聚類分析，在顯著富集的生物學(xué)功能分類中，多糖分解、碳水化合物代謝和多糖代謝涉及的基因下調(diào)數(shù)量大于上調(diào)數(shù)量，推測(cè)光照可能影響了繡球菌菌絲碳水化合物降解能力。胞外酶活性在一定程度上可反映菌株生長(zhǎng)的快慢和對(duì)基質(zhì)的利用率[8]。應(yīng)正河等[5]的研究表明繡球菌菌絲在黑暗條件下生長(zhǎng)速度最快，顯著高于不同光質(zhì)下菌絲的生長(zhǎng)速度。

谷胱甘肽、蛋氨酸和甲硫氨酸參與了多種環(huán)境脅迫的響應(yīng)，同時(shí)蛋氨酸和甲硫氨酸對(duì)細(xì)胞的分化和功能的產(chǎn)生有著重要的影響[9-11]。KEGG代謝通路分析結(jié)果顯示谷胱甘肽代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路中均含有3個(gè)關(guān)鍵差異基因。其中2個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶在光照誘導(dǎo)下表現(xiàn)上調(diào)，而半胱氨酸和蛋氨酸代謝通路中編碼3個(gè)關(guān)鍵基因腺苷高半胱氨酸酶（adenosylhomocysteinase）、s-腺苷甲硫氨酸合成酶（s-adenosylmethionine synthetase）、氨基環(huán)丙基甲酸甲酯氧化酶（aminocyclopropanecarboxylate oxidase） 均表現(xiàn)下調(diào)，相關(guān)差異基因在光響應(yīng)中的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，初步分析了光照誘導(dǎo)下廣葉繡球菌菌絲基因表達(dá)變化情況、差異表達(dá)基因的GO分類和代謝過(guò)程，研究結(jié)果為進(jìn)一步分析廣葉繡球菌光響應(yīng)的分子機(jī)制，探討差異基因與菌絲發(fā)育的調(diào)控關(guān)系提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

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英國(guó)：橡樹(shù)下發(fā)現(xiàn)“黑色鉆石”之稱的珍稀黑松露

前不久，英國(guó)德文郡史蒂夫先生無(wú)意在一棵橡樹(shù)下挖到了10多顆有“廚師的黃金”之稱的珍稀黑松露。據(jù)了解，黑松露是1種生長(zhǎng)于地下的野生食用真菌，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、18種氨基酸以及人體必需微量元素，具有極高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值。黑松露每年在全世界產(chǎn)量非常稀少，因此價(jià)格相當(dāng)昂貴，堪比黃金。在中國(guó)西南藏族、彝族等少數(shù)民族地區(qū)，黑松露也被當(dāng)?shù)厝俗鳛樵鰪?qiáng)體力、治療疾病的“黑色鉆石”。

在國(guó)外，黑松露常見(jiàn)于在法國(guó)、意大利和西班牙的森林中，每千克價(jià)格高達(dá)2 000英鎊，除此品種之外，原產(chǎn)于于意大利的白松露也尤為珍稀，2007年一場(chǎng)拍賣會(huì)上，一塊重達(dá)3.3磅（約1.5 kg）的白松露以16.5萬(wàn)英鎊價(jià)格成交。

中國(guó)食用菌商務(wù)網(wǎng)

2017.09.04

Preliminary Study on Differentially Expressed Genes of Sparassis latifolia under Light Inducing

XIAO Dong-lai,ZHANG Di,MA Lu,WANG Hong-yu,LIN Yan-quan
(Institute of Edible＆Medicinal Fungi,Fujian Academy of Agricultural Sciences,Fuzhou 350014,China)

The transcriptomes of Sparassis latifolia mycelium under light or dark inducing were compared using the whole genome sequence of Sparassis latifolia as a reference.Both light and dark inducing mycelium were subjected to RNA sequencing and exposed to GO function and KEGG pathway analysis.The results showed that a total of 328 genes were identified as believable.Among them,157 genes were up-regulated and 171 genes were down-regulated.The GO classification showed that,the differentially expressed genes were mostly enriched in cellular process,metabolic process,single-organism process biological pathway and catalytic,binding,transporter molecular functions.KEGG pathway analysis showed that the differentially expressed genes were involved in biosynthesis of secondary metabolites,starch and sucrose metabolism,glutathione metabolism.

Sparassis latifolia;transcriptome;GO function analysis;differentially expressed gene

S646.9

A

1003-8310（2017）05-0060-04

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.05.014

福建省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)（2015R1020-5）；福建省自然科學(xué)基金（2016J01133）。

肖冬來(lái)（1981-），男，博士，助理研究員，主要從事食用菌栽培生理研究。E-mail:xdljiangsu@163.com

**通信作者：林衍銓（1963-），男，大專，研究員，主要從事食用菌栽培研究。E-mail:lyq-406@163.com

2017-07-13