適宜黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基及主要環(huán)境條件*

羅順珍，紀(jì)光玉，紀(jì)光燕，黃海濤，金 福，紀(jì)開(kāi)萍

（云南省景洪市宏臻農(nóng)業(yè)科技有限公司，云南 景洪 666100）

適宜黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的合成培養(yǎng)基及主要環(huán)境條件*

羅順珍，紀(jì)光玉，紀(jì)光燕，黃海濤，金 福，紀(jì)開(kāi)萍**

（云南省景洪市宏臻農(nóng)業(yè)科技有限公司，云南 景洪 666100）

在以馬鈴薯為主要成分的半人工合成培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，研究替代馬鈴薯的全合成培養(yǎng)基及主要環(huán)境條件（溫度、pH）對(duì)黑牛肝菌（Phlebopus portentosus）菌絲生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，半人工合成培養(yǎng)基去除馬鈴薯，增加尿素、硫酸銨、蛋白胨等氮源0.5 g·L-1和氧化鈣（無(wú)機(jī)鹽0.2 g·L-1）對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)有很明顯的促進(jìn)作用。主要環(huán)境條件中，適宜溫度為28℃～33℃，適宜pH為5～7。

黑牛肝菌；合成培養(yǎng)基；營(yíng)養(yǎng)需求；環(huán)境條件

黑牛肝菌 [Phlebopus portentosus（Berk.&Broome）Boedi jn.]，又名暗褐網(wǎng)柄牛肝菌，隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basi-diomycota） 傘菌綱 （Agaricomycetes） 牛肝菌目（Boletales） 小牛肝菌科（Boletinellaceae） 脈柄牛肝菌屬（Phlebopus）[1]，分布于斯里蘭卡、越南、印度尼西亞、泰國(guó)、巴西、墨西哥、澳大利亞、新西蘭等國(guó)家，國(guó)內(nèi)廣西、海南、云南等省均有分布[2-7]，其子實(shí)體味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前黑牛肝菌已實(shí)現(xiàn)人工栽培[8]，液體菌種是黑牛肝菌人工栽培及工廠化栽培的發(fā)展方向。本研究旨在用合成培養(yǎng)基代替以馬鈴薯為主要營(yíng)養(yǎng)成份的半人工培養(yǎng)基，培養(yǎng)液體菌種用于黑牛肝菌人工栽培制種，降低成本，縮短菌絲培養(yǎng)周期，提高黑牛肝菌的生產(chǎn)效益。根據(jù)何明霞等[9]暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲培養(yǎng)基的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽的篩選研究，以及以黑牛肝菌菌絲體培養(yǎng)基的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽的篩選研究中所用的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽種類及使用的量作為參考[10-12]，精細(xì)化培養(yǎng)基，以求找到代替馬鈴薯的配方，達(dá)到減小生產(chǎn)成本的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：宏臻農(nóng)業(yè)科技有限公司生產(chǎn)所用菌株HZ14080；以馬鈴薯為主要成分的半人工合成培養(yǎng)基M1；去除馬鈴薯半人工合成培養(yǎng)基M2。

1.2 方法

1.2.1 碳源實(shí)驗(yàn)

在培養(yǎng)基M2中分別添加2 g·L-1的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉，觀測(cè)不同碳源對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.2 氮源試驗(yàn)

在培養(yǎng)基M2中分別添加0.5 g·L-1的牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、氯化銨、酒石酸銨、硝酸鉀、尿素等，觀測(cè)不同氮源對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.3 無(wú)機(jī)鹽試驗(yàn)

在培養(yǎng)基M2中分別添加0.2 g·L-1的硫酸鎂、氯化鉀、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硝酸鉀、氧化鈣、碳酸鈣、氯化鈉、酒石酸鉀鈉等。觀察不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.4 溫度試驗(yàn)

以M1為菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，設(shè)置25℃、27℃、29℃、31℃、33℃五個(gè)溫度梯度，觀測(cè)不同溫度對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.5 pH試驗(yàn)

以M1為菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基，設(shè)置pH為4、5、6、7、8五個(gè)梯度的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（用0.1 mol·L-1NaOH和0.1 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH，使用pH計(jì)進(jìn)行pH測(cè)量）[10]。觀測(cè)不同pH對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響。

1.2.6 接種培養(yǎng)與數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均于平板中央接種1塊直徑7 mm的活化菌絲塊，于29℃下恒溫培養(yǎng)（溫度試驗(yàn)則在設(shè)定的恒溫下培養(yǎng)），定期（10 d、15 d、20 d、25 d、30 d）用十字交叉法[11]，測(cè)量菌落直徑；每一試驗(yàn)每一處理設(shè)3次重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對(duì)黑牛肝菌絲生長(zhǎng)的影響

碳源對(duì)黑牛肝菌絲菌絲生長(zhǎng)的影響情況見(jiàn)表1、圖1。

表1 不同碳源對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)速度及生長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.1 Effects of different carbon sources on growth rate and growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

圖1 M2培養(yǎng)基中加入不同碳源后菌絲生長(zhǎng)情況Fig.1 Growth of the Phlebopus portentosus mycelium in the M2 medium added the different carbon sources

表1和圖1結(jié)果表明，菌絲在M1培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最快0.25 cm·d-1，M2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5種不同碳源時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度反而變慢，M2中添加蔗糖、果糖、淀粉、乳糖、葡萄糖后菌絲平均每天生長(zhǎng)速度分別為 0.222 cm·d-1、0.223 cm·d-1、0.202 cm·d-1、0.222cm·d-1、0.225 cm·d-1。從圖 1 可以看出，M2 培養(yǎng)基加入不同碳源后，培養(yǎng)至第10天時(shí)不同碳源間菌絲長(zhǎng)勢(shì)差異明顯，第15天時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)相似，第20天時(shí)添加淀粉的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最差，對(duì)照M1中菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好；第20天至第30天時(shí)依然是添加淀粉的菌絲長(zhǎng)勢(shì)最差，對(duì)照M1中菌絲長(zhǎng)勢(shì)最好；添加蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖的菌絲長(zhǎng)勢(shì)雖然有浮動(dòng)，但浮動(dòng)不大。結(jié)合表1結(jié)果，得出在試驗(yàn)所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、乳糖時(shí)菌絲的生長(zhǎng)速度慢，與對(duì)照相比存在顯著差異。在試驗(yàn)中觀察到額外添加碳源的實(shí)驗(yàn)中菌絲顏色變黑，極易出現(xiàn)菌絲不長(zhǎng)和老化的現(xiàn)象。

綜合試驗(yàn)結(jié)果得出，M2培養(yǎng)基中無(wú)需再增加碳源，馬鈴薯在培養(yǎng)基M2中主要的作用并非提供碳源成分，M2培養(yǎng)基中的碳源已為最佳用量，故無(wú)需再加入其他碳源。

2.2 氮源對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基M2加入不同氮源對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響見(jiàn)表2、圖2。

表2 不同氮源對(duì)牛肝菌菌絲生長(zhǎng)速度和生長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.2 Effects of different nitrogen sources on growth rate and growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

圖2 M2培養(yǎng)基中加入不同氮源后菌絲生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth of the Phlebopus portentosus mycelium in the M2 medium added the different nitrogen sources

從圖2和表2可知，在試驗(yàn)所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加0.5 g·L-1的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、氯化銨、硫酸銨、硝酸鉀、尿素時(shí)，與對(duì)照相比，菌絲的長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于未加氮源的M2。其中尿素明顯促進(jìn)菌絲生長(zhǎng)，在加入尿素的M2培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快且最為健壯，邊緣整齊，顏色呈嫩黃色，與其他氮源處理菌絲生長(zhǎng)速度相比差異達(dá)極顯著水平。尿素是完全合成培養(yǎng)基中牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的最佳氮源，其次是酵母浸膏、硫酸銨、牛肉膏和蛋白胨。綜合結(jié)果可知，黑牛肝菌菌絲培養(yǎng)中，馬鈴薯可能提供部分的氮源成分，同時(shí)亦可以說(shuō)明無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源可以進(jìn)行復(fù)合使用，且在原有的配方上可以適量調(diào)整碳氮比。

本實(shí)驗(yàn)中，M2添加尿素促進(jìn)菌絲的生長(zhǎng)，與何明霞等[12]在氮源篩選時(shí)尿素抑制菌絲生長(zhǎng)的結(jié)論相反，有待于進(jìn)一步試驗(yàn)和驗(yàn)證。

2.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響結(jié)果見(jiàn)表3、圖3。

表3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)速度及生長(zhǎng)勢(shì)的影響Tab.3 Effects of different inorganic salts on growth rate and growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

圖3 M2培養(yǎng)基中加入不同無(wú)機(jī)鹽后菌絲生長(zhǎng)情況Fig.3 Growth of Phlebopus portentosus mycelium in M2 medium added the different inorganic salts

在M2添加9種無(wú)機(jī)鹽，均對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有抑制作用，且易出現(xiàn)菌絲老化，但添加氧化鈣或碳酸鈣時(shí)，菌絲比對(duì)照菌絲粗壯。加入磷酸二氫鉀時(shí)，對(duì)菌絲的抑制作用最為顯著。

2.4 pH對(duì)黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的影響

不同pH對(duì)黑牛肝菌菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響見(jiàn)圖4。

根據(jù)圖4可以得出，黑牛肝菌在pH4～8的范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，pH5～7為適宜的pH范圍。在此范圍內(nèi)，不同pH處理的菌絲生長(zhǎng)速度間差異不顯著，但與其他pH處理的菌絲生長(zhǎng)速度間差異達(dá)顯著或極顯著水平。pH小于8時(shí)，菌絲不僅生長(zhǎng)速度快，而且生長(zhǎng)健壯，隨著pH的升高，菌絲生長(zhǎng)速度減慢，而且細(xì)弱。pH為5時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快、最健壯，pH為8時(shí)菌絲長(zhǎng)勢(shì)最差。可以看出菌絲的長(zhǎng)勢(shì)隨pH升高，生長(zhǎng)速度減慢。不同pH對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有一定的影響，但影響不大，黑牛肝菌菌絲適宜pH范圍與褐環(huán)粘蓋牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的pH范圍相同[13]。

圖4 不同pH對(duì)黑牛肝菌菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響Fig.4 Influence of different pH value on the growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

2.5 溫度對(duì)黑牛肝菌絲生長(zhǎng)的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)黑牛肝菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響情況見(jiàn)圖5。

圖5 不同培養(yǎng)溫度對(duì)黑牛肝菌菌絲長(zhǎng)勢(shì)的影響Fig.5 NInfluence of different culture temperature on the growth potential of Phlebopus portentosus mycelium

黑牛肝菌在25℃～33℃菌絲均能生長(zhǎng)。31℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度最快，達(dá)2.46 mm·d-1，超過(guò)31℃，菌絲生長(zhǎng)速度迅速下降；在25℃菌絲生長(zhǎng)速度最慢。試驗(yàn)中黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的適宜溫度為27℃～31℃，與王文斌等[12]暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲深層發(fā)酵培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中得出牛肝菌菌絲適宜生長(zhǎng)溫度為29℃～31℃基本一致。菌絲的生長(zhǎng)速度快，有利于縮短黑牛肝菌的生長(zhǎng)周期?？s短菌絲生長(zhǎng)周期對(duì)減少生產(chǎn)成本有重大意義。

3 討論

黑牛肝菌作為優(yōu)質(zhì)珍稀食用菌，其生物學(xué)特性、遺傳育種和高產(chǎn)栽培研究在我國(guó)的報(bào)道尚不多見(jiàn)。關(guān)于牛肝菌培養(yǎng)基配方的試驗(yàn)有很多的報(bào)道，其中以何明霞等[9]黑牛肝菌菌絲體培養(yǎng)基的碳源、氮源及無(wú)機(jī)鹽的篩選研究中得出的結(jié)果重復(fù)性更強(qiáng)，更有借鑒作用。

目前食用菌大多采用半人工培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，很少有合成培養(yǎng)基的相關(guān)報(bào)道。試驗(yàn)借助于前人對(duì)牛肝菌培養(yǎng)基的研究，主要突破點(diǎn)，即找到代替馬鈴薯的物質(zhì)，得出化學(xué)成分及物質(zhì)含量的準(zhǔn)確數(shù)值，從而使生產(chǎn)及分析更方便快捷。

氮源試驗(yàn)中，在試驗(yàn)所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加適量的氮源時(shí)，如尿素、硫酸銨、蛋白胨等，對(duì)菌絲的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，且菌絲生長(zhǎng)健壯。同時(shí)在黑牛肝菌栽培中，無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源可以進(jìn)行復(fù)合使用，且在原有的配方上可以適量調(diào)整碳氮比。

研究結(jié)果表明，牛肝菌菌絲在20℃～35℃時(shí)均能生長(zhǎng)；在本試驗(yàn)中，黑牛肝菌菌絲在31℃生長(zhǎng)速度更快。菌絲生長(zhǎng)速度快有利于縮短黑牛肝菌的生長(zhǎng)周期，減少生產(chǎn)成本。

黑牛肝菌菌絲生長(zhǎng)的pH范圍為4～10，最適pH范圍為5～7。但用自來(lái)水配出的培養(yǎng)基pH為5.8左右，為簡(jiǎn)化生產(chǎn)所以不調(diào)整pH。

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Synthetic Medium and Main Environmental Conditions Suitable for Mycelium Growth of Phlebopus portentosus

LUO Shun-zhen,JI Guang-yu,JI Guang-yan,HUANG Hai-tao,JIN Fu,JI Kai-ping
(Hongzhen Agricultural Science and Technology Co.Ltd.,Jinghong 666100,China)

On the basis of half synthetic medium with potato as the main composition,the effect of whole synthetic medium and environmental conditions on mycelium growth of Phlebopus portentosus was studied.The results showed that the semi-artificial medium was used to remove the potato and increase the nitrogen sources such as urea,ammonium sulfate,peptone(0.5 g·L-1)and calcium oxide(inorganic salt 0.2 g·L-1),which had a significant effect on the mycelium growth of P.portentosus.The optimum growth temperature of P.portentosus was 28℃-33℃,pH was 5-7.

Phlebopus portentosus;synthetic medium;nutritional requirements;environmental conditions

S646.9

A

1003-8310（2017）05-0045-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.05.011

云南省科技富民強(qiáng)縣計(jì)劃（2015EB056）；西雙版納州科技三項(xiàng)費(fèi)（201504）。

羅順珍（1992-），女，本科，實(shí)習(xí)研究員，主要從事黑牛肝菌栽培研究。E-mail:515170711@qq.com

2017-07-15