小劑量肝素對小鼠淹溺肺損傷SOD、MPO活性和MDA水平的影響*

杜 斌， 朱 丹， 溫媛婷， 陳俊良， 唐篩娣， 孫潔蕓， 陳 煒， 龐慶豐△

(1. 江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院， 江蘇 無錫 214122； 2. 無錫市第三人民醫(yī)學(xué)院急診科， 江蘇 無錫 214041)

小劑量肝素對小鼠淹溺肺損傷SOD、MPO活性和MDA水平的影響*

杜 斌1， 朱 丹1， 溫媛婷1， 陳俊良1， 唐篩娣1， 孫潔蕓1， 陳 煒2， 龐慶豐1△

(1. 江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院， 江蘇 無錫 214122； 2. 無錫市第三人民醫(yī)學(xué)院急診科， 江蘇 無錫 214041)

目的探討小劑量肝素對淹溺誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。方法60只小鼠隨機(jī)分為正常組、溺亡組和小劑量肝素組，每組各20只。肝素組在游泳前30 min腹腔注射肝素0.1 U/g。將小鼠放入內(nèi)壁光滑的離心管內(nèi)置入水中讓其自由游泳建立小鼠淡水淹溺肺損傷模型。正常組小鼠采用脊椎脫臼法處死，溺亡組和小劑量肝素組溺亡小鼠溺亡9 min后，取肺組織。稱重肺組織計(jì)算肺指數(shù)及肺濕/干重比；HE染色觀察小鼠肺組織的病理變化；取肺組織檢測肺組織丙二醛(MDA)、肺組織髓過氧化物酶(MPO)，超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果與正常組相比，溺亡組小鼠肺指數(shù)增加，濕干重比 (W/D)比值增高；肺組織病理形態(tài)學(xué)炎癥明顯加重；肺組織勻漿SOD活性明顯降低，MDA含量、MPO活性升高(P<0.05,P<0.01)。與溺亡組相比，肝素組小鼠肺指數(shù)降低，濕干重比 (W/D)比值降低；肺組織病理形態(tài)學(xué)炎癥明顯減輕；肺組織勻漿SOD活性明顯升高，MDA含量、MPO活性降低(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論小劑量肝素可以發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，減輕淹溺誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。

肝素； 淹溺； 肺損傷； 小鼠

heparin; drowning; lung injury; mice

淹溺是意外死亡的重要原因之一，每年全球發(fā)生淹溺死亡約40萬人[1]。淡水淹溺對肺的損傷是多方面的。淡水進(jìn)入肺部后，肺順應(yīng)性降低，肺泡表面活性物質(zhì)被稀釋，病理學(xué)上主要表現(xiàn)為明顯的肺泡間質(zhì)水腫、肺泡壁破裂，大量蛋白與紅細(xì)胞滲出。研究發(fā)現(xiàn)，肝素具有抗炎和抗氧化、改善微循環(huán)調(diào)節(jié)凝血功能紊亂等多種作用[2, 3]，對多種原因引起的肺損傷均有較好的治療效果[4, 5]， 然而不同劑量肝素抗凝作用是否伴有出血傾向，選用小劑量肝素0.1 U/g能否治療淡水淹溺肺損傷炎癥[6]尚不得知。故本實(shí)驗(yàn)通過建立淡水淹溺肺損傷模型，觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide

dismutase, SOD)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性，探討小劑量肝素對淡水淹溺引起的急性肺損傷保護(hù)作用，為肝素臨床治療溺水患者提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

RM2135石蠟切片機(jī)(德國徠卡微系統(tǒng)有限公司)；80i正置熒光顯微鏡(日本尼康公司)； ELX800全自動酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)。MDA試劑盒(批號：20141202)、SOD試劑盒(批號：20141201)， MPO試劑盒(批號：20141128)、 考馬斯亮蘭(批號：20150109)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，肝素注射液(批號：1406112)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組

ICR 小鼠60 只，SPF 級，體質(zhì)量(20±2) g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供(合格證編號2007000564424)，許可證號碼SCXK(滬)2012-0002。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組(n=20)：正常組、溺亡組和小劑量肝素組。實(shí)驗(yàn)前一天小鼠禁食，自由飲水。肝素組在游泳前30 min腹腔注射肝素0.1 U/g[6]。

1.3 模型制備

將小鼠放入1個(gè)內(nèi)壁光滑的離心管內(nèi)(要求：離心管兩端有孔，將小鼠放置于管內(nèi)并充滿水，此步驟在充滿水的桶內(nèi)操作。水面高度與離心管上緣距離為10 cm)，讓其自由游泳并仔細(xì)觀察，其第1次嗆水時(shí)按秒表計(jì)時(shí)，直至小鼠溺死。溺死后即可將小鼠完全從水中取出，建立小鼠溺亡模型[7]。小鼠溺死指征：口唇黏膜蒼白明顯，軀干強(qiáng)直，四肢無游泳動作，頭部不能浮出水面，隨后身體逐漸下沉至容器底部，抓取時(shí)無任何反抗動作。

1.4 肺指數(shù)及肺濕/干重比 (W/D)檢測

正常組小鼠采用脊椎脫臼法處死，溺亡組和肝素組溺亡小鼠溺亡9 min后，取肺組織進(jìn)行磷酸鹽緩沖液漂洗后電子天平稱濕質(zhì)量，將肺濕質(zhì)量/小鼠體重，計(jì)算肺指數(shù)；然后將其置于75℃烤箱內(nèi)烘烤72 h至恒重后稱干質(zhì)量，計(jì)算肺組織W/D重比。

1.5 病理學(xué)檢測

將小鼠左側(cè)肺組織置于10%的中性甲醛固定液中固定24 h，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，鏡下觀察。

1.6 肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測定

取右肺下葉肺組織制成肺組織勻漿(肺組織∶生理鹽水=1∶10)，嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測MDA、SOD、MPO含量及活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺指數(shù)的變化

Drown組和Heparin組小鼠肺指數(shù)明顯高于Control組(P<0.05,P<0.01)，Heparin組小鼠肺指數(shù)低于Drown組(P<0.05, 表1)。Drown組和Heparin組小鼠肺W/D比值明顯高于Control組(P<0.05,P<0.01)，Heparin組小鼠肺W/D比值低于Drown組(P<0.05, 表1)。

2.2肝素對小鼠淹溺肺損傷的病理組織學(xué)影響

正常組肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，未見炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡無水腫。溺亡組肺組織損傷嚴(yán)重，肺泡破裂，肺間質(zhì)和肺泡水腫,肺泡壁增厚，肺組織灶性出血, 并有以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤；在給與肝素治療后，溺亡所引起的肺損傷炎癥減輕，肺泡壁雖有水腫增厚，但肺組織未見出血(圖1)。

GroupLung/bodyindexW/DratioControl0.0079±0.00075.26±0.43Drown0.0115±0.0018*7.56±1.08*Heparin0.0096±0.0009##6.45±0.64##

*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsdrown group

Fig.1Histologic changes of mice lung tissues (HE staining)

A: Control group; B: Drown group; C: Heparin group

2.3 小鼠肺組織中MDA含量、MPO、SOD活性測定

與Control組相比，Drown組和Heparin組MDA含量、MPO活力顯著升高，SOD活性顯著降低(P<0.01)；與Drown組相比，Heparin組MDA含量、MPO活力顯著降低(P<0.01)，SOD活性顯著升高(P<0.01，表2)。

GroupMPO(U/g)MDA(nmol/mg.prot)SOD(U/mg.prot)Control2.11±0.151.19±0.0885.93±2.28Drown4.23±0.20**2.15±0.09**53.18±1.76**Heparin3.76±0.11**##1.74±0.07**##56.54±2.71**##

MPO: Myeloperoxidase; MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsdrown group

3 討論

淹溺性肺損傷是一種特殊病因引起的肺部疾病。目前認(rèn)為淹溺性肺損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在淹溺性肺損傷的作用逐漸受到重視[8,9]。炎癥反應(yīng)在淹溺性肺損傷發(fā)生過程中有重要作用，有效抑制炎癥反應(yīng)有利于減輕淹溺性肺損傷[10]。小劑量肝素可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β釋放[11]。本研究發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中，與溺亡組相比，小劑量肝素組的小鼠肺組織中MPO活性降低，提示小劑量肝素能夠減輕小鼠淹溺性肺損傷的炎癥。溺水可以引起嚴(yán)重低氧血癥，氧代謝障礙必然會引起氧化應(yīng)激損傷。氧自由基可破壞表面活性物質(zhì)，又可損傷肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加微血管通透性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)溺水可引起小鼠肺組織SOD活性降低和MDA及MPO含量增高；肺指數(shù)和肺W/D比值明顯增高；肺泡破裂、肺間質(zhì)和肺泡水腫、肺泡壁增厚等病理形態(tài)學(xué)變化,而肝素治療能夠逆轉(zhuǎn)上述的異常變化和減輕肺組織損傷程度，提示小劑量肝素可以通過抗氧化機(jī)制保護(hù)小鼠淹溺性肺損傷。

綜上所述，本研究提示小劑量肝素可以通過抗炎和抗氧化作用，減輕淹溺誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。但是肝素對淹溺性肺損傷的保護(hù)作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究，且由于其抗凝作用有出血的風(fēng)險(xiǎn)，因此不同劑量肝素對于小鼠淹溺性肺損傷的影響機(jī)制以及其是否會有出血風(fēng)險(xiǎn)還有待進(jìn)一步深入研究。

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R965.1

A

1000-6834(2017)05-469-03

10.12047/j.cjap.5510.2017.112

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81270126)

2016-10-13

2017-05-19

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