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    小劑量肝素對(duì)小鼠淹溺肺損傷SOD、MPO活性和MDA水平的影響*

    2017-11-01 09:20:07溫媛婷陳俊良唐篩娣孫潔蕓龐慶豐
    關(guān)鍵詞:小鼠

    杜 斌, 朱 丹, 溫媛婷, 陳俊良, 唐篩娣, 孫潔蕓, 陳 煒, 龐慶豐△

    (1. 江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院, 江蘇 無(wú)錫 214122; 2. 無(wú)錫市第三人民醫(yī)學(xué)院急診科, 江蘇 無(wú)錫 214041)

    小劑量肝素對(duì)小鼠淹溺肺損傷SOD、MPO活性和MDA水平的影響*

    杜 斌1, 朱 丹1, 溫媛婷1, 陳俊良1, 唐篩娣1, 孫潔蕓1, 陳 煒2, 龐慶豐1△

    (1. 江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院, 江蘇 無(wú)錫 214122; 2. 無(wú)錫市第三人民醫(yī)學(xué)院急診科, 江蘇 無(wú)錫 214041)

    目的探討小劑量肝素對(duì)淹溺誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用。方法60只小鼠隨機(jī)分為正常組、溺亡組和小劑量肝素組,每組各20只。肝素組在游泳前30 min腹腔注射肝素0.1 U/g。將小鼠放入內(nèi)壁光滑的離心管內(nèi)置入水中讓其自由游泳建立小鼠淡水淹溺肺損傷模型。正常組小鼠采用脊椎脫臼法處死,溺亡組和小劑量肝素組溺亡小鼠溺亡9 min后,取肺組織。稱重肺組織計(jì)算肺指數(shù)及肺濕/干重比;HE染色觀察小鼠肺組織的病理變化;取肺組織檢測(cè)肺組織丙二醛(MDA)、肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO),超氧化物歧化酶(SOD)活性。結(jié)果與正常組相比,溺亡組小鼠肺指數(shù)增加,濕干重比 (W/D)比值增高;肺組織病理形態(tài)學(xué)炎癥明顯加重;肺組織勻漿SOD活性明顯降低,MDA含量、MPO活性升高(P<0.05,P<0.01)。與溺亡組相比,肝素組小鼠肺指數(shù)降低,濕干重比 (W/D)比值降低;肺組織病理形態(tài)學(xué)炎癥明顯減輕;肺組織勻漿SOD活性明顯升高,MDA含量、MPO活性降低(P<0.05,P<0.01)。結(jié)論小劑量肝素可以發(fā)揮抗炎和抗氧化作用,減輕淹溺誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。

    肝素; 淹溺; 肺損傷; 小鼠

    heparin; drowning; lung injury; mice

    淹溺是意外死亡的重要原因之一,每年全球發(fā)生淹溺死亡約40萬(wàn)人[1]。淡水淹溺對(duì)肺的損傷是多方面的。淡水進(jìn)入肺部后,肺順應(yīng)性降低,肺泡表面活性物質(zhì)被稀釋,病理學(xué)上主要表現(xiàn)為明顯的肺泡間質(zhì)水腫、肺泡壁破裂,大量蛋白與紅細(xì)胞滲出。研究發(fā)現(xiàn),肝素具有抗炎和抗氧化、改善微循環(huán)調(diào)節(jié)凝血功能紊亂等多種作用[2, 3],對(duì)多種原因引起的肺損傷均有較好的治療效果[4, 5], 然而不同劑量肝素抗凝作用是否伴有出血傾向,選用小劑量肝素0.1 U/g能否治療淡水淹溺肺損傷炎癥[6]尚不得知。故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立淡水淹溺肺損傷模型,觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide

    dismutase, SOD)、髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)活性,探討小劑量肝素對(duì)淡水淹溺引起的急性肺損傷保護(hù)作用,為肝素臨床治療溺水患者提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    RM2135石蠟切片機(jī)(德國(guó)徠卡微系統(tǒng)有限公司);80i正置熒光顯微鏡(日本尼康公司); ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)。MDA試劑盒(批號(hào):20141202)、SOD試劑盒(批號(hào):20141201), MPO試劑盒(批號(hào):20141128)、 考馬斯亮蘭(批號(hào):20150109)試劑盒(南京建成生物工程研究所),肝素注射液(批號(hào):1406112),其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

    1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

    ICR 小鼠60 只,SPF 級(jí),體質(zhì)量(20±2) g,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(合格證編號(hào)2007000564424),許可證號(hào)碼SCXK(滬)2012-0002。將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為3組(n=20):正常組、溺亡組和小劑量肝素組。實(shí)驗(yàn)前一天小鼠禁食,自由飲水。肝素組在游泳前30 min腹腔注射肝素0.1 U/g[6]。

    1.3 模型制備

    將小鼠放入1個(gè)內(nèi)壁光滑的離心管內(nèi)(要求:離心管兩端有孔,將小鼠放置于管內(nèi)并充滿水,此步驟在充滿水的桶內(nèi)操作。水面高度與離心管上緣距離為10 cm),讓其自由游泳并仔細(xì)觀察,其第1次嗆水時(shí)按秒表計(jì)時(shí),直至小鼠溺死。溺死后即可將小鼠完全從水中取出,建立小鼠溺亡模型[7]。小鼠溺死指征:口唇黏膜蒼白明顯,軀干強(qiáng)直,四肢無(wú)游泳動(dòng)作,頭部不能浮出水面,隨后身體逐漸下沉至容器底部,抓取時(shí)無(wú)任何反抗動(dòng)作。

    1.4 肺指數(shù)及肺濕/干重比 (W/D)檢測(cè)

    正常組小鼠采用脊椎脫臼法處死,溺亡組和肝素組溺亡小鼠溺亡9 min后,取肺組織進(jìn)行磷酸鹽緩沖液漂洗后電子天平稱濕質(zhì)量,將肺濕質(zhì)量/小鼠體重,計(jì)算肺指數(shù);然后將其置于75℃烤箱內(nèi)烘烤72 h至恒重后稱干質(zhì)量,計(jì)算肺組織W/D重比。

    1.5 病理學(xué)檢測(cè)

    將小鼠左側(cè)肺組織置于10%的中性甲醛固定液中固定24 h,石蠟包埋,4 μm切片,HE染色,鏡下觀察。

    1.6 肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定

    取右肺下葉肺組織制成肺組織勻漿(肺組織∶生理鹽水=1∶10),嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)MDA、SOD、MPO含量及活性。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    2 結(jié)果

    2.1 各組小鼠肺指數(shù)的變化

    Drown組和Heparin組小鼠肺指數(shù)明顯高于Control組(P<0.05,P<0.01),Heparin組小鼠肺指數(shù)低于Drown組(P<0.05, 表1)。Drown組和Heparin組小鼠肺W/D比值明顯高于Control組(P<0.05,P<0.01),Heparin組小鼠肺W/D比值低于Drown組(P<0.05, 表1)。

    2.2肝素對(duì)小鼠淹溺肺損傷的病理組織學(xué)影響

    正常組肺組織結(jié)構(gòu)完整,肺泡腔清晰,未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),肺泡無(wú)水腫。溺亡組肺組織損傷嚴(yán)重,肺泡破裂,肺間質(zhì)和肺泡水腫,肺泡壁增厚,肺組織灶性出血, 并有以中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn);在給與肝素治療后,溺亡所引起的肺損傷炎癥減輕,肺泡壁雖有水腫增厚,但肺組織未見出血(圖1)。

    GroupLung/bodyindexW/DratioControl0.0079±0.00075.26±0.43Drown0.0115±0.0018*7.56±1.08*Heparin0.0096±0.0009##6.45±0.64##

    *P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsdrown group

    Fig.1Histologic changes of mice lung tissues (HE staining)

    A: Control group; B: Drown group; C: Heparin group

    2.3 小鼠肺組織中MDA含量、MPO、SOD活性測(cè)定

    與Control組相比,Drown組和Heparin組MDA含量、MPO活力顯著升高,SOD活性顯著降低(P<0.01);與Drown組相比,Heparin組MDA含量、MPO活力顯著降低(P<0.01),SOD活性顯著升高(P<0.01,表2)。

    GroupMPO(U/g)MDA(nmol/mg.prot)SOD(U/mg.prot)Control2.11±0.151.19±0.0885.93±2.28Drown4.23±0.20**2.15±0.09**53.18±1.76**Heparin3.76±0.11**##1.74±0.07**##56.54±2.71**##

    MPO: Myeloperoxidase; MDA: Malondialdehyde; SOD: Superoxide dismutase

    **P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsdrown group

    3 討論

    淹溺性肺損傷是一種特殊病因引起的肺部疾病。目前認(rèn)為淹溺性肺損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程,炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激在淹溺性肺損傷的作用逐漸受到重視[8,9]。炎癥反應(yīng)在淹溺性肺損傷發(fā)生過(guò)程中有重要作用,有效抑制炎癥反應(yīng)有利于減輕淹溺性肺損傷[10]。小劑量肝素可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β釋放[11]。本研究發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)中,與溺亡組相比,小劑量肝素組的小鼠肺組織中MPO活性降低,提示小劑量肝素能夠減輕小鼠淹溺性肺損傷的炎癥。溺水可以引起嚴(yán)重低氧血癥,氧代謝障礙必然會(huì)引起氧化應(yīng)激損傷。氧自由基可破壞表面活性物質(zhì),又可損傷肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,增加微血管通透性[12]。本研究發(fā)現(xiàn)溺水可引起小鼠肺組織SOD活性降低和MDA及MPO含量增高;肺指數(shù)和肺W/D比值明顯增高;肺泡破裂、肺間質(zhì)和肺泡水腫、肺泡壁增厚等病理形態(tài)學(xué)變化,而肝素治療能夠逆轉(zhuǎn)上述的異常變化和減輕肺組織損傷程度,提示小劑量肝素可以通過(guò)抗氧化機(jī)制保護(hù)小鼠淹溺性肺損傷。

    綜上所述,本研究提示小劑量肝素可以通過(guò)抗炎和抗氧化作用,減輕淹溺誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。但是肝素對(duì)淹溺性肺損傷的保護(hù)作用的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究,且由于其抗凝作用有出血的風(fēng)險(xiǎn),因此不同劑量肝素對(duì)于小鼠淹溺性肺損傷的影響機(jī)制以及其是否會(huì)有出血風(fēng)險(xiǎn)還有待進(jìn)一步深入研究。

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    R965.1

    A

    1000-6834(2017)05-469-03

    10.12047/j.cjap.5510.2017.112

    國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81270126)

    2016-10-13

    2017-05-19

    Tel: 0510-85917007; E-mail: qfpang@jiangnan.edu.cn

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